Name: Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Lernen Sie die Isolation und Kultur primärer Kardiomyozyten aus Herzen neonataler Mäuse. Diese robuste Methode ermöglicht biomechanische, biochemische und zellbiologische Assays zur Untersuchung kardialer Funktionen.

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Wir danken Prof. emeritus Jean-Claude Perriard und Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) für die Einführung in die Isolation Techniken zur neonatalen Ratten-und Maus-Kardiomyozyten. Wir möchten Prof. Ju Chen und Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) für ihre Unterstützung danken. Arbeit im Labor von EE wurde von einem MRC Karriere Gründung Zuschuss finanziert. SL wird von einem K99/R00 Weg in die Unabhängigkeit Auszeichnung von der NIH / NHLBI (HL107744) unterstützt. TMM wurde durch ein Postdoc-Stipendium der American Heart Association (11POST7310066) unterstützt.

Das folgende Verfahren beschreibt eine zweitägige Protokoll 16,17 für die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Alle Lösungen sind steril und steril filtriert. Alle Werkzeuge werden durch Oberflächensterilisation mit 75% Ethanol sterilisiert. Mit Ausnahme der anfänglichen Gewebeentnahme, werden alle Schritte in einer sterilen laminaren Strömung Zellkulturhaube durchgeführt. Dieses Protokoll wird für die Isolierung von neonatalen Mäuseherzen 1-2 Wurf (s) bestimmt - etwa 5-14 Jungtieren, kann aber für größere Wurfgrößen und neonatalen Ratten-Kardiomyozyten angepasst werden. Skala media / Enzymeinsatz als angemessen. Für die Arbeit mit Neugeborenen Nagetiere, finden Sie in Ihrer örtlichen Universität Richtlinien und Regeln von der Legislative und / oder Tierpflege-Programme eingestellt, und sich an Ihren institutionell genehmigten Tier Protokoll. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden von der UC San Diego Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) genehmigt wurde, und sich an federal und Vorschriften. 1. Tag. 1. Isolation von Herzgewebe von neugeborenen Mäusen <ol><li> Bereiten Sie 50 ml 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM 8.6 ergänzt und zerstreuen sich in zwei sterile Bakterien Gerichte auf Eis gestellt. </li><li> Bereiten Sie 10 ml Isolationsmedium in 50 ml sterile konische Falcon-Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Sterilisieren Schere (eine gekrümmte, eine geradeaus) und Zange (gekrümmt, Dumont Nr. 7). </li><li> 1-3 Tage alten neugeborenen Mäusen werden schnell in 75% Ethanol-Lösung für die Oberflächensterilisation gespült. Jungtiere werden mit einer sterilen Schere (gerade) geköpft, und die Brust wird entlang dem Brustbein geöffnet werden, um Zugang zu der Brusthöhle und das Herz (1A, Supplemental Film S1) zu ermöglichen. Technische Anmerkung: Neugeborene Mäuse älter als 3 Tage verwendet werden können, aber zu weniger lebensfähigen Zellen 2. </li><li> Herzen sind aus extrahiertder Körper mit gekrümmten Scheren und sofort in die Bakterienschale mit 1x PBS mit 20 mM BDM übertragen (ohne Ca 2 +, Mg 2 +), auf Eis. Alle folgenden Schritte werden in dem sterilen Zellkulturhaube durchgeführt. </li><li> Lungengewebe zu entfernen, größere Gefäße (Vorhöfe und, falls gewünscht). Wash Herzen in der 1x PBS-Lösung (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis), um Blut zu entfernen. Über gewaschen Herzen aus der ersten in die zweite Schüssel Bakterienschale mit 1x PBS (ohne Ca 2 +, Mg 2 +) mit 20 mM BDM (auf Eis) mit einer Pinzette oder einer gelochten Löffel (Abbildung 1B). </li><li> Über gereinigt / gewaschen Herzen in einem Tropfen Isolationsmedium (etwa 250 ul; 1C) in einem dritten Bakterienschale (auf Eis) und die Verwendung der gebogenen Schere, um die Herzen in kleine Stücke (ca. 0,5-1 mm 3, Hackfleisch oder kleiner; 1D, 1E). </li><li> Übertragen Hackfleisch Herzen in einer konischenRöhrchen mit 10 ml Isolationsmedium (auf Eis), und Inkubation unter leichtem Schütteln bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Tag. 2. Enzymatische Verdauung und Gewebeüberzug der Zellen <ol><li> Wiegen in 15 mg Collagenase / Dispase Mischung (Roche) und lösen die Enzymmischung in 10 ml Medium L15-5 mit 20 mM BDM (Digestionsmedium) ergänzt. Sterilfilter der Digestionsmedium in der Zellkultur Haube in eine neue sterile 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Bereiten Sie 30 ml L-15-Medium mit 20 mM BDM ergänzt und Plattierungsmedium. </li><li> Mantel Zellkulturplatten mit Collagen-Lösung (Sigma C-8919) für mindestens 1 Stunde. Entfernen Kollagenlösung (kann wiederverwendet werden) und trocken Kollagen beschichtete Zellkulturschalen in sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Kapuze. </li><li> Entfernen Sie die konischen Rohr, das die Herzen von vorverdaut 4 ° C Gewebefragmente sollten zusammengefasst werden (1G). Lassen Sie die Gewebefragmente sinkender Boden der Röhre und Überstand (stellen Sie sicher, dass keine Gewebefragmente zu verlieren;. normalerweise kann ca. 1 ml der Isolationsmedium in der Röhre bleiben). 5 ml Digestionsmedium und 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt, um Gewebefragmente und sauerstoffhaltige Suspension unter Verwendung von Sauerstoff oder Luft für 1 min. </li><li> Übertragen des versiegelten konischen Rohr die Herzgewebefragmente in Digestionsmedium, enthaltend bis 37 ° C Wasserbad für ungefähr 2 Minuten, um die Temperatur der Aufschlußlösung einzustellen. </li><li> Herzgewebefragmente Bei 37 ° C unter leichtem Schütteln für 20-30 min (zB Schüttler bei 37 ° C, nicht mehr als 60 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist). . Aufschlusszeiten können stark von Enzymmischung und Chargennummer Achtung ab: längere Inkubationszeiten oder höhere Enzymkonzentrationen kann die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren. </li></ol> Technische Anmerkung: Wir empfehlen Verwendung einer Collagenase / Dispase Mischung von Roche (Kat.-Nr.: 10269638001), die hat sehr wenig viel-zu-viel Variabilität. Die klassische Enzym für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten Trypsin und / oder Collagenase Typ II 3,16-20 verfügbar von Worthington (Cat No CLS-2). Jedoch kann die Leistung der Collagenase II im wesentlichen von Charge zu Charge variieren. Worthington können typischerweise für die Prüfung mehrerer Kollagenase Lose Aufschlusszeiten zu optimieren und Enzymverbrauch. Alternativ verkauft Worthington eine Kardiomyozyten Isolation Kit mit einer vorab getesteten Enzymgemisch enthalten, dass kann für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten 17 (Best.-Nr.: NCIS) angepasst werden. <ol start="7"><li> Zeigen sterilen Zell-Sieb (40-100 um Nylon-Mesh) in frischem sterilen 50 ml konischen Falcon-Röhrchen. Pre-Nasszelle Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt. Sanft verreiben Gewebefragmente mit einem vorbenetzten 10 ml Zellkultur-Pipette für etwa 10-20 mal. Die Gewebestücke sollten vor allem bei diesem Schritt zu zerstreuen, die Freigabe der Zellen in suspension (Fig. 1H). </li><li> Lassen Sie größere Gewebestücke sedimentieren und Transferüberstand, der suspendierten Zellen in frisches konischen Rohr durch Zell-Sieb (1I). </li><li> Die unverdaute Gewebefragmente Re-suspend in 5 ml Digestionsmedium und Inkubation für weitere 5-10 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Nach Fortsetzung der Verdauung der verbleibenden Gewebefragmente, sanft verreiben Gewebe 10-20 mal und in den konischen Röhrchen mit Zellen aus dem ersten bis Zellsieb verdauen. Spülen der Zelle-Sieb mit 5 ml L-15 mit 20 mM BDM ergänzt um den Durchgang von allen verdaut Zellen zu ermöglichen. </li><li> Zentrifugat konischen Röhrchen suspendiert Kardiomyozyten für 5 Minuten bei 300 rpm (ca. 50-100 × g). Den Überstand (enthaltend hauptsächlich Fibroblasten und Endothelzellen) und resuspendieren Zellpellet in 10 ml Agarmedium. </li><li> Teller-Zellen in 10 cm Zellkulturschale (2A) und Inkubation für 1-3 H in Zellkulturbrutschrank. Diese Pre-Beschichtungsschritt entfernt Fibroblasten und Endothelzellen (Figur 2B), die auf den unbeschichteten Zellkulturschale (2C) haftet. </li><li> Nach der Inkubation, Waschen nicht haft Kardiomyozyten von 10 cm Kulturschale (resuspendieren Zellen durch wiederholtes Pipettieren der Plattenmedium über die Schale) und Transfer resuspendierten Zellen in ein steriles Falcon konische Zentrifugenröhrchen (15 ml oder 50 ml). Optional: Wiederholen Sie den Vor-Galvanisieren Schritt, um weitere Fibroblasten von Zell-Suspension zu entfernen. Falls gewünscht, können die anhaftenden Fibroblasten und Endothelzellen kultiviert werden. </li><li> Zählen von Zellen (zB durch Verwendung Neubauer Zählkammer, Trypanblau-Ausschluss-Färbung 21). </li><li> Teller Zellen in Kollagen-beschichteten Zellkulturschalen mit einer Dichte von etwa 1,5 x 10 5 Zellen pro cm 2 (2D, siehe auch Kommentare in Tabelle 1 auf Plattierungund Beschichtung). Setzen Gerichte in Zellkultur-Inkubator und lassen Sie ungestört für 12-18 h, für die Einhaltung und Verbreitung von Kardiomyozyten ermöglichen. </li></ol> Tag 3 - Kultur der neonatalen Kardiomyozyten <ol><li> Bereiten Erhaltungsmedium und vorgewärmte in 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Zugabe von Proliferationshemmer oder chronotrope Mittel oder das Verfahren zur liposomalen Transfektion von neonatalen Maus Kardiomyozyten. </li><li> Einen Tag nach der Beschichtung, sollten Kardiomyozyten in die Zellkulturschale eingehalten haben und optimal spontan beginnen zu schrumpfen (2E, 2F, STADT Movie-S2, siehe Tabelle 2 für häufige Probleme bei der Isolierung / Kultur Verfahren). Ersetzen Plattierungsmedium mit Erhaltungsmedium und Kultur für weitere 1-5 Tage. Medium gegebenenfalls ändern. </li></ol>

Die Verwendung von Tiermodellen, um Herzerkrankungen zu untersuchen hat sich in der kardiovaskulären Forschung Standard. Closer biochemische Charakterisierung dieser Modelle (dh Studium direkte Antworten von Herzzellen zu biochemischen oder biomechanischen Reize) erfordert in der Regel die Isolierung von Herzgewebe oder Herzmuskelzellen. Studien, die physiologischen Reaktionen des Herzens ex vivo (z. B. Acetylcholin 40 oder in Ischämie-Reperfusion Szenarien 41) in der Regel nutzen...

Die frühesten Berichte für die erfolgreiche Dissoziation und Kultur von Nagetier Herzzellen stammt aus dem 1960 1,2. Selbst dann Harary und Farley bemerkt, dass kultivierte Kardiomyozyten &quot;kann eine einzigartige System für die Untersuchung von den Anforderungen des Perioden Kontraktilität [und kann] ein Mittel zur Bestimmung des Beitrages der verschiedenen Stoffwechselwege für die [Schlagen] Prozess&quot;. Obwohl Harary und Farley isolierten und kultivierten Kardiomyozyten aus jungen Ratten, und der ursprüngliche Protokoll wurde angepasst, und über die Jahre von vielen Wissenschaftlern geändert, hat die allgemeine Isolation und Kultivierung Verfahren nicht wesentlich verändert. Allerdings hat bessere Enzyme 3, standardisierte Lösungen 4,5, und die Zugabe des reversiblen Kanal-und Myosin-ATPase-Inhibitor BDM Zellen während der Isolationsverfahren 9.6 Schutz deutlich verbessert Zell-Ertrag und Rentabilität. Erwachsene vs Neugeborenen-Kardiomyozytenzyten Kardiomyozyten isolierten und kultivierten neonatalen Mäusen oder Ratten haben mehrere Vorteile gegenüber Kulturen von adulten Kardiomyozyten. Vor allem ist das Isolierungsverfahren für neonatale Maus oder Rattenherzen einfacher und kostengünstiger im Vergleich zu der Isolierung von Kardiomyozyten aus adulten Maus oder Ratte 10. Neonatale Kardiomyozyten sind weit weniger empfindlich auf in eine Calcium-haltigem Medium nach der Dissoziation Wiedereinführung, Zellausbeute stark erhöht. Ein weiterer großer Vorteil ist, dass neonatale Kardiomyozyten der Maus durchlaufen eine schnellere Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus, führt in der Regel spontan nach der Plattierung schlagen Zellen 20 Stunden, während adulte Kardiomyozyten erfordern in der Regel Tempo der Kontraktion induzieren. Neonatale Kardiomyozyten sind auch leichter transfizierbar mit liposomalen Transfektion Methoden, während adulte Kardiomyozyten erfordern virale Vektoren für die erfolgreiche Umsetzung der transgenen DNA. Im Gegensatz zur neonatalen Kardiomyozytens, die Kultur der erwachsenen Nagetieren Kardiomyozyten 11-13 ermöglicht Untersuchungen von myofibrillären Abbau und späteren Wiederherstellung der kontraktilen Apparates. Diese charakteristischen morphologischen Veränderungen in adulten Kardiomyozyten treten über einen Zeitraum von ca. 1-2 Wochen. Die Entdifferenzierung - Redifferenzierung Zyklus wird durch Reexpression des fetalen Gen Programm begleitet, was in der menschlichen Kardiomyopathien 14 beobachteten pathologischen Veränderungen imitiert. Ein weiterer Vorteil des adulten Rattenherzmuskelzellen auf die Kultur von neonatalen Kardiomyozyten ist die Fähigkeit, diese Zellen Kultur für lange Zeiträume. Ratten-Herzmuskelzellen gegen Maus Die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Ratten-Herzmuskelzellen hat einige Vorteile gegenüber der von der Maus neonatalen Kardiomyozyten, darunter höhere Ausbeuten an lebenden Zellen und erhöhte Transfektionsraten. Doch die breite Verwendung von genetisch veränderten Mausmodellen für Herzerkrankungen (zB &lt;/ Em&gt; der Muskel lim Protein-Knockout-Maus als Modell für die dilatative Kardiomyopathie 15) wurde auf die Anpassung der Verfahren für die Isolation von Kardiomyozyten neugeborenen Mäusen abgeleitet geführt. Obwohl die zur neonatalen Ratte und Maus Kardiomyozyten isolieren Protokolle sind nahezu identisch, müssen größere Sorgfalt bei der Auswahl eines geeigneten Enzymmischung für die letztere eingenommen werden. Tatsächlich sind neonatalen Maus Kardiomyozyten im allgemeinen anfälliger für overdigestion, was zu einer verringerten Zell Ausbeute und Lebensfähigkeit. Außerdem sollte die Beschichtung Dichte eingestellt werden, weil Kardiomyozyten aus neugeborenen Mäusen abgeleitet Vergleich zu Zellen von neugeborenen Rattenherzen abgeleitet sind etwas kleiner. Bei vielen Anwendungen für die Untersuchung der morphologischen, elektrochemische, biochemische, zellbiologische und biomechanische Parameter als auch für das Verfahren der Myofibrillogenese haben kultivierten neonatalen Herzmuskelzellen zu einem der vielseitigsten Systeme für das Studium derHerzzellfunktionen in vitro. Der erste Schritt zu einem erfolgreichen Test hängt jedoch auf eine einfache und zuverlässige Methode zur neonatalen Kardiomyozyten der Maus zu isolieren. Unser Protokoll bezieht seine Methodik aus vielen Quellen und wurde für die Reproduzierbarkeit und Robustheit optimiert. Wir diskutieren Faktoren, die Kardiomyozyten-Ertrag und Rentabilität zu beeinflussen, und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

<table><tbody><tr><td>BDM (2,3-Butandion-Monoxime) 6-8</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>bereiten 0,2M Stammlösung in HBSS (ohne Ca2+, Mg2+), Filter sterilisieren, kann bei 4 &#176 gehalten werden; C bis zu 6 Monaten; Vorsicht: Eine längere Anwendung von BDM außerhalb des Isolierungsverfahrens kann während der Kardiomyozytenkultur zu nicht schlagenden Zellen, einer verminderten Zellviabilität und/oder einer signifikant veränderten Genexpression führen46,47.</td></tr><tr><td>Kollagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>kann mit Kollagenase Typ II von Worthington substituiert</td></tr><tr><td>werden Kollagenase Typ II3</td><td>Worthington</td><td>CLS-2</td><td>Ersatz für Kollagenase/Dispase-Mix von Roche</td></tr><tr><td>1x Trypsin-Lösung (0,25%) mit EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Penicillin/Streptomycin-Lösung mit EDTA in HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (ohne Ca2+, Mg2+)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&#8217; s ausgewogene Salzlösung; ohne Ca2+, Mg2+) 4</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Cellgro mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Cellgro</td><td>35-030-CV</td><td>Zellkultur </td></tr><tr><td>Leibovitz L-155</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (Cytosin-B-D-arabino-furanosidhydrochlorid)</td><td>Sigma</td><td>C-6645</td><td>Proliferationshemmer, 1 mM Stammlösung in H2O herstellen, filtrieren, sterilisieren, bei 4 &#176 lagern; C</td></tr><tr><td>Phenylephrin</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>chronotropes Mittel, 100 mM Stammlösung in H2O herstellen, filtrieren, sterilisieren, bei 4 &#176 lagern; C oder -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Isoproterenolhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>I-6501</td><td>chronotropes Mittel, 1 mM Stammlösung in H2O herstellen, filtrieren, sterilisieren, bei 4 &#176 lagern; C oder -20 &#176; C</td></tr><tr><td>0,1% Kollagenlösung</td><td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>extrazelluläre Matrix zur Beschichtung</td></tr> von <tr><td>3 mg/ml Kollagen Typ 1 Lösung</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>Alternative zu Sigma Kollagenlösung</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>geeignete Filtergröße:40 &#956; M-100 &#956; m</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,2 &#956; m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>für die Sterilfiltration von Aufschlussmitteln</td></tr> gerade <tr><td>Schere</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>gebogene Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Nr. 7 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>perforierter Löffel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td>optional, für den Transfer von Herz Gewebe</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Lebendzellfärbung</td></tr><tr><td>Neubauer Hämozytometer</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>alternativ verwenden: Einweg-Hämozytometer C-Chip oder automatisierte Zellzählsysteme</td></tr><tr><td>50 ml Falcon Röhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon Röhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spritze</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische Pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Zellkulturschale</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>für die Standardkultur von Kardiomyozyten</td></tr><tr><td>30 mm Zellkulturschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>für die Bildgebung lebender Zellen mit inversem Mikroskop</td></tr><tr><td>10 cm Zellkulturschale</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>zur Präplattierung</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>für die liposomale Transfektion, alternativ Lipofectamin 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>Ersatz für Escort III</td></tr><<tr>td colspan="4">Puffer und Medien: <ul> <li>Isolationsmedium (Filter sterilisieren) 20 mM BDM 0,0125% Trypsin in HBSS4 (ohne Ca2+, Mg2+)</li> <li>Aufschlussmedium (Filter sterilisieren) 20 mM BDM 1,5 mg/ml Roche Kollagenase/Dispase-Enzymmix in L15 medium</li> <li>Plating medium 65 % DMEM mit hohem Glucose 19 % M-199 10 % Pferdeserum 5 % fötalem Kälberserum 1 % Penicillin/Streptomycin</li> <li>Maintenance medium 78 % DMEM mit hohem Glucose 17 % M-199 4 % Pferdeserum 1 % Penicillin/Streptomycin optional: 1 &#956; M AraC 1 &#956; M Isoproterenol oder 0,1 mM Phenylephrin</li> </ul> Das Beschichtungs- und Wartungsmedium kann bei 4 &#176; C für bis zu 6 Monate.</td></tr></tbody></table>

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Kultivierten neonatalen Kardiomyozyten seit langem verwendet, um Myofibrillogenese und myofibrillären Funktionen zu studieren. Kultivierte Kardiomyozyten ermöglichen eine einfache Untersuchung und Manipulation von biochemischen Wege, und ihre Wirkung auf die biomechanischen Eigenschaften des spontan schlagenden Herzmuskelzellen. Die folgende 2-Tages-Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von neonatalen Kardiomyozyten der Maus. Wir zeigen, wie leicht zu sezieren Herzen von Neugeborenen, distanzieren das Herzgewebe und bereichern Kardiomyozyten aus dem Herz-Zell-Population. Wir diskutieren den Einsatz von verschiedenen Enzymmischungen für Zell-Dissoziation und ihre Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit. Die isolierten Herzmuskelzellen kann anschließend für eine Vielzahl von morphologischen, elektrophysiologischen, biochemischen und zellbiologischen biomechanische Tests verwendet werden. Wir optimieren das Protokoll für die Robustheit und Reproduzierbarkeit, indem nur kommerziell erhältlichen Lösungen und Enzymmischungen, dass show wenig viel-zu-viel Variabilität. Wir wenden uns auch gemeinsame Probleme mit der Isolierung und Kultivierung von Herzmuskelzellen verbunden und bieten eine Vielzahl von Optionen für die Optimierung der Isolation und der Kulturbedingungen.

Über dieses Protokoll isolierten wir Herzen aus 8 einen Tag alt neugeborenen Mäusen (1A, 1B, STADT Film S1). Nach dem Waschen und Zerkleinern der die Herzen mit einer Schere (1C-1F), Gewebefragmente wurden in Isolationsmedium über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln vorverdaut. Nach Vorverdauung (1G), die Gewebefragmente übertragen wir in frisch gemacht Verdauung Medium und die Gewebefragmente für 20 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. Die resultierende Zellsu...

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neonatale Maus-Kardiomyozyten für die Verwendung in nachfolgenden Assays zu isolieren und zu kultivieren. Dazu werden zunächst die Herzen neugeborener Mäuse präpariert und dann das Herzgewebe manuell in kleine Fragmente geschnitten. Im zweiten Schritt werden die Herzzellen durch eine Reihe von enzymatischen Verdauen dissoziiert. Als nächstes werden die isolierten Zellen plattiert, um sie für Kardiomyozyten anzureichern. Schließlich können die kultivierten Kardiomyozyten beobachtet werden, die an der Platte haften und spontanes Schwebverhalten zeigen. Letztendlich kann die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen in Herzmuskelzellen, die mit eukaryotischen Expressionskonstrukten transfiziert wurden, mittels Immunfluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.- Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden ist die Robustheit und Reproduzierbarkeit bei der Isolierung und Kultivierung von neonatalen Maus-Kardiomyozyten.- Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardiovaskulären Forschung zu beantworten und Einblicke in die einzigartige molekulare Zellbiologie von Herzmuskelzellen zu geben, z. B. die Frage,

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von murinen pulmonalen Endothelzellen. Dieses Verfahren umfasst mechanische und enzymatische Lungengewebe Dissoziation sowie eine 2-Schritt-Reinigungsverfahren mit anti-PECAM-1 und anti-ICAM-2-Antikörper, konjugiert an magnetische Kügelchen, die eine reine Endothelzellen Bevölkerung meist mikrovaskuläre Herkunft produziert.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Wir haben eine neue und reproduzierbare Technik zur primären Kulturen der Lungenarterie glatten Muskelzellen (PASMC) von Mäusen, so jung wie P7 isolieren entwickelt, wodurch eine bessere Erforschung der Signalwege in neonatalen glatten Muskelzellen Kontraktion und Relaxation beteiligt.

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Die Isolierung von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten ist ein zeitaufwändiges und unvorhersehbares Verfahren.  Diese Studie beschreibt Methoden zur Kryokonservierung und zum Auftauen von neonatalen Ratten-Kardiomyozyten, die eine effizientere Nutzung der Zellen ermöglichen. Die aufgetauten NRCMs können für verschiedene Experimente verwendet werden, ohne dass jedes Mal Isolationen durchgeführt werden müssen.

Isolierung und Kryokonservierung von neonatalen Rattenkardiomyozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Lernen Sie die Isolation und Kultur primärer Kardiomyozyten aus Herzen neonataler Mäuse. Diese robuste Methode ermöglicht biomechanische, biochemische und zellbiologische Assays zur Untersuchung kardialer Funktionen.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

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