Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während Drosophila Embryogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik der apoptotischen Zellclearance im Drosophila-Embryo zu verfolgen. Dies wird mit transgenen Fliegen erreicht, die einen zytoplasmatischen GFP-Marker enthalten, der phagozytäre Zellpopulationen markiert. Embryonen werden mit dem Simio GFP-Marker gesammelt, gewaschen und beschichtet. Als nächstes werden die Embryonen für die Injektion positioniert, gefolgt von der Überwachung des ZNS.

Der dritte Schritt ist die Markierung apoptotischer Zellen durch Injektion spezifischer Apoptose-Phagozytose-Marker, wie z. B. ein X in fünf, der letzte Schritt besteht darin, Zeitrafferaufnahmen des embryonalen ZNS mittels konfokaler Mikroskopie zu machen. Letztendlich können die Ergebnisse die Lokalisation und das Verhalten von apoptotischen Zellen und Phagozyten während verschiedener Stadien der apoptotischen Zellclearance durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie an fixierten Embryonen besteht darin, dass wir die Dynamik der apoptotischen Zellclearance verfolgen können.

Die Apoptotische Zellclearance ist ein hochdynamischer Prozess, der verschiedene Schritte umfasst. Diese Technik ermöglicht es uns, die verschiedenen Schritte mit spezifischen Markern für apoptotische Zellen und Phagozyten zu verfolgen. Das Protokoll beginnt damit, dass ein Klebstoff aus herkömmlichen Reagenzien doppelseitiges Klebeband abrollt und dann wieder aufgerollt wird, damit es in ein Szintillationsfläschchen passt.

Füllen Sie das Fläschchen mit Heptan und verschließen Sie es mit Param. Befestigen Sie dann das Fläschchen an einem Mutternstift und schütteln Sie es 24 Stunden lang vorsichtig. Bei Raumtemperatur wird der vorbereitete Kleber am nächsten Tag in ein neues Fläschchen umgefüllt.

Verwenden Sie eine Glas-PE für Ihre Pipette, um den vorbereiteten Kleber in eine neue Datei zu übertragen. Nach der Zubereitung kannst du den Kleber mit einer Pipettenspitze auf die Deckgläser auftragen. Verteile einen Tropfen Heptankleber in einer Linie in der Mitte des Deckglases.

Lassen Sie den Kleber einige Sekunden lang versuchen. Die Deckgläser können dann nach der Betäubung der Fliegen mit Kohlendioxid bis zu einem Monat bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Box gelagert werden. Pool von etwa 400 Fliegen in einem Auffangbehälter mit einer erwärmten Traubensaft-Legeplatte, die bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden ausgetauscht wird. Sammeln Sie die Traubensaft-Legeplatte und decken Sie den Behälter mit einer neuen Platte ab, um die Fliegen bei Laune zu halten.

Die entnommene Platte enthält null bis zwei Stunden alte Embryonen. Stellen Sie die gesammelte Traubensaftlegeplatte mit den Embryonen wieder in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator, bis sie den gewünschten Entwicklungszeitpunkt erreicht haben. In diesem Beispiel werden Embryonen zwischen 10 und 12 Stunden inkubiert, so dass sie sich nach der Entwicklung zum Stadium 15 oder 16 entwickeln.

Verwenden Sie Leitungswasser und einen sauberen Pinsel, um die Embryonen von der Platte in eine Zelle zu übertragen. Sieb. Bewahren Sie das Sieb über einem Behälter auf, damit verschüttete Embryonen geborgen werden können. Spülen Sie die entnommenen Embryonen aus, bis die gesamte Hefepaste entfernt ist.

Trocknen Sie dann das überschüssige Wasser aus, indem Sie die Außenseite des Siebs abwischen. Legen Sie das Zellsieb in eine saubere Petrischale, um das Korion ausreichend zu entfernen. 50% Bleichmittel, um die Embryonen mit dem Zellsieb abzudecken, und warten Sie zwei Minuten, indem Sie sie zwei- bis dreimal umrühren.

Spülen Sie anschließend die Embryonen ab, bis sie nicht mehr nach Bleiche riechen. Legen Sie die Embryonen in den Zellbehälter in eine saubere Petrischale und bedecken Sie sie mit Wasser, damit sie nicht austrocknen. Für die Injektion der Embryonen.

Bereiten Sie die Injektionsnadeln im Voraus mit einem Nadelzieher und dünnwandigen Glasfilamenten vor. Laden Sie einen Mikroliter des gewünschten Reagenzes in zwei Nadeln, wobei eine Nadel als Backup dient. Ein stabiler Marker, der nicht leicht bleicht, wie z. B. ein X von fünf, ist ein gutes Reagenz.

Lege nun ein rechteckiges Stück Traubensaft-Agar auf ein Mikroskop. Schieben Sie die Embryonen aus dem Sieb in den Agar und übertragen Sie sie. Wählen Sie mit einem sauberen Pinsel unter einem Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop die richtig inszenierten Embryonen für die Injektion mit dem GFP-Marker aus.

Bewegen Sie die ausgewählten Embryonen mit einem feuchten Pinsel in eine Reihe von 10 Embryonen mit der Bauchseite nach oben. Positionieren Sie die Reihe am Rand des Agro-Blocks. GFP kann im zentralen Nervensystem des Embryos beobachtet werden.

Befestigen Sie nun die Embryonen mit einem Streifen des Heptanklebers auf einem Deckglas. Die richtige Position der Embryonen ist sehr wichtig für den Erfolg der Injektion. Nehmen Sie sich Zeit und stellen Sie sicher, dass die Embryonen genau in der richtigen Ausrichtung ausgerichtet sind.

Legen Sie anschließend den Deckglas für etwa fünf Minuten in die Dörrkammer. Nachdem Sie die Embryonen getrocknet haben, bedecken Sie sie mit Hello Carbon Oil 700, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden. Zum Schluss geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger.

Legen Sie dann die Decklippe mit den Embryonen auf den Nassmikroskop-Objektträger. Die Embryonen sind nun bereit für die Injektion. Beginnen Sie damit, eine Nadel an einem Mikrom-Manipulator und der Pico-Pumpe zu befestigen.

Die Pumpe steuert die Menge der eingespritzten Flüssigkeit, indem sie Stickstoff in die Nadel drückt. Ein Fußpedal steuert den gesteuerten Auswurf des Stickstoffs unter dem Mikroskop. Fokussieren Sie sich auf die Nadelspitze und positionieren Sie sie in der Nähe des Randes des Deckglases, wobei die Nadelspitze und der Deckglas sehr vorsichtig scharf sind.

Bewegen Sie den Deckglas, bis er auf die Nadelspitze trifft und diese bricht. Der Öffnungsdurchmesser sollte ein halbes bis zwei Mikrometer betragen. Konzentrieren Sie sich nun auf die Embryonen.

Führe die Nadel in das Öl. Wenn die Nadelspitze richtig gebrochen wurde, sollte ein Tropfen Flüssigkeit in das Öl austreten. Wenn Sie das Pedal drücken, ohne den Nadelhalter zu berühren, bewegen Sie den Tisch so, dass der seitliche Rand des Embryos von der Nadel durchstochen wird.

Injizieren Sie schnell einen Tropfen Lösung in den Embryo. Bewegen Sie den Embryo weg und fahren Sie mit dem nächsten fort, bis alle 10 Embryonen injiziert sind. Bilden Sie die Embryonen an einem inversen Konfokalmikroskop mit einem 40-fach- oder 100-fach-Objektiv ab.

Suchen Sie nach einem schön positionierten Embryo mit dem ZNS in der Mitte, der eine starke GFP-Expression und Markierung apoptotischer Zellen zeigt. Um Zeitrafferaufnahmen zu machen, wählen Sie fünf oder sechs konfokale Scheiben aus, die an diesen Stellen mit Mikron befestigt werden. Führen Sie alle 60 Sekunden einen Scan durch, ein Intervall, in dem GFP-Bleaching kein Problem darstellen sollte.

Machen Sie anschließend eine Projektion von drei Scheiben mit einer Dicke von sechs Mikrometern, um die gesamten Zellen zu beobachten. In einigen Fällen kann es vorkommen, dass sich ein Embryo während der Videoaufzeichnung zu wälzen beginnt. Überwachen Sie daher die Aufzeichnung, damit keine Zeit mit dem Bewegen von Embryonen verloren geht.

Ein richtig positionierter Embryo im Stadium 15 zeigt das embryonale ZNS in der Mitte mit gut markierten Gliazellen, die durch ein g Makrophagen M gekennzeichnet sind, die sich meist außerhalb des ZNS befinden. Starke zytoplasmatische GFP-Expression. Ektodermale Zellen E werden ebenfalls mit zytoplasmatischem GFP markiert.

Diese Frames zeigen apoptotische Zellen, die mit einem ex von fünf markiert sind, und Clea-Ektoderm und Makrophagen, die mit Cit-GFP markiert sind. Jeder Rahmen ist eine Projektion von drei Scheiben und jede Scheibe ist zwei Mikrometer dick. Viele Ex in fünf positiven Zellen befinden sich innerhalb und außerhalb des ZNS.

Das Box-Event zeigt eine Gliazelle, die ein apoptotisches Teilchen verschlingt. Man beachte das Sondierungsverhalten der Gliazelle. Es berührt das apoptotische Teilchen einige Male, bevor es nach seiner Entwicklung zur Verschlingung der apoptotischen Zelle kommt.

Die Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der apoptotischen Zellclearance den Weg, um die Phagozytose apoptotischer Zellen während der Entwicklung zu erforschen. Mit dieser Technik können wir das hochdynamische Verhalten der apoptotischen Zellclearance untersuchen.