Identifizierung von Dornröschen Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR
1. Februar 2013
Verfahren zur Identifizierung unbekannter Fahrer von Karzinogenese Verwendung eines unvoreingenommene Ansatz beschrieben. Das Verfahren verwendet das Dornröschen Transposon als eine zufällige Mutagen auf spezifische Gewebe. Genomic Mapping von Transposon-Insertionen, die Tumorbildung zu fahren identifiziert neue Onkogene und Tumor-Suppressor-Gene
Dieses Verfahren zeigt, wie neue Onkogene und Tumorsuppressorgene identifiziert werden können, indem die Transponierung auf Insertionen in der Maus kartiert wird, die die Tumorbildung vorantreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst Tumore aus dem transgenen Mausmodell erzeugt und geerntet werden. Die nächsten Schritte des Verfahrens bestehen darin, die Tumor-DNA zu isolieren, eine Linker-vermittelte PCR durchzuführen, dann die amplifizierten DNA-Proben zu sequenzieren und die Transponierung bei Insertionen zu analysieren.
Letztendlich identifiziert das Verfahren Kandidatengene für Tumortreiber. Der Hauptvorteil der Verwendung von Linker-vermittelter PCR in Verbindung mit einem unvoreingenommenen genetischen Screening unter Verwendung von Dornröschen-Transposons besteht darin, dass wir neue genetische Treiber von Krebs leicht identifizieren können. Beginnen Sie das Sezieren immer damit, dass Sie das Äußere der geopferten Maus mit 70%igem Ethanol besprühen.
Die entnommenen Gewebe und Tumoren sollten in vier Abschnitte mit einer Größe von 50 bis 100 Milligramm unterteilt werden. Fixieren Sie einen Abschnitt 18 Stunden lang in 10 % gepuffertem Formin, gefolgt von 70 % Ethanol. Dieser Abschnitt kann für die H- und E-Färbung und/oder Immunhistochemie verwendet werden.
Frieren Sie die restlichen Abschnitte in flüssigem Stickstoff ein. Diese können in einem Gefrierschrank gelagert und für die D-N-A-R-N-A- und Proteinisolierung verwendet werden, um DNA aus einer gefrorenen Tumorprobe zu sammeln. Zuerst das Taschentuch mit einer Rasierklinge fein hacken.
Als nächstes verdauen Sie das Gewebe in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Zelllysepuffer und fünf Mikrolitern à 20 Milligramm pro Milliliter. Protease-K-Lösung durchströmen Sie die Mischung gründlich und fahren Sie mit einer Standard-DNA-Extraktion auf Isopropanol-Basis fort. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Linker in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen glühen.
Mischen Sie 50 Mikroliter jeder Linkerlösung mit zwei Mikrolitern konzentriertem Natriumchlorid. Legen Sie dann das Rohr in einen 95 Grad Celsius heißen Block. Schalten Sie nach fünf Minuten die Hitze aus und lassen Sie sie langsam auf Raumtemperatur abkühlen, was nach dem Abkühlen eine Stunde oder länger dauern kann.
Die analen Linker können bis zur Verwendung im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Bereiten Sie 2 96-Well-Platten vor, indem Ali ein Mikrogramm DNA aus jeder Probe in die entsprechenden Wells in beiden 96-Well-Platten zitiert. Geben Sie beispielsweise ein Mikrogramm DNA aus der ersten Probe in die Vertiefung A einer der beiden Vertiefungsplatten.
Die DNA in einer der 96-Well-Platten wird mit dem rechten Enzym NLA drei verdaut und die DNA-Proben in der anderen 96-Well-Platte mit dem linken Enzym BFA eins verdaut. Lassen Sie die DNA über Nacht bei 37 Grad Celsius verdaut werden. Beenden Sie am nächsten Tag die Verdauung durch Hitze und inaktivieren Sie die Enzyme für 20 Minuten.
Säubern Sie nun die Verdauungsreaktionen mit einer Mini-Beuteplatte mit 96 Vertiefungen. Übertragen Sie mit der Mehrkanalpipette jede Probe auf die Mini-Beute. 96-Well-Platte.
Platzieren Sie die Mini Loot 96-Well-Platte in einem Vakuumverteiler. Wenden Sie ein Vakuum auf die Platte an, bis die Vertiefungen trocken aussehen. In der Regel 15 Minuten Während dieses Protokolls.
Es muss sehr darauf geachtet werden, dass Ihre Proben nicht kontaminiert werden. Wenn Sie mit 96 arbeiten, halten Well-Platten die Wells so weit wie möglich mit Kappen bedeckt und vermeiden Sie es, Ihre Pipette über offene Wells zu führen, da jeder Tropfen unerwünschter Flüssigkeit die Probe ruinieren kann. Nehmen Sie die Mini-Loot-Platte aus dem Vakuumverteiler und blockieren Sie den Boden der Platte mit einem Papiertuch, bis er vollständig trocken ist.
Resuspendieren Sie die DNA in der Mini-Beuteplatte mit 96 Vertiefungen, indem Sie jeweils 30 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Platzieren Sie die Mini-Beuteplatte auf einem Orbitalschüttler, der zwei Minuten lang auf hoch eingestellt ist.
Übertrage als Nächstes den Inhalt der Mini-Beuteplatte auf eine saubere 96-Well-Platte. Zur Durchführung der Linker-Ligationsreaktionen. Bereiten Sie die Ligationsreaktion vor, indem eine ausreichende Menge Ligationspuffer, ein geknieter Linker aus Schritt 3.2 T vier DNA-Ligase und Wasser in einem Reagenzreservoir gemischt wird.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter verdauter DNA aus dem vorherigen Schritt in eine neue 96-Well-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter der Ligationsreaktion in alle Vertiefungen der 96-Well-Platte zu geben. Schließlich wurden die Wells mit DNA- und Ligationsreagenzien beladen.
Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bis über Nacht bei 16 Grad Celsius. Am nächsten Morgen. Beenden Sie die Ligatur, indem Sie die T-vier-Ligase bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren.
Reinigen Sie die Ligationsreaktion wie zuvor mit Mini-Beuteplatten und einem Vakuumverteiler, um die Platte zu trocknen, und tupfen Sie dann den Boden der Platte ab, bis er vollständig trocken ist. Resuspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Zwei Minuten lang auf einen Orbitalschüttler legen und dann den Inhalt des Mini-Beutetellers auf einen sauberen Teller geben.
Führen Sie als Nächstes einen zweiten DNA-Verdau mit bam H one durch, um die verbleibenden Konkat-Transposons zu zerstören. Verdauen Sie die DNA bei 37 Grad Celsius für drei bis sechs Stunden oder über Nacht, und dann wird die Verdauung mit Mini-Beuteplatten nach dem gleichen Verfahren wie zuvor gereinigt. Führen Sie eine 30-Zyklus-PCR mit einem Primer durch, der spezifisch für das Transponieren ist, und einem Primer, der spezifisch für den Linker ist.
Die Reaktion sollte drei Mikroliter der verdauten DNA mit Linkern enthalten. Bereinigen Sie als Nächstes die PCR-Reaktion mit Mini-Beute. 96-Well-Platten und ein Vakuumverteiler wie zuvor durchgeführt.
Resuspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern Wasser und übertragen Sie die Suspensionen auf eine saubere 96. Gut gespielt gehen Sie vor, indem Sie zwei Mikroliter der PCR-Reaktionsprodukte mit nur zwei Mikrolitern der verdünnten Produkte in 148 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser verdünnen. Führen Sie 30-Zyklus-PCRs mit verschachtelten Versionen der Primer in einem Volumen von 100 Mikrolitern durch.
Diese Grundierungen sind für die Illumina GA two X Maschine. Jede Probe hat einen eindeutigen Barcode von 12 Basenpaaren aus dem PCR-Lauf, 45 Mikroliter jedes Produkts auf einem 1%-Gel mit AUM-Bromid. Es sollte ein Abstrich von PCR-Produkten vorhanden sein, die Amplikons der vielen verschiedenen Transposon-Insertionen im Tumor darstellen.
Verwenden Sie die zuvor beschriebene Vakuumwaschmethode, um die restlichen 50 Mikroliter PCR zu reinigen, resuspendieren Sie dann die DNA in 50 Mikrolitern Wasser und führen Sie die Vakuumreinigung erneut durch. Resusieren Sie nun, suspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern TE und übertragen Sie sie auf eine saubere 96-Well-Platte. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration in jeder Probe.
Kombinieren Sie dann die gleichen Mengen an DNA aus jeder Probe in einem einzigen Röhrchen. Es ist möglich, mehrere hundert DNA-Proben in einer einzigen Spur eines Illumina-Laufs zu sequenzieren, solange jede Probe mit einem eindeutigen Barcode-Primer unter Verwendung des Protokolls erzeugt wurde. Ein erfolgreiches L-M-P-C-R sollte Hunderte von Transponierungen an Insertionen in einem einzelnen Tumor amplifizieren, nachdem die Hälfte des sekundären PCR-Produkts auf einem 1%-Gel ausgeführt wurde, ein DNA-Abstrich stellt diese Amplifikation dar.
Wenn die LM-PCR nicht erfolgreich ist, fehlt der DNA-Abstrich. Stattdessen sehen Sie definitive DNA-Banden, die eine bis 200 Tumoren in einer einzigen Spur der Illumina GA Two X-Plattform sequenzieren, sollten über 30 Millionen Sequenzen mit jeweils 100 Basenpaaren erzeugen. Es ist wichtig, daran zu denken, langsam und sorgfältig zu arbeiten, um sicherzustellen, dass nach diesem Verfahren keine Kontamination auftritt.
Die Analyse neu entdeckter genetischer Treiber von Krebs kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Welche dieser Treiber könnten für die Therapie ins Visier genommen werden?
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung neuartiger Onkogene und Tumorsuppressorgene durch die Kartierung von Transposon-Insertionen in einem Mausmodell. Der Ansatz nutzt das Sleeping Beauty-Transposon als zufälligen Mutagen und ermöglicht die Entdeckung genetischer Krebstreiber.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Karzinogenese
- Genomkartierung
- Transposon-Biologie
Hintergrund
- Karzinogenese beinhaltet komplexe genetische Veränderungen.
- Transposons können als Werkzeuge für Mutagenese dienen.
- Die Identifizierung von Treibergen ist entscheidend für das Verständnis von Krebs.
- Linker-vermittelte PCR verbessert die Erkennung von Transposon-Insertionen.
Zweck der Studie
- Unbekannte Treiber der Tumorbildung zu identifizieren.
- Einen unvoreingenommenen genetischen Screening-Ansatz zu nutzen.
- Transposon-Insertionen in Tumor-DNA zu kartieren.
Verwendete Methoden
- Generierung von Tumoren in einem transgenen Mausmodell.
- Isolierung von Tumor-DNA aus geernteten Tumoren.
- Linker-vermittelte PCR zur Amplifikation von DNA-Proben.
- Sequenzierung und Analyse von Transposon-Insertionen.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Kandidaten-Tumor-Treibergenen.
- Neuartige Onkogene und Tumorsuppressorgene wurden entdeckt.
- Die Methode erwies sich als wirksam bei der Kartierung genetischer Veränderungen.
Schlussfolgerungen
- Das Sleeping Beauty-Transposon ist ein wertvolles Werkzeug für die Krebsforschung.
- Diese Methode ermöglicht die unvoreingenommene Identifizierung genetischer Treiber.
- Zukünftige Studien können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um Krebsmechanismen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Identifying genetic drivers of cancer remains a critical challenge in early discovery due to high background noise from passenger mutations. The Sleeping Beauty transposon system combined with linker-mediated PCR enables unbiased forward genetic screens in mice to pinpoint candidate oncogenes and tumor suppressor genes. This approach supports target validation by reducing mechanistic ambiguity and improving predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through functional mutagenesis in vivo.
- Operational Value: Directs transposition to specific cell types using Cre-lox systems for tissue-specific target validation.
- Predictive Value: Identifies genes within common insertion sites as high-confidence cancer drivers for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates hundreds of distinct amplicons per tumor representing transposon insertion sites for downstream analysis.
- Reproducibility: Uses standardized linker-mediated PCR and nested PCR steps to ensure consistent detection across samples.
- Scalability: Supports multiplexed sequencing of hundreds of tumor samples in a single Illumina lane via barcoded primers.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models genetic heterogeneity observed in human tumors by capturing diverse insertion profiles across multiple tumors.
- Translational Continuity: Links discovery-phase mutagenesis to preclinical validation by identifying genes amenable to therapeutic targeting.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes driver from passenger mutations through statistical analysis of common insertion sites.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification by providing genetically validated targets from in vivo screens.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via unbiased forward genetic screens that reduce background noise from passenger mutations.
- Screening: Delivers assay-ready DNA samples with quantitative outputs suitable for insertion site mapping and sequencing.
- Analytics: Enables statistical identification of common insertion sites to prioritize candidate cancer genes.
- Translational Research: Connects in vivo mutagenesis to target validation by revealing genes with potential therapeutic relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic screening across multiple cancer models and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by linking transposon insertions to tumorigenic potential.
- Operational Value: Standardizes detection of transposon insertions through optimized linker-mediated PCR workflows.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing in vivo functional evidence for target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by distinguishing driver genes from genomic background.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse genetics, transposon biology, and molecular biology techniques.
- Dependent on access to PCR instrumentation, gel electrophoresis, and sequencing platforms.
- Necessitates standardized protocols for DNA isolation, linker annealing, and enzymatic digestion across sample sets.
- Involves adaptation considerations when applying the system to different Cre driver lines or tumor models.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient tumor yield and careful avoidance of cross-contamination during multi-step processing.
