Name: Identifizierung von Dornröschen Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen durch Kartierung von Sleeping Beauty Transposon-Insertionen in Maus-Tumoren mittels Linker-vermittelter PCR.

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Die Autoren bedanken sich bei Branden Moriarity, David Largaespada und Vincent Keng an der University of Minnesota danken und Adam Dupuy an der University of Iowa für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des oben beschriebenen Protokoll.

Ein. Zucht und Altern von transgenen Tieren <ol><li> Wählen Sie die Stämme von transgenen Mäusen für Ihre Experiment. Ein typisches Experiment werden drei transgenen Linien; ein bedingter Transposase Maus, eine Maus beherbergen ein Konkatamer von Transposons, und eine Maus die Cre-Rekombinase in den Zellen vermutlich die Zellen des Ursprungs für die gewünschte Krebs. Wenn sich der Krebs zu modellierenden weist eine bekannte Mutation in einem großen Prozentsatz der Patienten kann es erwünscht sein, diese Mutation zu Beginn umfassen. Beispiele für diese &quot;prädisponierenden&quot; Mutationen sind aktiviert Kras, dominant negative TP53 oder eine floxed Pten Allel. Durch die Zugabe in einer prädisponierenden Mutation kann das Modell besser repräsentieren die menschliche Krebs (siehe 1.3). Mehrere Sleeping Beauty Transposase und Transposon-Mäuse sind von der National Cancer Institute Maus Repository (verfügbar <a href="http://mouse.ncifcrf.gov/" target="_blank">http://mouse.ncifcrf.gov/</a> ). </li><li> Breed bedingte Transposase Mäuse mit Mäusen beherbergt die Transposons, um schließlich zu erhalten Mäusen homozygot für beide Allele, wenn möglich. Breed homozygote Nachkommen zu Mäusen, die Cre-Rekombinase Ihre dreifach transgene Versuchsmäusen (Abbildung 2) zu erzeugen. Hinweis: Beziehen homozygote Mäuse sind nicht immer möglich oder ideal. Beispielsweise sind homozygot p53 dominant negative Mäusen viel schwieriger als heterozygote Mäuse zu züchten. Darüber hinaus ist es hilfreich, um sicherzustellen, dass Würfe Mendelschen Genetik folgen, um zu bestätigen, dass die Züchtungsschema erfolgreich ist. </li><li> Bei Verwendung einer Prädisposition Hintergrund, erste Rasse Mäuse mit der Transposase an Mäusen mit dem prädisponierende Allel. Gleichzeitig Ausdruck Rasse Mäusen Cre-Rekombinase, um Mäuse, die Transposons. Erstellen homozygote Mäuse für jedes Allel, wenn möglich. Schließlich züchten die homozygote Nachkommen aus den beiden vorangegangenen Zuchtprogramme zu vervierfachen transgenen experimentellen anim erzeugenALS. </li><li> Neben den Versuchstieren, erzeugen Kontrollkohorten von Mäusen. Die Kontrollgruppe besteht normalerweise aus Wurfgeschwistern aus dem experimentellen Zucht, die nur erben zwei der drei Allele (Abbildung 2). Im Falle eines prädisponiert Hintergrund wird Mäusen einschließlich drei der vier Allele auch notwendig sein. </li><li> Überwachen Versuchs-und Kontrollmäusen täglich für Tumor-Entwicklung und / oder Siechtum. Folgen Sie Ihrem institutionelle Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) Anforderungen für die Tierhaltung. Auch ist es üblich, ein Alter, in dem man ein Tier zu opfern, wenn es nicht noch geworden moribund bestimmen. Achtzehn Monate ist ein typisches Alter, in dem Mäuse eingeschläfert. </li></ol> 2. Necropsy transgener Tiere <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Sure-Seal Induction Kammer </td><td> Gehirn-Baum Scientific </td><td> EZ-177 </td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td></tr><tr><td> 10% gepuffertem Formalin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien benötigt. <ol><li> Wenn eine Maus moribund ist oder hat das Ende des ermittelten Lebensdauer, einschläfern Tier mit einem CO 2-Kammer nach Ihrer IACUC Richtlinien. Generell stellen das Tier in einer Reingaskammer, öffnen Sie den Gastank und stellen Sie den Regler auf nicht höher als 5 Pfund pro Quadratzoll zu lesen. Füllen Sie langsam auf Nasen-und Augenreizungen und Abneigung gegen CO 2 zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass das Tier das Herz nicht mehr schlagen und reagiert nicht, wenn in den Augen berührt. </li><li> Spray Äußeren geopfert Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Bewegen Sie die Maus auf einer Autopsie Bord und befestigen Sie sie mit Sezieren Pins. Mit einer Schere eind Pinzette zu öffnen Maus und Organe entnehmen. Die Festlegung, welche Organe sollten gesammelt werden ist ein Projekt abhängig. Es wird jedoch empfohlen, immer sammeln die Milz und Leber als diese Organe geben oft wichtige Einblick, warum die Maus war moribund. Sammeln Sie auch das Brustbein zur Potenzialanalyse von Knochenmark. Darüber hinaus ist es immer günstig für jedes Organ oder Gewebe, das abnormale erscheint sammeln. </li><li> Geweben und Tumoren, die gesammelt werden sollte in vier Abschnitte unterteilt werden. Ein Abschnitt wird in 10% gepuffertem Formalin für 18 Stunden um 70% Ethanol. Dieser Abschnitt kann für H &amp; E-Färbung und / oder IHC eingesetzt werden. Die verbleibenden drei Abschnitten, die im allgemeinen 50 bis 100 mg in der Größe sind Schnappverbindung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Diese können für die DNA-, RNA-und Protein-Isolierung verwendet werden. </li><li> Entsorgen Karkasse und dem restlichen Gewebe nach IACUC Richtlinien. </li></ol> 3. Isolieren genomischer DNA aus Tumoren <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;strong&gt; Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Protein Precipitation Lösung </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td></tr><tr><td> Zelllysepuffer </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td></tr><tr><td> TE-Puffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien benötigt. <ol><li> Fein zerkleinern das gefrorene Tumorprobe (50 bis 100 mg) mit einem sauberen Rasierklinge. </li><li> Ort zerkleinert Gewebe in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml der Zell-Lyse-Puffer mit 5 ul Proteinase K-Lösung (20 mg / ml). </li><li> Vortex gründlich. </li><li> Inkubieren in einem 55 ° C Schüttler bei 250 rpm eingestellt für mindestens 4 Stunden, am besten über Nacht. </li><li> Fügen Sie 1 ul RNase A-Lösung (10 mg / ml) und invertieren Rohr 25 mal. </li><li> Bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Abkühlen auf Raumtemperatur durch Anordnen auf Eis für 3 min. </li><li> Fügen Sie 333 ul Protein Precipitation Lösung und Vortex kräftig. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 rpm 10 min. Proteine ​​sollten Pellet. Wenn Pellet ist sehr klein, Wirbel wieder auf Eis inkubieren für 5 min und dann re-Zentrifuge. </li><li> Giesst Überstand enthaltende DNA in ein sauberes 15-ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen gleichen Volumen 100% Isopropanol und mischen durch vorsichtiges Umdrehen 50 mal. </li><li> Zentrifuge bei 3.500 rpm für 3 min. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml 70% Ethanol und invertieren Röhrchen mehrmals um das Pellet zu waschen. </li><li> Übertragen des gewaschenen Pellet zusammen mit dem Ethanol zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 14.000 UpM für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Abgießen Ethanol und invertieren Rohr an der Luft trocknen (ca. 5 bis 30 min). </li><li> Resuspendieren DNA pEllet in 50 bis 500 ul TE je nach Größe der DNA-Pellet. </li><li> Optional Inkubation bei 37 ° C zu resuspendieren DNA. </li><li> Lagerung bei 4 ° C oder -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li></ol> 4. Linker Mediated-PCR unter Verwendung von genomischer DNA aus Tumoren <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> BfaI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td></tr><tr><td> MinElute Platten mit 96 Vertiefungen </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vakuumkammer </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td></tr><tr><td> Multi-MicroPlate Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc. </td><td> SI-4000 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase mit 5x Ligationspuffer </td><td> Invitrogen </td><html><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td></tr><tr><td> 25 mM dNTPs </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td> 10966-034 </td></tr><tr><td> FastStart Taq DNA Polymerase </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td></tr><tr><td> TAE-Puffer </td><td> Promega </td><td> V4271 </td></tr><tr><td> TE-Puffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td> Promega </td><td> H5041 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Reagenzien benötigt. Linkersequenzen BfaI Linker + 5 &#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC 3&#39; BfaI Linker-5 &#39;-Phos TAGTCCCTTAAGCGGAG 3&#39;NH2 &quot;&gt; Linker NlaIII + 5&#39;GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGACCATG 3 &#39; NlaIII Linker-5 &#39;-Phos GTCCCTTAAGCGGAGCC 3&#39; Primersequenzen Primäre PCR vorne rechts (NlaIII): Spl IRDR R1 1 GCTTGTGGAAGGCTACTCGAAATGTTTGACCC Primäre PCR vorne links (bfai): Spl IRDR L1 1 CTGGAATTTTCCAAGCTGTTTAAAGGCACAGTCAAC Primäre PCR Reverse sowohl für links und rechts: Spl Link1 1 GTAATACGACTCACTATAGGGC Sekundären PCR vorderen rechten Seite: Beispiel einer Illumina strichcodierten sekundären Primer 5 &#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaGgtgtatgtaaacttccgacttcaa (Ns Die Betreiber der 12 bp Barcode-Sequenz in Großbuchstaben sind für die Plattform erforderlich Illumina und die Sequenz in Kleinbuchstaben wird dem Transposon binden.) Sekundäre PCR vorne links: Beispiel einer Illumina strichcodiert gebrauchtdary Primer 5&#39;AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNaAgtgtatgtaaacttccgacttcaa (Ns Die Betreiber der 12 bp Barcode-Sequenz in Großbuchstaben sind für die Plattform erforderlich Illumina und die Sequenz in Kleinbuchstaben wird dem Transposon binden.) Sekundäre PCR Reverse sowohl für links und rechts: Linker verschachtelte Rückwärtsprimer 5 &#39;CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTAGGGCTCCGCTTAAGGGAC <ol><li> Glühen die + und - Linker für beide BfaI Linker und NlaII Linker durch Mischen von 50 ul von Linker + (100 uM) mit 50 ul Linker-(100 uM) und fügen Sie 2 ul NaCl (5 M) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Place in 95 ° C Heizblock für 5 min. Schalten Sie Heizblock und lassen sich langsam auf Raumtemperatur abkühlen (dies dauert eine Stunde oder mehr). Nach dem Abkühlen kann geglühten Linker in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert werden, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie zwei Aliquots der Tumor-DNA, jedes Aliquot mit 1 ug DNA. Ein Aliquot wird wit verdaut werdenha Restriktionsenzym, das in der Nähe des &quot;richtigen&quot; Ende des Transposons geschnitten wird. Das zweite Aliquot wird mit einem Restriktionsenzym, das in der Nähe des &quot;linken&quot; Ende des Transposons schneidet verdaut werden. Dies geschieht, um die Chancen Verstärken jedes Transposon Insertionsstelle maximieren. </li><li> Verdauen die Tumor-DNA in einem aliquoten mit der &quot;richtigen&quot; Seite Enzym NlaII und verdauen die Tumor-DNA in der anderen Aliquot mit der &quot;linken&quot; Seite Enzym BfaI: Kombinieren Sie 1 ul Enzym, 5 ul 10x NEB Buffer # 4, DNA ( 1 ug) und ddH 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 ul. Ausgewählte DNA über Nacht bei 37 ° C im Wasserbad oder Inkubator. </li><li> Hitzeeinwirkung deaktivieren Enzyme (BfaI = 80 ° C für 20 min, NlaIII = 65 ° C für 20 min). </li><li> Reinigen Sie die verdauten Proben, indem Proben in MinElute 96-Well-Platte, schauen Platzteller in Vakuumkammer und Vakuum für ca. 15 min bis zum Brunnen trocken. </li><li> Entfernen Platte von Vakuum-Verteiler und blot unteren 96-Well-Platte mit einem Papiertuch, um alle liqui entfernend </li><li> Fügen Sie 30 ul ddH 2 O in jede Vertiefung und schütteln auf einem Orbitalschüttler Satz auf hoch für 2 min, oder und Abpipettieren 20 bis 40 mal. </li><li> Übertragen gesamte Volumen in Brunnen (30 ul) von MinElute 96-Well-Platte in einen sauberen 96-Well-Platten. </li><li> Führen Linkerligation Reaktionen mit verdaute DNA von Schritt 4,8 und Linker von Schritt 4,1. Mix 10 ul verdaute DNA, 4 ul 5x Ligationspuffer 5,5 ul geglüht Linker (950 ug / ul), 0,5 ul T4-Ligase (5 U / ul). </li><li> Inkubieren für 4 Stunden bis über Nacht bei 16 ° C. </li><li> Erhitzen inaktivieren die T4-DNA-Ligase bei 65 ° C für 10 min. </li><li> Clean up Ligation mit MinElute 96-Well-Platten und eine Vakuumkammer wie in den Schritten 4.5 beschrieben - 4,6. </li><li> Resuspendieren in 30 ul H 2 O und übertragen auf eine saubere 96-Well-Platte. </li><li> Führen Sie eine zweite DNA-Verdau, um zu zerstören verbleibenden Konkatamer Transposons. Dies wird durch das Schneiden der DNA ein zweites Mal unter Verwendung eines Enzyms, das die Plasmid v schneidet erreichtektor DNA, die verwendet werden, um die transgenen Mäuse der das Transposon enthaltenden Konkatamer erstellen. </li><li> Ausgewählte DNA mit BamHI (links und rechts): Mix von 25 ul Linker-ligierten DNA aus Schritt 4,13, 5 ul 10x NEB Puffer Nr. 3, 0,5 ul BamHI (20 U / ul), 0,5 ul BSA (10 mg / ml ) und 19 ul ddH 2 O. </li><li> Ausgewählte 3-6 Stunden oder über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Führen primären PCR unter Verwendung eines Primers spezifisch für das Transposon und einem Primer, die spezifisch für den Linker. Diese variieren je nachdem, was Transposon und Linker die Sie verwenden. Die Primer in dem Primer obigen Tabelle für die Arbeit und T2/Onc T2/Onc2 Transposons aufgeführt. </li><li> Primäre PCR: 5 ul 10x Puffer, 2,0 ul MgCl2 (50 mM), 4 ul dNTPs (2,5 nM), 1 ul Primer 1 (20 uM), 1 ul Primer 2 (20 uM), 0,25 ul Platinum Taq (5 U / ul), 3 ul verdaute DNA mit Linker (Betrag kann variieren) bis zu 50 ul ddH 2 O. </li><li> PCR-Programm: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 60 &amp; d.zB, C für 30 sec, 72 ° C für 90 sek. Abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min. </li><li> Bereinigen PCR-Produkt unter Verwendung MinElute 96 Well Platten und einen Vakuumverteiler, wie oben beschrieben. </li><li> Resuspendieren in 30 ul H 2 O und übertragen auf eine saubere 96-Well-Platte. </li><li> Einen 1:75 Verdünnung der 1 ° PCR durch Verdünnen von 2 ul DNA aus Schritt in 148 ul 4,21 ddH 2 O </li><li> Führen sekundären PCR unter Verwendung verschachtelte Versionen der Primer, der auch die erforderliche Sequenz für das Illumina GAIIx Maschine sowie eine 12 Basenpaar Barcode, der einzigartig für jede Tumorprobe verarbeitet (siehe Tabelle oben Primer für Beispiele dieser Primer) ist. </li><li> Sekundäre PCR: 10 ul 10x Puffer mit MgCl2, 8 ul dNTPs (2,5 mM), 1 ul Illumina strichcodiert sekundären Primer (20 uM), 1 ul Illumina Nest 1 sekundäre Primer (20 uM), 0,25 ul FastStart Taq (5 U / ul ), 2 ul DNA aus verdünnten primären PCR 1:75, bis 100 ul ddH 2 O. </li><li> PCR-Programm: 94 °, C für 2 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 30 sec, 53 ° C für 45 sec, 72 ° C für 90 sek. Abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min. </li><li> Ausführen 45 ul dieser PCR-Reaktion auf einem 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,5 mg / ml). Es sollte ein &quot;schmieren&quot; von PCR-Produkten vertreten Amplikons der vielen verschiedenen Transposon-Insertionen in den Tumor (Abbildung 3). </li><li> Bereinigen restlichen 50 ul PCR-Produkt unter Verwendung MinElute 96 Well Platten und einen Vakuumverteiler, wie oben beschrieben. Waschen einer Zeit, indem 50 pl ddH 2 O in den Vertiefungen und Absaugen wieder. </li><li> Resuspendieren in 30 ul TE und übertragen auf eine saubere 96-Well-Platte. </li><li> Bestimmung der Konzentration von DNA in jeder Probe. Kombinieren gleiche Mengen an DNA in einer einzelnen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Dies wird die Bibliothek, die in einem einzigen Spur einer Illumina HiSeq 2000 Maschine sequenziert werden. Es ist möglich, mehrere hundert Tumoren Sequenz in einer einzelnen Spur einer Illumina Lauf. </li><li> Einreichendie einzelnen Röhrchen mit gleichen Mengen von DNA aus allen Tumoren zur Sequenzierung. Dies kann durch Ihre Institution oder kommerziell durchgeführt werden. </li></ol> 5. Analyse der Transposon Insertions <ol><li> Software zur Analyse von Transposon-Insertion Daten verfügbar zum kostenlosen Download via SourceForge ( <a href="http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/" target="_blank">http://sourceforge.net/projects/tapdancebio/</a> ). Das Programm, genannt Tapdance erfordert die Sequenz-Datei von der Illumina-Plattform und einem Barcode-Bibliothek Karte Textdatei. </li></ol>

<ol><li>Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+for+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic model for colorectal tumorigenesis.</a> Cell. 61, 759-767 (1990).</li>
<li>Wood, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Landscapes+of+Human+Breast+and+Colorectal+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers.</a> Science. 318, 1108-1113 (2007).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+Transposon+from+Fish%2C+and+Its+Transposition+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Starr, T. K., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon.</a> Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).</li>
<li>Mueller, P. R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Footprinting+of+a+Muscle+Specific+Enhancer+by+Ligation+Mediated+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR.</a> Science. 246, 780-786 (1989).</li>
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<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+transposons+for+cancer+gene+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Harnessing transposons for cancer gene discovery.</a> Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).</li>
<li>Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+solid+tumours+using+transposon-based+somatic+mutagenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.</a> Nature. 436, 272-276 (2005).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323, 1747-1750 (2009).</li>
<li>Keng, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditional+transposon-based+insertional+mutagenesis+screen+for+genes+associated+with+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma.</a> Nature. 27, 264-274 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+mutagenesis+using+a+highly+mobile+somatic+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system.</a> Nature. 436, 221-226 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine vorausschauende genetische Bildschirm mit dem Dornröschen Transposon-System bietet eine Methode zur Identifizierung von Mutationen, die Krebs verursachen. Durch Auswahl des geeigneten Promotors mit Cre-Rekombinase zusätzlich zu irgendwelchen Mutationen prädisponierende steuern, wird der Bildschirm zu identifizieren SB bekannten und neuartigen Kandidaten Krebsgene. Der Erfolg einer SB-Bildschirm ist weitgehend abhängig von den Mäusen für die Erstellung des Bildschirms a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Sure-Seal Induction Kammer </td><td> Gehirn-Baum Scientific </td><td> EZ-177 </td><td></td></tr><tr><td> Cryovial </td><td> Bioexpress </td><td> C-3355-2 </td><td></td></tr><tr><td> 10% gepuffertem Formalin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> HT501128-4L </td><td></td></tr><tr><td> Protein Precipitation Lösung </td><td> Qiagen </td><td> 158910 </td><td></td></tr><tr><td> Zelllysepuffer </td><td> Qiagen </td><td> 158906 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Qiagen </td><td> 158920 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Qiagen </td><td> 158924 </td><td></td></tr><tr><td> TE-Puffer </td> &lt;td&gt; Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> BfaI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0568S </td><td></td></tr><tr><td> NlaIII </td><td> New England Biolabs </td><td> R0125S </td><td></td></tr><tr><td> MinElute Platten mit 96 Vertiefungen </td><td> Qiagen </td><td> 28051 </td><td></td></tr><tr><td> QIAvac 96 Vakuumkammer </td><td> Qiagen </td><td> 19504 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-MicroPlate Genie, 120V </td><td> Scientific Industries, Inc. </td><td> SI-4000 </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase mit 5x Ligationspuffer </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> New England Biolabs </td><td> R0136S </td><td></td></tr><tr><td> 25mM dNTPs </td><td> Bioexpress </td><td> C-5014-200 </td><td></td></tr><tr><td> Platinum Taq </td><td> Invitrogen </td><td&gt; 10966-034 </td><td></td></tr><tr><td> FastStart Taq DNA Polymerase </td><td> Roche </td><td> 12032929001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Promega </td><td> V3121 </td><td></td></tr><tr><td> TAE-Puffer </td><td> Promega </td><td> V4271 </td><td></td></tr><tr><td> TE-Puffer </td><td> Promega </td><td> V6232 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td> Promega </td><td> H5041 </td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von<em&gt; dornröschen</em&gt; transposon insertionen in solid tumors mit linker-vermittelte pcr

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomik, Proteomik, Transkriptom und epigenomischen Analysen von menschlichen Tumoren zeigen, dass es Tausende von Anomalien innerhalb der einzelnen Krebs-Genom im Vergleich zum angepassten normalem Gewebe. Basierend auf diesen Untersuchungen ist es offensichtlich, dass es viele unentdeckte genetischen Fahrer von Krebs ein. Leider sind diese Treiber sind in einer viel größeren Anzahl von Personen Anomalien im Genom, die nicht direkt zur Tumorbildung beitragen versteckt. Ein weiterer Aspekt der Krebsgenoms ist, dass es erhebliche genetische Heterogenität innerhalb ähnlicher Tumorarten. Jeder Tumor kann beherbergen verschiedene Mutationen, die einen selektiven Vorteil für die Tumorbildung 2 bereitzustellen. Durchführen eines unvoreingenommene vorne genetischen Screen bei Mäusen liefert die Werkzeuge, um Tumore zu generieren und zu analysieren, ihre genetische Zusammensetzung, bei gleichzeitiger Reduzierung der Hintergrund der Passagier Mutationen. The Sleeping Beauty (SB) Transposonsystem ist eine solche Methode 3. Das SB-System nutzt mobilen vektoren (Transposons), die über das Genom von der Transposase-Enzym eingesetzt werden kann. Mutationen werden auf einen bestimmten Zelltyp durch die Verwendung eines bedingten Transposase-Allel, die durch Cre-Rekombinase aktiviert ist begrenzt. Viele Mauslinien bestehen, dass ausdrückliche Cre-Rekombinase in bestimmten Geweben. Durch die Kreuzung eine dieser Leitungen zu dem bedingten Transposase Allels (zB Lox-Stop-Lox-SB11) wird der SB-System nur in Zellen, die Cre-Rekombinase ausdrückliche aktiviert. Die Cre-Rekombinase wird verbrauchsteuerpflichtigen einen Anschlag Kassette dass Blöcke Expression der Transposase-Allel und aktiviert damit Transposon-Mutagenese innerhalb der bezeichneten Zelltyp. Ein SB-Bildschirm wird durch Züchtung drei Stämmen von transgenen Mäusen eingeleitet, so dass die experimentelle Mäuse eine bedingte Transposase-Allel, ein Konkatamer von Transposons, und einen Gewebe-spezifischen Rekombinase Cre-Allel tragen. Diese Mäuse sind auf das Alter, bis die Tumoren Form erlaubt und werden sie verenden. Die Mäuse werden dannseziert und genomische DNA wird aus den Tumoren isoliert. Als nächstes wird die genomische DNA-Linker-vermittelten-PCR unterzogen (LM-PCR), die zu Amplifikation von genomischen Loci, die ein Transposon SB. LM-PCR durchgeführt auf einem einzigen Tumor in Hunderten von verschiedenen Amplikons, die die Hunderte von genomischen Loci mit Transposon-Insertionen in einem Tumor 4 führen. Die Transposon-Insertionen in allen Tumoren analysiert und gemeinsame Insertionsstellen (CISS) identifiziert werden unter Verwendung eines geeigneten statistischen Methode 5. Gene innerhalb der GUS sind sehr wahrscheinlich Onkogene oder Tumor-Suppressor-Gene, und gelten als Kandidaten Krebsgene. Die Vorteile der Verwendung des Systems, um Kandidaten SB Krebsgene identifiziert sind: 1) das Transposon kann leicht im Genom lokalisiert werden, weil seine Sequenz bekannt ist, 2) die Umsetzung kann auf nahezu jeden Zelltyp gerichtet sein und 3) das Transposon in der Lage ist Einführung sowohl Gewinn-und Verlust-of-function Mutationen 6. Die following Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung und Umsetzung eine vorausschauende genetische Bildschirm mit dem SB Transposon System Kandidaten Krebsgene (Abbildung 1) zu identifizieren.

Nach dem Züchtungsschema festgestellt wurde, sollten Züchter produzieren einen Wurf alle 19-21 Tage. Wurfgröße variiert zwischen 5 und 12 Welpen, je nach dem Alter der Züchter und den genetischen Hintergrund. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass der Genotyp des Wurfes Mendelschen Genetik folgt als einen Weg, um zu bestätigen, dass die Züchtungsschema als richtig und erfolgreich ist. Für das Experiment erfolgreich zu sein, sollte Tumorinzidenz bei den Versuchstieren deutlich größer sein al...

Verfahren zur Identifizierung unbekannter Fahrer von Karzinogenese Verwendung eines unvoreingenommene Ansatz beschrieben. Das Verfahren verwendet das<em&gt; Dornröschen</em&gt; Transposon als eine zufällige Mutagen auf spezifische Gewebe. Genomic Mapping von Transposon-Insertionen, die Tumorbildung zu fahren identifiziert neue Onkogene und Tumor-Suppressor-Gene

Identifizierung von<em&gt; Dornröschen</em&gt; Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Dieses Verfahren zeigt, wie neue Onkogene und Tumorsuppressorgene identifiziert werden können, indem die Transponierung auf Insertionen in der Maus kartiert wird, die die Tumorbildung vorantreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst Tumore aus dem transgenen Mausmodell erzeugt und geerntet werden. Die nächsten Schritte des Verfahrens bestehen darin, die Tumor-DNA zu isolieren, eine Linker-vermittelte PCR durchzuführen, dann die amplifizierten DNA-Proben zu sequenzieren und die Transponierung bei Insertionen zu analysieren.Letztendlich identifiziert das Verfahren Kandidatengene für Tumortreiber. Der Hauptvorteil der Verwendung von Linker-vermittelter PCR in Verbindung mit einem unvoreingenommenen genetischen Screening unter Verwendung von Dornröschen-Transposons besteht darin, dass wir neue genetische Treiber von Krebs leicht identifizieren können. Beginnen Sie das Sezieren immer damit, dass Sie das Äußere der geopferten Maus mit 70%igem Ethanol besprühen.Die entnommenen Gewebe und Tumoren sollten in vier Abschnitte mit einer Größe von 50 bis 100 Milligramm unterteilt werden. Fixieren Sie einen Abschnitt 18 Stunden lang in 10 % gepuffertem Formin, gefolgt von 70 % Ethanol. Dieser Abschnitt kann für die H- und E-Färbung und/oder Immunhistochemie verwendet werden.Frieren Sie die restlichen Abschnitte in flüssigem Stickstoff ein. Diese können in einem Gefrierschrank gelagert und für die D-N-A-R-N-A- und Proteinisolierung verwendet werden, um DNA aus einer gefrorenen Tumorprobe zu sammeln. Zuerst das Taschentuch mit einer Rasierklinge fein hacken.Als nächstes verdauen Sie das Gewebe in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Zelllysepuffer und fünf Mikrolitern à 20 Milligramm pro Milliliter. Protease-K-Lösung durchströmen Sie die Mischung gründlich und fahren Sie mit einer Standard-DNA-Extraktion auf Isopropanol-Basis fort. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Linker in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen glühen.Mischen Sie 50 Mikroliter jeder Linkerlösung mit zwei Mikrolitern konzentriertem Natriumchlorid. Legen Sie dann das Rohr in einen 95 Grad Celsius heißen Block. Schalten Sie nach fünf Minuten die Hitze aus und lassen Sie sie langsam auf Raumtemperatur abkühlen, was nach dem Abkühlen eine Stunde oder länger dauern kann.Die analen Linker können bis zur Verwendung im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Bereiten Sie 2 96-Well-Platten vor, indem Ali ein Mikrogramm DNA aus jeder Probe in die entsprechenden Wells in beiden 96-Well-Platten zitiert. Geben Sie beispielsweise ein Mikrogramm DNA aus der ersten Probe in die Vertiefung A einer der beiden Vertiefungsplatten.Die DNA in einer der 96-Well-Platten wird mit dem rechten Enzym NLA drei verdaut und die DNA-Proben in der anderen 96-Well-Platte mit dem linken Enzym BFA eins verdaut. Lassen Sie die DNA über Nacht bei 37 Grad Celsius verdaut werden. Beenden Sie am nächsten Tag die Verdauung durch Hitze und inaktivieren Sie die Enzyme für 20 Minuten.Säubern Sie nun die Verdauungsreaktionen mit einer Mini-Beuteplatte mit 96 Vertiefungen. Übertragen Sie mit der Mehrkanalpipette jede Probe auf die Mini-Beute. 96-Well-Platte.Platzieren Sie die Mini Loot 96-Well-Platte in einem Vakuumverteiler. Wenden Sie ein Vakuum auf die Platte an, bis die Vertiefungen trocken aussehen. In der Regel 15 Minuten Während dieses Protokolls.Es muss sehr darauf geachtet werden, dass Ihre Proben nicht kontaminiert werden. Wenn Sie mit 96 arbeiten, halten Well-Platten die Wells so weit wie möglich mit Kappen bedeckt und vermeiden Sie es, Ihre Pipette über offene Wells zu führen, da jeder Tropfen unerwünschter Flüssigkeit die Probe ruinieren kann. Nehmen Sie die Mini-Loot-Platte aus dem Vakuumverteiler und blockieren Sie den Boden der Platte mit einem Papiertuch, bis er vollständig trocken ist.Resuspendieren Sie die DNA in der Mini-Beuteplatte mit 96 Vertiefungen, indem Sie jeweils 30 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Platzieren Sie die Mini-Beuteplatte auf einem Orbitalschüttler, der zwei Minuten lang auf hoch eingestellt ist.Übertrage als Nächstes den Inhalt der Mini-Beuteplatte auf eine saubere 96-Well-Platte. Zur Durchführung der Linker-Ligationsreaktionen. Bereiten Sie die Ligationsreaktion vor, indem eine ausreichende Menge Ligationspuffer, ein geknieter Linker aus Schritt 3.2 T vier DNA-Ligase und Wasser in einem Reagenzreservoir gemischt wird.Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter verdauter DNA aus dem vorherigen Schritt in eine neue 96-Well-Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter der Ligationsreaktion in alle Vertiefungen der 96-Well-Platte zu geben. Schließlich wurden die Wells mit DNA- und Ligationsreagenzien beladen.Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bis über Nacht bei 16 Grad Celsius. Am nächsten Morgen. Beenden Sie die Ligatur, indem Sie die T-vier-Ligase bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren.Reinigen Sie die Ligationsreaktion wie zuvor mit Mini-Beuteplatten und einem Vakuumverteiler, um die Platte zu trocknen, und tupfen Sie dann den Boden der Platte ab, bis er vollständig trocken ist. Resuspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Zwei Minuten lang auf einen Orbitalschüttler legen und dann den Inhalt des Mini-Beutetellers auf einen sauberen Teller geben.Führen Sie als Nächstes einen zweiten DNA-Verdau mit bam H one durch, um die verbleibenden Konkat-Transposons zu zerstören. Verdauen Sie die DNA bei 37 Grad Celsius für drei bis sechs Stunden oder über Nacht, und dann wird die Verdauung mit Mini-Beuteplatten nach dem gleichen Verfahren wie zuvor gereinigt. Führen Sie eine 30-Zyklus-PCR mit einem Primer durch, der spezifisch für das Transponieren ist, und einem Primer, der spezifisch für den Linker ist.Die Reaktion sollte drei Mikroliter der verdauten DNA mit Linkern enthalten. Bereinigen Sie als Nächstes die PCR-Reaktion mit Mini-Beute. 96-Well-Platten und ein Vakuumverteiler wie zuvor durchgeführt.Resuspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern Wasser und übertragen Sie die Suspensionen auf eine saubere 96. Gut gespielt gehen Sie vor, indem Sie zwei Mikroliter der PCR-Reaktionsprodukte mit nur zwei Mikrolitern der verdünnten Produkte in 148 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser verdünnen. Führen Sie 30-Zyklus-PCRs mit verschachtelten Versionen der Primer in einem Volumen von 100 Mikrolitern durch.Diese Grundierungen sind für die Illumina GA two X Maschine. Jede Probe hat einen eindeutigen Barcode von 12 Basenpaaren aus dem PCR-Lauf, 45 Mikroliter jedes Produkts auf einem 1%-Gel mit AUM-Bromid. Es sollte ein Abstrich von PCR-Produkten vorhanden sein, die Amplikons der vielen verschiedenen Transposon-Insertionen im Tumor darstellen.Verwenden Sie die zuvor beschriebene Vakuumwaschmethode, um die restlichen 50 Mikroliter PCR zu reinigen, resuspendieren Sie dann die DNA in 50 Mikrolitern Wasser und führen Sie die Vakuumreinigung erneut durch. Resusieren Sie nun, suspendieren Sie die DNA in 30 Mikrolitern TE und übertragen Sie sie auf eine saubere 96-Well-Platte. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration in jeder Probe.Kombinieren Sie dann die gleichen Mengen an DNA aus jeder Probe in einem einzigen Röhrchen. Es ist möglich, mehrere hundert DNA-Proben in einer einzigen Spur eines Illumina-Laufs zu sequenzieren, solange jede Probe mit einem eindeutigen Barcode-Primer unter Verwendung des Protokolls erzeugt wurde. Ein erfolgreiches L-M-P-C-R sollte Hunderte von Transponierungen an Insertionen in einem einzelnen Tumor amplifizieren, nachdem die Hälfte des sekundären PCR-Produkts auf einem 1%-Gel ausgeführt wurde, ein DNA-Abstrich stellt diese Amplifikation dar.Wenn die LM-PCR nicht erfolgreich ist, fehlt der DNA-Abstrich. Stattdessen sehen Sie definitive DNA-Banden, die eine bis 200 Tumoren in einer einzigen Spur der Illumina GA Two X-Plattform sequenzieren, sollten über 30 Millionen Sequenzen mit jeweils 100 Basenpaaren erzeugen. Es ist wichtig, daran zu denken, langsam und sorgfältig zu arbeiten, um sicherzustellen, dass nach diesem Verfahren keine Kontamination auftritt.Die Analyse neu entdeckter genetischer Treiber von Krebs kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Welche dieser Treiber könnten für die Therapie ins Visier genommen werden?

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Forschung

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Medicine

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