Name: Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Lernen Sie die Beschriftung einzelner Neuronen im zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Morphologie mittels Konfokalmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der DFG GMT unterstützt

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
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<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
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<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
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<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Ein großer Vorteil von Drosophila als Modellsystem ist, dass sie eine Analyse der Entwicklung und Funktion auf der Ebene einzelner Zellen ermöglicht. Dies ist besonders hilfreich in Bezug auf das Nervensystem, wo die Vielfalt von Zelltypen ist außergewöhnlich hoch und die Funktion und Morphologie der benachbarten Zellen können ganz anders sein. Das Verfahren wir hier ermöglicht die Etikettierung von einzelnen Neuronen mit einem Farbstoff, der entweder in eine dauerhafte Färbung oder...

Wissen über neuronale Morphologie auf der Ebene der einzelnen Zellen ist eine wichtige Voraussetzung für das Verständnis neuronaler Verschaltungen und ZNS-Funktion. So wird aus den frühesten Tagen der Neurowissenschaften haben Forscher versucht, einzelne Zelle Kennzeichnung Techniken (siehe 7 für eine historische Aufarbeitung dieser Ausgabe) zu entwickeln. Klassische Methoden wie Golgi-Färbung eine ausgezeichnete Auflösung von neuronale Morphologie jedoch nicht geeignet sind, wenn man eine bestimmte Art von Neuronen in einer gerichteten Weise gekennzeichnet werden, wie Färbung erfolgt in einer zufälligen Weise sucht. Die Entwicklung von Verfahren zum Anfärben einzelner Zellen durch intrazelluläre oder juxtacellular Injektion von Farbstoffen von einer Mikroelektrode adressiert die Anforderung der spezifischen Markierung. Die Anwendung der einzelnen Neurons Farbstoffinjektion zu Drosophila eine große Herausforderung, wegen der geringen Größe der sowohl dem Organismus und seiner Neuronen. Dennoch einzelnen Neurons Färbung von embryonalen Drosophila </em&gt; Neuronen wurde Mitte der 1980er-Jahre im Labor von Corey Goodman 15 erreicht. Während das Verfahren war eminent nützlich und hat einige wichtige Einblicke in Mechanismen für die neuronale Entwicklung in Drosophila in den letzten 20-30 Jahren (z. B. 2, 10), haben viele Arbeitnehmer davon entfernt gescheut, vor allem wegen seiner technischen Anforderungen. Die Verfügbarkeit in den letzten Jahren der genetischen Techniken zur neuronalen Kennzeichnung in Drosophila wurde auch auf die Unbeliebtheit des einzelnen Neurons Farbstoffinjektion beigetragen. GAL4-gerichtete Expression von Membran-gezielte GFP-Konstrukte können eine hervorragende Auflösung von neuronalen Morphologie 1, 20. Allerdings hat diese Methode bestimmte Einschränkungen: die oft unvermeidlichen Expression von GFP in mehrere Zellen können die Struktur der einzelnen Neuronen zu verschleiern und eine GAL4 Fahrerpaarung möglicherweise nicht zur Verfügung, um die Expression in einem bestimmten Neuron von Interesse zu fahren. Die marcm (Mosaic Analyse mit einem Repressible Zellmarker) Methode 8 bieten kann Etikettieren von im Wesentlichen jedem Neuron in der einzelnen Zelle Ebene, aber nicht erfolgreich im Embryo und frühe Larve wegen der langsamen Umsatz des GAL80-Proteins verwendet werden. Angesichts dieser Einschränkungen der genetischen Kennzeichnung, glauben wir, dass einzelne Neuron Farbstoff Injektion in den Drosophila-Embryo bleibt eine wertvolle Technik und verdient eine breitere Anwendung. Um dieses Ziel zu fördern, geben wir hier eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens. Eine Abbildung der Leistung wird durch unsere jüngsten Berücksichtigung der Morphologie des kompletten Satz von Interneuronen abdominalen Neuromeren des späten Drosophila-Embryo 14 vorgesehen. Diese Studie, die sowohl die morphologische Variabilität der einzelnen neuronalen Zelltypen und die Prinzipien der Neuromer Organisation im ZNS des Embryos zeigten, wären nicht mit irgendeinem anderen aktuell verfügbaren Markierungsverfahren möglich gewesen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENZIEN </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank">D-5905</a> </td><td> 2-3 mg / ml in 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank">D-282</a> </td><td> 1 mg / ml in Ethanol </td></tr><tr><td> <a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydloesung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWpOEfVhTl" target="_blank">Formaldehyd</a> </td><td> Merck Millipore </td><td></td><td> 7,4% in PBS </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Glycerol </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 3783 </td><td> 70% in PBS </td></tr><tr><td> Heptan Kleber </td><td> Beiersdorf AG </td><td> Cello 31-39-30 * </td><td> verdünnen ca. 1-1 mit n-Heptan </td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 1x </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> <a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank">Roth</a> </td><td> 4855 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> <a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank">H1000</a> </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Leica </td><td> TCS SP2 </td><td> zu sehen und zu dokumentieren Beschriftungen in der Fluoreszenz </td></tr><tr><td> DC - amplifier </td><td> Dragan Konzern </td><td> Cornerstone ION-100 </td><td> die Markierungen durchzuführen </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB018018A1 </td><td> 18 x 18 mm </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> <a href="http://www.menzel.de/" target="_blank">Menzel</a> </td><td> BB024060A1 </td><td> 24 x 60 mm </td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Leica </td><td> MZ8 </td><td> vorzubereiten und disect Embryonen </td></tr><tr><td> Flache Kapillaren </td><td> <a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank">Hilgenberg</a> </td><td></td><td> Außendurchmesser 1 mm; Glas Dicke 0,1 mm </td></tr><tr><td> Injektionskapillaren </td><td> Science Products </td><td> GB 100 TF 8P </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator R </td><td> Leica </td><td></td><td> die Markierungen durchzuführen </td></tr><tr><td> Modell P-97 </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> Kapillaren ziehen </td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> <a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank">Marienfeld Superior</a> </td><td> 1000000 </td><td></td></tr><tr><td> Scientific Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 2 mot </td><td> um Markierungen nach Photokonversion anzeigen </td></tr><tr><td> Scientific Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX50 </td><td> die Markierungen durchzuführen </td></tr><tr><td> Sony MC3255 Video Camera </td><td> Sony / AVT Horn </td><td> Sony MC3255 </td><td> um Markierungen nach Photokonversion aufzeichnen </td></tr></tbody></table> Tabelle 1.

beschriften einzelner zellen im zentralen nervensystem<em&gt; drosophila melanogaster</em

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie individuell beschriften Neuronen in den embryonalen ZNS von Drosophila melanogaster durch juxtacellular Injektion des lipophilen fluoreszierende Membran Marker DiI. Diese Methode erlaubt die Visualisierung von neuronalen Zellmorphologie im Detail. Es ist möglich, eine beliebige Zelle im ZNS kennzeichnen: Zellkörper Zielneuronen stehen unter DIC Optik oder durch Expression eines fluoreszierenden genetischen Marker wie GFP visualisiert. Nach der Markierung kann die DiI in einen permanenten braunen Fleck von Photokonversion umgewandelt werden zur Visualisierung der Zellmorphologie mit Durchlicht-und DIC-Optik ermöglichen. Alternativ können die DiI-markierten Zellen direkt mit konfokale Mikroskopie beobachtet werden, wodurch gentechnisch eingeführte fluoreszierenden Reporter-Proteine ​​zu colocalised werden. Die Technik kann bei einem Tier verwendet werden, unabhängig von Genotyp, die es ermöglichen, bei Mutantenphänotypen Einzelzelle Auflösung zu analysieren.

Abbildung 4 zeigt typische Ergebnisse der Technik beschreiben wir hier. 4A zeigt ein Beispiel für eine DiI gefüllt einzelnen Interneuronen, die sauber lichtinduziert wurde. Es schön zeigt die Menge der Details dieser Präparate Angebot. Wenn unter DIC Optik angesehen der räumliche Kontext der markierten Zelle innerhalb der nicht-markierten umgebende Gewebe sichtbar wird, z. B. die Position der Zelle innerhalb des Körpers Cortex und der Faser Vorsprung innerhalb des Neuropil. </p...

Wir stellen eine Technik zur Markierung von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen, die die Analyse der neuronalen Morphologie entweder Durchlicht oder konfokalen Mikroskopie ermöglicht.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Neuronen im Zentralnervensystem von Drosophila-Embryonen im Frühstadium 17 zu markieren. Dies wird erreicht, indem man Eier sammelt und ihnen erlaubt, sich bis zum richtigen Stadium zu entwickeln. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Eier manuell zu chlorieren und auszurichten.Dieser Diva folgend, wird durch die Besiedlung und Filetierung der Embryonen der Nervenstrang zugänglich. Der letzte Schritt ist die Markierung einzelner Zellen durch ionoretische Applikation des lipophilen Matrizenauges. Letztendlich ermöglichen die Ergebnisse die Visualisierung der Morphologie einzelner Neuronen, wenn gewünscht, im Kontext bekannter GFP-Expressionsmuster und/oder im mutierten Hintergrund.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Einzelzellmarkierungsmethoden wie Markum besteht darin, dass sie im Embryo funktioniert und es ermöglicht, identifizierte Zellen absichtlich sichtbar zu machen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist äußerst hilfreich, da viele Schritte heikel und daher schwer zu erlernen sind. Lassen Sie gesunde Fliegen Embryonen auf Agarplatten legen.Wechseln Sie die Platte alle eineinhalb

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In diesem Artikel werden wir zeigen, wie das zentrale Nervensystem aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Um zu verstehen, wie komplex Zelle Formen, wie neuronalen Dendriten, während der Entwicklung erreicht werden, ist es wichtig, in der Lage sein, genau Assay Mikrotubuli Organisation. Hier beschreiben wir eine robuste immunhistologische Markierung Methode, um Mikrotubuli Organisation von dendritischen Verzweigung Neuron sensorischen Dendriten, Luftröhre, Muskeln zu untersuchen, und...

Immunhistologische Markierung von Mikrotubuli in Sensory Neuron Dendriten, Tracheen und Muskeln in der Drosophila Larva Körperwand

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eines transgenen Drosophila-Gehirns für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen. Das Gehirn exprimiert membrangesteuerte Proteine, die mit verschiedenen Kombinationen von antigenen Epitopen unter der Kontrolle eines glialspezifischen Rekombinasesystems fusioniert sind. Die isolierten und fixierten Gehirne werden mit primären Antikörpern gefärbt, die spezifisch für die antigenen Epitope sind, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern.

Immunfluoreszenzfärbung von Drosophila-Gehirnen für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen

Quelle: Inal, M. A. et. al., Retrograde Verfolgung von Drosophila embryonalen Motoneuronen unter Verwendung lipophiler fluoreszierender Farbstoffe. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die Methode der retrograden Markierung von Drosophila Motoneuronen unter Verwendung lipophiler Farbstoffe. Der Farbstoff dringt in das Axon ein, wandert rückwärts und markiert die Neuronen grün, was eine detaillierte Visualisierung ihrer Morphologie und Projektionen unter einem konfokalen Mikroskop ermöglicht.

Retrograde Markierung von Drosophila-Motoneuronen mit fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

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