Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne Neuronen im Zentralnervensystem von Drosophila-Embryonen im Frühstadium 17 zu markieren. Dies wird erreicht, indem man Eier sammelt und ihnen erlaubt, sich bis zum richtigen Stadium zu entwickeln. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Eier manuell zu chlorieren und auszurichten.

Dieser Diva folgend, wird durch die Besiedlung und Filetierung der Embryonen der Nervenstrang zugänglich. Der letzte Schritt ist die Markierung einzelner Zellen durch ionoretische Applikation des lipophilen Matrizenauges. Letztendlich ermöglichen die Ergebnisse die Visualisierung der Morphologie einzelner Neuronen, wenn gewünscht, im Kontext bekannter GFP-Expressionsmuster und/oder im mutierten Hintergrund.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Einzelzellmarkierungsmethoden wie Markum besteht darin, dass sie im Embryo funktioniert und es ermöglicht, identifizierte Zellen absichtlich sichtbar zu machen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist äußerst hilfreich, da viele Schritte heikel und daher schwer zu erlernen sind. Lassen Sie gesunde Fliegen Embryonen auf Agarplatten legen.

Wechseln Sie die Platte alle eineinhalb Stunden bei 25 Grad Celsius und bewahren Sie die Embryonen auf. Inkubieren Sie die Embryonen auf ihren Platten bei 25 oder 18 Grad Celsius, bis sie das erforderliche Entwicklungsstadium erreicht haben. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie die Embryonen auf einen Objektträger, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist.

Vermeiden Sie es, Agar mit den Embryonen zu übertragen, da dies die Haftung auf dem Band beeinträchtigt. Auf dem Band. Lassen Sie die Embryonen fünf bis 10 Minuten trocknen, während Sie warten.

Beschichten Sie ein 24 Millimeter x 60 Millimeter großes Deckglas mit Heptankleber. Geben Sie einen kleinen Tropfen Kleber in die Mitte des Objektträgers und verteilen Sie ihn mit einem 18 Millimeter großen quadratischen Deckglas zu einer sehr dünnen Folie. Sobald die Embryonen getrocknet sind, berühren Sie sie vorsichtig mit einer Nadel.

Die Zelle spaltet auf und der Embryo klebt an der Nadel. Übertragen Sie die entchlorten Embryonen sofort in einen Agarblock, um ein Austrocknen zu verhindern. Richten Sie sie dort 10 in einer Reihe mit der Bauchseite nach oben aus.

Schneide den überschüssigen Agar mit einem Skalpell vom Block ab. Berühren Sie dann die Embryonen vorsichtig mit dem mit Heptan verklebten Deckglas. Sie sollten mit der Bauchseite nach unten auf dem Deckglas haften.

Kleben Sie einen Rahmen aus Klebeband um das Deckglas und befestigen Sie es an einem Objektträger. Halten Sie die Embryonen auf dem Deckglas. Bedecken Sie die Embryonen mit großzügigen Mengen PBS auf der dorsalen Seite jedes Embryos in der Nähe seines hinteren Endes.

Dringen Sie mit einer Glasnadel in die Vitelmembran ein, reißen Sie die Membran entlang der dorsalen Mittellinie auf und ziehen Sie den Embryo aus der Membran heraus. Richten Sie nun den Embryo mit der Bauchseite nach unten an einer anderen Stelle auf dem Heptanleimsubstrat neu aus. Feilen Sie den Embryo mit einer Glasnadel, indem Sie die Körperwand vorsichtig perforieren und entlang der dorsalen Mittellinie reißen.

Drücken Sie mit der Nadel die Körperwand nach unten, so dass sie an der Rutsche haftet. Reißen Sie den Darm an den vorderen und hinteren Enden durch und heben Sie den Darm weg. Da mehrere Embryonen auf demselben Objektträger abgelegt werden, ist es hilfreich, entweder sehr genau zu orientieren oder eine Zeichnung ihrer Ausrichtung anzufertigen.

Als nächstes können die Embryonen 10 bis 15 Minuten lang leicht in 7,4% Formaldehyd in PBS fixiert werden, gefolgt von vier Wäschen in PBS. Dabei ist äußerste Vorsicht geboten, um zu vermeiden, dass die Embryonen die Oberfläche der Lösung berühren. Die Oberflächenspannungskräfte zerstören sie unter einem 10-fach-Objektiv. Zentrieren Sie das Sichtfeld auf einem präparierten Embryo, erhöhen Sie die Vergrößerung und lokalisieren Sie die interessierende Zelle unter DIC-Optik oder unter Fluoreszenz.

Wenn die Zielzelle GFP exprimiert, stellen Sie sicher, dass die Feldblende des Mikroskops nur bis zum Rand des Sichtfelds geöffnet ist und nicht über eine schmale Beleuchtung hinaus. Der Strahl hilft bei der Positionierung der Mikropipette, wechselt zurück zum 10-fach-Objektiv und platziert die Badelektrode für den Gleichstromverstärker in der Lösung, die weit vom Embryo und dem Weg der Mikropipette entfernt ist. Montieren Sie die mit Lithiumchloridlösung gefüllte Injektionsmikropipette auf den Halter und befestigen Sie sie am Mikromanipulator.

Mit den Kurssteuerungen wird die Mikropipette unterhalb des Objektivs und weit über dem Embryo positioniert. Ist der Winkel des Micro Peppe zu steil, wird die Spitze nicht scharf. Wenn er zu flach ist, verschmutzt der Schacht an der Wannenwand, die Spitze im Sichtfeld zentriert.

Senken Sie nun die Mikropipette ab und fokussieren Sie abwechselnd, bis sich die Pipette im PBS befindet und nicht zu weit über dem Embryo. Wechseln Sie nun zum Hochleistungsobjektiv und zentrieren Sie die Pipette innerhalb des Sichtfeldes. Wenn der Schaft scharf gestellt ist, bewegen Sie die Mikropipette in der X-Achse, bis ihre Spitze in der Mitte des Sichtfelds liegt.

Die Spitze der Mikropipette sollte sich deutlich über der Höhe des Embryos befinden. Schalten Sie auf Fluoreszenzbeleuchtung um und untersuchen Sie die Spitze. Prüfen Sie, ob das Färbeauge ausläuft.

Stellen Sie den Gleichstrom so ein, dass sich an der Spitze kein Farbstoffaugenkristall ansammelt. Senken Sie nun die Mikropipette in der Z-Achse in Richtung Embryo ab. Schrittweise Anpassung des Fokus, wenn der Embryo in den Fokus kommt.

Wechseln Sie zur Verwendung der Feinsteuerung. Fokussieren Sie die zu injizierende Zelle in der Mitte des Feldes und fokussieren Sie dann erneut auf die Mikropipettenspitze. Von diesem Zeitpunkt an kann es bequemer sein, den Embryo mit der Tischsteuerung des Mikroskops relativ zur Mikropipette zu bewegen.

Bringen Sie die Mikropipetspitze in Kontakt mit der Zelle und machen Sie eine Vertiefung auf ihrer Oberfläche. Lassen Sie einige Sekunden lang mehrere Nanoampere depolarisierenden Strom durch. Auf der Zelle bildet sich ein kleiner Kristall aus Farbstoffauge, um zu bestätigen, dass die Zelle markiert wurde.

Öffnen Sie kurz die Blende, um das Feld mit Leuchtstoffröhren zu beleuchten. Wenn der Körper der Zelle Anzeichen von Markierungen aufweist, wenden Sie noch einige Sekunden lang Strom an. Schalten Sie dann den Strom aus und ziehen Sie den Embryo mit den Tischreglern schnell von der Mikropipette weg.

Wenn keine D-Augen-Markierung erkennbar war, war die Mikropipette möglicherweise verstopft und muss ausgetauscht werden. Wenn die Spitze der Pipette anderes Gewebe an der Wurzel der Zelle verfängt und dieses Gewebe verfärbt, versuchen Sie, die Mikropipette leicht zurückzuziehen und sich der Zelle erneut zu nähern, bevor Sie die Mikropipette bei Bedarf austauschen. Fahren Sie mit der Markierung anderer Zellen im selben Embryo oder in anderen Embryonen auf demselben Objektträger fort.

Bewegen Sie die Spitze an den Rand des Sichtfelds und wiederholen Sie den Vorgang. Entfernen Sie den größten Teil der Lösung in der Injektionskammer. Fixieren Sie dann die Embryonen, indem Sie 10 Minuten lang 7,4% Formaldehyd PBS hinzufügen, gefolgt von vier Waschgängen mit PBS.

Das Präparat kann nun photokonvertiert oder für die konfokale Mikroskopie unter Verwendung des skizzierten Protokolls montiert werden. Ein mit Dai gefülltes Interneuron wurde unter DIC-Optik einwandfrei photokonvertiert. Der räumliche Kontext der markierten Zelle innerhalb des unmarkierten umgebenden Gewebes war gut aufgelöst.

Zum Beispiel konnten die Positionen des Zellkörpers innerhalb der Hirnrinde und der Faserprojektion innerhalb der Neuropille in diesem Präparat gesehen werden. Der Farbtropfen war etwas zu groß. Mehrere benachbarte Zellen wurden gleichzeitig markiert, was es schwierig macht, einzelne Projektionen mit unterschiedlichen Zellkörpern in Verbindung zu bringen.

Beachten Sie auch, dass unter dem Fluoreszenzmikroskop die Hintergrundauflösung ohne Fotokonvertierung viel geringer ist. In dieses Präparat können auch mehrere Zellen in benachbarten Segmenten injiziert werden, ein Antikörper gegen schnell zwei Flecken von Fales in der Neuropille. Trotz der klaren Zellkörper zeigt das Präparat eine mögliche Nebenwirkung von verlängerten Photokonversionsperioden.

Die intensiver markierten Zellen neigen dazu, sich zu verfärben und anzuschwellen, verglichen mit der Markierung einer einzelnen Zelle mit konfokaler Optik. Die Markierung von Farbstoffaugen in Embryonen, die GFP-Reporterkonstrukte tragen, kann den räumlichen Kontext und die Identität der D-gefüllten Zelle innerhalb spezifischer Populationen von GFP-positiven neuronalen oder glialen Zelltypen liefern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Markierung einzelner Neuronen im embryonalen ZNS nach einer Oph vorbereitet und durchführt.

Aber wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie bitte daran, dass jeder einzelne Schritt anspruchsvoll ist, also rechnen Sie mit ein paar Wiederholungen, bis das gesamte Verfahren reibungslos verläuft.