Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebende atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten aus genetisch veränderten Mäusen zu gewinnen, um sie für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen und andere Experimente zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Herz eines anästhesierten Tieres sorgfältig, aber rasch exzidiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das exzidierte und kaniulierte Herz an die LOR-Vorrichtung anzuschließen.

Anschließend wird das Herz retrograd mit einer Kollagenase-Lösung perfundiert, um das Bindegewebe aufzulösen. Im letzten Schritt wird das Gewebe durch vorsichtiges Auseinanderziehen mit feiner Pinzette dissoziiert und die Zellen mit einer verbreiterten, feuerpolierten Plastikpipettenspitze suspendiert. Danach werden die Zellen schrittweise mit einer kalziumreichen Lösung resuspendiert. Abschließend wird mithilfe der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik der Unterschied in den spannungsabhängigen Kaliumkanalströmen gezeigt.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Sie eine gute Menge an HL- und ventrikulären Kardiomyozyten mit guten Eigenschaften für weitere Experimente erhalten. In der Regel haben Wissenschaftler, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da viel Übung erforderlich ist, um dieses Verfahren präzise durchzuführen und wirklich gute Ergebnisse zu erzielen. Ich überprüfe nach der Injektion der Anästhetika und von 250 IE Heparin, ob die Maus tief anästhesiert ist, indem ich den Schwanz kneife, um die Fluchtreflexe zu prüfen.

Überführen Sie danach die Maus in Rückenlage auf den Operationstisch. Anschließend erfolgt ein Haut- und Bauchwandinzision unterhalb des Xiphoids, um eine Clamshell-Thorakotomie durchzuführen.

Verlängern Sie den Schnitt beidseits entlang des Rippenbogens. Schneiden Sie anschließend die Rippen in der mittelaxillären Linie durch und klappen Sie den Rippenkorb nach oben ab. Öffnen Sie danach das Perikard und lokalisieren Sie die großen Gefäße.

Drücken Sie vorsichtig auf das Herzkörbchen, um die Aorta besser darzustellen. Klemmen Sie anschließend die Aorta mit einer Pinzette. Heben Sie das Herz vorsichtig an und platzieren Sie eine Schere unter das Herz, um alle verbindenden Gefäße mit einem einzigen Schnitt zu präparieren.

Stellen Sie sicher, dass ein ausreichend großes Stück der aufsteigenden Aorta für die Kanülierung mit der Lor-Kanüle erhalten bleibt. Anschließend das entfernte Herz unverzüglich in eine mit Eis gefüllte Petrischale mit kalter, vorgewärmter Lösung One überführen. Kanülieren Sie in diesem Verfahren die Aorta mit einer 1,8-French-Stahlkanüle und achten Sie darauf, eine Luftembolie zu vermeiden.

Befestigen Sie anschließend die Aorta mit einem chirurgischen Faden an der Kanüle. Danach spülen Sie die Koronararterien mit einem Milliliter Lösung Eins. Verbinden Sie die Kanüle mit einer Langendorff-Apparatur, um eine verlängerte Ischämie-Reperfusionsschädigung des Myokards zu vermeiden.

Stellen Sie sicher, dass die Verfahren von der Thorakotomie bis zur Lendorf-Kanülierung innerhalb von 120 Sekunden durchgeführt werden. Danach, nachdem die Wärmespule des Lendorf-Systems mit kalziumfreier Lösung vorgefüllt wurde, perfundieren Sie das Herz mit 10 Milliliter dieser Lösung bei vier Milliliter pro Minute.

Anschließend das Herz mit Kollagenase-Lösung perfundieren. Drei Mal acht Minuten lang mit vier Millilitern pro Minute. Danach das Herz in eine vorgewärmte 100-Millimeter-Petrischale mit kalziumarmer Lösung überführen. Vier.

Entfernen Sie vorsichtig die Aorta und anderes nicht-kardiales Gewebe mit einer Schere. Trennen Sie anschließend die Vorhöfe von den Ventrikeln und halten Sie das Vorhof- und Ventrikulargewebe in einer kleinen Menge Lösung untergetaucht. Vier. Um die Vorhof-Kardiomyozyten zu isolieren, überführen Sie die Vorhöfe in eine separate vorgewärmte 100-Millimeter-Kulturschale.

Lösen Sie das Gewebe, indem Sie es vorsichtig mit feinen Pinzetten auseinanderziehen, und stellen Sie sicher, dass das Gewebe nahezu vollständig dissoziiert ist. Verwenden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Pipette mit einer vergrößerten, feuerpolierten Kunststoffpipettenspitze, um die Zellen in einem Milliliter Lösung zu suspendieren. Vier für atriale Zellen und fünf Milliliter Lösung.

Vier für ventrikuläre Zellen für fünf Minuten. Danach die Zellen mithilfe eines Zellfilters mit einer Maschenweite von 200 Mikron von dem Zelltrümmer trennen. Die Zellen in Lösung vier bei Raumtemperatur für atriale Zellen eine Minute lang und für ventrikuläre Zellen zwei Minuten lang bei 16 × g in einer Zellkulturbank zentrifugieren, das Überstand verwerfen und das Pellet in fünf Milliliter Lösung resuspendieren.

Fünf für die Vorhofzellen und etwa 20 bis 25 Milliliter. Für die Ventrikelzellen vorsichtig das Gefäß schütteln, um das Zellpellet aufzulösen, und danach erneut eine Minute bei Raumtemperatur mit 16 × g zentrifugieren. Nach der zweiten Zentrifugation erneut den Überstand verwerfen und das Pellet in fünf Milliliter Lösung resuspendieren. Sechs für die Vorhofzellen und etwa 20 bis 25 Milliliter für die Ventrikelzellen.

Anschließend lässt man die Zellen 10 Minuten lang sedimentieren. In einer Zellkulturhaube entfernt man den Überstand und zählt danach die Zellen. Für elektrophysiologische Untersuchungen gibt man 25 bis 50 Milliliter Lösung sechs zu den Zellen für elektrophysiologische Untersuchungen.

Die Kardiomyozyten in Lösung sechs in einem 50-Milliliter-Röhrchen aufbewahren und Sedimentation verhindern. Für die immunfluoreszenzchemische Färbung. Eine Zellkulturschale mit Glasdeckgläsern vorbereiten, die mit Laminin-Lösung in einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter beschichtet sind.

Laminin in PBS: die Zellkulturschale zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Laminin-Lösung entfernen. Vor dem Ansäen der Myozyten unter dem Mikroskop die Zellen ansäen und die Zelldichte kontrollieren.

Lassen Sie die Myozyten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in 2 % CO2 an der Deckglasoberfläche adhärieren. Nach einer Stunde entfernen Sie die Lösung und beginnen Sie unmittelbar mit dem standardmäßigen Färbeprotokoll. Anschließend inkubieren Sie die Myozyten mit Fixansatz.

Beispielsweise 4 % PFA in PBS bei pH 7,5 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend drei Waschschritte mit PBS je fünf Minuten, um die Zellen zu permeabilisieren und unspezifische Antikörperbindung zu hemmen. Inkubieren Sie die Myozyten mit 10 % Serum, 0,3 % Triton, 0,2 % BSA in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Anschließend inkubieren Sie sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit dem primären Antikörper und waschen Sie wie zuvor beschrieben. Danach erfolgt die Inkubation mit dem sekundären Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur, um die Kerne und Alpha-Aktinin gegenanzufärben. Inkubieren Sie den sekundären Antikörper eine Stunde bei Raumtemperatur mit DPI und fluorochromkonjugiertem Phin.

Nach dem Waschen übertragen Sie die Glasdeckgläser vorsichtig auf die mit Salzlösung behandelten Objektträger. Anschließend werden die Zellen in das Fluoreszenz-Einbettmedium für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen eingebettet. Überführen Sie die gesund erscheinenden Kardiomyozyten in die Perfusionskammer, die mit einem definierten Volumen an extrazellulärer Badlösung gefüllt ist.

Verwenden Sie die geeignete Patch-Clamp-Ausrüstung und Patch-Pipetten mit einem Widerstand von drei bis fünf Megaohm, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt sind. Für Standard-Patch-Clamp-Aufnahmen, nachdem eine Zelle gepatcht wurde und eine Gigaseal hergestellt wurde, messen Sie die Kaliumströme mithilfe eines Standardprotokolls, indem Sie die nach außen gerichteten Kaliumströme mit 4,5 Sekunden dauernden Spannungssprüngen von −60 Millivolt auf 50 Millivolt in 10-Millivolt-Schritten hervorrufen. Achten Sie darauf, dass Leckströme stets kleiner als 100 Pikroampere sind.

Um verschiedene Kaliumströme zu differenzieren, verwenden Sie spezifische Inhibitoren wie Four-Amino-Paridin, Hetero-Potto, Toxin oder Tetraethylammonium. Die Stammlösungen sollten in extrazellulärer Badlösung hergestellt und direkt über eine Mikrospitze in die möglichst unmittelbare Nähe der Zelle appliziert werden. Nach den Basislinienaufnahmen.

Es sollte eine Equilibrierung von zwei bis drei Minuten erfolgen, bevor nach der Applikation des Wirkstoffs mit den Aufnahmen begonnen wird. Abschließend analysieren Sie die Daten offline mithilfe der P-Clamp-10.3-Software oder einer vergleichbaren Software. Diese Abbildung zeigt einen exemplarischen ventrikulären Kardiomyozyten, der mit DPI und LOR 4 88 Phin gefärbt wurde. Hier sind die exemplarischen Spuren der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme.

Diese Abbildung zeigt ein exemplarisches atriales Kardiomyozyt, das mit DPI und einem Fluorochrom-markierten Phalloidin gefärbt wurde. Und hier sind die beispielhaften Spuren der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in mehr oder weniger als anderthalb Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten von genetisch veränderten Mäusen isoliert.