Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Dynamik des Abbaus apoptotischer Zellen im Drosophila-Embryo zu verfolgen. Dies wird mithilfe transgener Fliegen erreicht, die einen zytoplasmatischen GFP-Marker enthalten, der phagozytierende Zellpopulationen markiert. Embryos mit dem Simio-GFP-Marker werden gesammelt, gewaschen und beschichtet. Anschließend werden die Embryos für die Injektion positioniert, gefolgt von der Überwachung des zentralen Nervensystems (CNS).

Der dritte Schritt ist die Markierung von apoptotischen Zellen durch Injektion der Embryonen mit spezifischen Markern für die Phagozytose von Apoptose, wie beispielsweise einem X in fünf; der letzte Schritt besteht darin, Zeitrafferaufnahmen des embryonalen ZNS mittels konfokaler Mikroskopie anzufertigen. Letztendlich können die Ergebnisse die Lokalisation und das Verhalten von apoptotischen Zellen und Phagozyten während verschiedener Stadien des Abbaus apoptotischer Zellen durch fluoreszenzkonfokale Mikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie an fixierten Embryonen liegt darin, dass wir die Dynamik des Abbaus apoptotischer Zellen verfolgen können.

Der Abbau apoptotischer Zellen ist ein äußerst dynamischer Prozess, der verschiedene Schritte umfasst. Diese Technik ermöglicht es uns, die unterschiedlichen Schritte mithilfe spezifischer Marker für apoptotische Zellen und Phagozyten zu verfolgen. Das Protokoll beginnt damit, einen Kleber aus herkömmlichen Reagenzien herzustellen, indem man doppelseitiges Klebeband abrollt und anschließend wieder aufrollt, um es in ein Szintillationsfläschchen einzupassen.

Füllen Sie das Gefäß mit Heptan und verschließen Sie es mit Parafilm. Befestigen Sie anschließend das Gefäß an einem Rüttelblock und schütteln Sie es vorsichtig 24 Stunden lang. Am nächsten Tag wird der hergestellte Kleber bei Raumtemperatur in ein neues Gefäß überführt.

Verwenden Sie eine Glas-Pipette, um den hergestellten Klebstoff auf eine neue Datei zu übertragen. Tragen Sie den Klebstoff nach der Vorbereitung mit einer Pipettenspitze auf Deckgläser auf. Verteilen Sie einen Tropfen Heptan-Klebstoff in einer Linie in der Mitte des Deckglases.

Lassen Sie den Kleber einige Sekunden trocknen. Die Deckgläser können danach bis zu einem Monat bei Raumtemperatur in einer geschlossenen Box aufbewahrt werden, nachdem die Fliegen mit Kohlendioxid betäubt wurden. Sammeln Sie etwa 400 Fliegen in einem Sammelbehälter mit einer erwärmten Traubensaft-Legescheibe, die für zwei Stunden bei 25 Grad Celsius ausgetauscht wird. Sammeln Sie die Traubensaft-Legescheibe ein und decken Sie den Behälter mit einer neuen Scheibe ab, um die Fliegen zufriedenzustellen.

Die gesammelte Platte enthält Embryonen, die null bis zwei Stunden alt sind. Stellen Sie die Sammelplatte mit Traubensaft und den Embryonen in einen Inkubator bei 25 Grad Celsius zurück, bis sie den gewünschten Entwicklungszeitpunkt erreicht haben. In diesem Beispiel werden die Embryonen zwischen 10 und 12 Stunden inkubiert, sodass sie sich bis zum Stadium 15 oder 16 weiterentwickeln.

Verwenden Sie Leitungswasser und einen sauberen Pinsel, um die Embryonen von der Platte auf ein Zell-Sieb zu übertragen. Halten Sie das Sieb über einen Behälter, damit eventuell überschüssige Embryonen aufgefangen werden können. Spülen Sie die gesammelten Embryonen, bis sämtliche Hefepaste entfernt ist.

Entfernen Sie anschließend das überschüssige Wasser, indem Sie die Außenseite des Siebs abwischen. Stellen Sie das Zellsieb in eine saubere Petrischale, um die Chorionhülle vollständig zu entfernen. Geben Sie 50 % Bleiche, um die Embryonen im Zellsieb zu bedecken, und warten Sie zwei Minuten, wobei Sie sie zwei- bis dreimal umrühren.

Als Nächstes spülen Sie die Embryonen gründlich ab, bis sie nicht mehr nach Bleiche riechen. Geben Sie die Embryonen in den Zellbehälter in eine saubere Petrischale und bedecken Sie sie mit Wasser, um Austrocknung zu verhindern. Zum Injizieren der Embryonen.

Bereiten Sie Injektionsnadeln im Voraus mithilfe eines Nadelpullers und dünner Glasfilamente vor. Füllen Sie ein Mikroliter des gewünschten Reagenz in zwei Nadeln, wobei eine Nadel als Ersatz dient. Ein stabiles Markierungsmittel, das nicht leicht ausbleicht, wie beispielsweise ein X aus fünf, eignet sich gut als Reagenz.

Platzieren Sie nun ein rechteckiges Stück Traubensaft-Agar auf einem Mikroskopobjektträger und übertragen Sie die Embryonen vom Sieb auf das Agar. Wählen Sie mithilfe eines sauberen Pinsels unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop die korrekt entwickelten Embryonen für die Injektion anhand des GFP-Markers aus.

Bringen Sie die ausgewählten Embryonen mit einem angefeuchteten Pinsel in eine Reihe von 10 Exemplaren mit ihren ventralen Seiten nach oben. Positionieren Sie die Reihe am Rand des Agar-Blocks. GFP ist im zentralen Nervensystem des Embryos sichtbar.

Befestigen Sie nun die Embryonen mit einem Streifen Heptan-Klebstoff auf einem Deckglas. Die richtige Position der Embryonen ist entscheidend für den Erfolg der Injektion. Nehmen Sie sich Zeit und stellen Sie sicher, dass die Embryonen exakt in der richtigen Orientierung ausgerichtet sind.

Als Nächstes das Deckglas etwa fünf Minuten lang in die Dehydrierungskammer geben. Nach dem Trocknen der Embryonen diese mit Hello-Kohlenstofföl 700 bedecken, um eine weitere Dehydrierung zu vermeiden. Zuletzt einen Tropfen Wasser auf einen Objektträger geben.

Danach die Deckfolie mit den Embryonen nach oben auf die feuchte Mikroskopiepräparat setzen. Die Embryonen sind nun bereit zur Injektion. Beginnen Sie damit, eine Nadel an einen Mikromanipulator und die Pico-Pumpe anzuschließen.

Die Pumpe steuert die Menge der injizierten Flüssigkeit, indem sie Stickstoff in die Nadel drückt. Ein Fußpedal steuert die gesteuerte Abgabe des Stickstoffs unter dem Mikroskop. Fokussieren Sie die Nadelspitze und positionieren Sie sie sorgfältig nahe der Kante des Deckglases, wobei sowohl die Nadelspitze als auch das Deckglas scharf im Fokus liegen müssen.

Bewegen Sie die Deckglasabdeckung, bis sie die Nadelspitze berührt und diese bricht. Der Öffnungsdurchmesser sollte zwischen einem halben und zwei Mikrometern liegen. Fokussieren Sie nun auf die Embryonen.

Führen Sie die Nadel in das Öl ein. Wenn die Nadelspitze korrekt abgebrochen wurde, sollte sich ein Tropfen Flüssigkeit in das Öl hinein verlieren. Wenn Sie das Pedal betätigen, ohne den Nadelhalter zu berühren, bewegen Sie den Objekttisch so, dass die seitliche Kante des Embryos von der Nadel durchbohrt wird.

Spritzen Sie schnell einen Tropfen Lösung in den Embryo ein. Bewegen Sie den Embryo beiseite und fahren Sie mit dem nächsten fort, bis alle 10 Embryonen injiziert sind. Bilden Sie die Embryonen auf einem invertierten konfokalen Mikroskop mit einer 40x- oder 100x-Objektivlinse ab.

Suchen Sie nach einem gut positionierten Embryo mit dem zentralen Nervensystem in der Mitte, der eine starke GFP-Expression und die Markierung apoptotischer Zellen zeigt. Wählen Sie für die Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen fünf oder sechs konfokale Schnittebenen aus, um an diesen Stellen Mikron-Aufnahmen zu erstellen. Führen Sie alle 60 Sekunden eine Aufnahme durch, einem Intervall, bei dem die GFP-Ausbleichung keine Rolle spielen sollte.

Anschließend erfolgt eine Projektion von drei Schnitten mit einer Dicke von sechs Mikrometern, um die gesamten Zellen zu beobachten. In einigen Fällen kann sich ein Embryo während der Videobearbeitung zu drehen beginnen. Daher sollte die Aufnahme überwacht werden, um sicherzustellen, dass keine Zeit mit sich bewegenden Embryonen verloren geht.

Ein korrekt positioniertes Embryo im Stadium 15 zeigt das embryonale ZNS in der Mitte mit gut gekennzeichneten Gliazellen, markiert durch ein g, sowie Makrophagen M, die sich größtenteils außerhalb des ZNS befinden. Starke zytoplasmatische GFP-Expression. Auch ectodermale Zellen E sind mit zytoplasmatischem GFP markiert.

Diese Einzelbilder zeigen apoptotische Zellen, die mit einem ex in five-Gen markiert sind, sowie Ektodermzellen und Makrophagen, die mit cite GFP markiert sind. Jedes Bild stellt eine Projektion aus drei Schichten dar, wobei jede Schicht zwei µm dick ist. Viele ex in five-positive Zellen befinden sich innerhalb und außerhalb des ZNS.

Das eingerahmte Ereignis zeigt eine Gliazelle, die ein apoptotisches Partikel aufnimmt. Beachten Sie das abtastende Verhalten der Gliazelle. Sie berührt das apoptotische Partikel mehrmals, bevor sie die Aufnahme der apoptotischen Zelle nach ihrer Entwicklung vollzieht.

Die Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des apoptotischen Zellabbaus, die Phagozytose apoptotischer Zellen während der Entwicklung zu untersuchen. Mithilfe dieser Technik können wir das äußerst dynamische Verhalten des apoptotischen Zellabbaus erforschen.