Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung von Proteinkomplexen unter Verwendung des Multi-Back-Baula-Virus-Insektenzellsystems. Dies wird erreicht, indem zunächst das Multigenkonstrukt erzeugt wird, das für den Proteinkomplex der Wahl kodiert. Der zweite Schritt besteht darin, ein zusammengesetztes Baula-Virus herzustellen, das das Multi-Gen-Konstrukt enthält, indem Bakterienzellen transformiert und nach den richtigen hinteren Mitten gesucht wird.

Als nächstes isolieren Sie das Baula-Virusgenom und verwenden es, um Insektenzellen in kleinem Maßstab in einer Sechs-Well-Platte zu infizieren, nachdem Sie auf Proteinproduktion getestet haben. Der Proteinkomplex der Wahl wird in größerem Maßstab exprimiert und gereinigt. Letztendlich wird der gereinigte Proteinkomplex verwendet, um seine Struktur und Funktion zu entdecken und möglicherweise für die Wirkstoffforschung.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Echovirus-Systemen sind zweierlei. Die MultiPro-Komplexe können mit beispielloser Weise hergestellt werden. Außerdem ist das produzierte Material von viel höherer Qualität, da wir das Echovirus für eine optimale Proteinproduktion entwickeln.

Die Implikationen dieser Technik gehen weit über grundlegende biologische Fragen hinaus. Unsere Multi-Bag-Plattform wurde erfolgreich zur Herstellung von Proteinen eingesetzt, die vielversprechende neue Impfstoffkandidaten für eine Vielzahl von Krankheiten darstellen, und katalysiert die Krebsforschung, indem sie Schlüsselproteinanordnungen produziert, die das Tumorwachstum verursachen. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, ein wenig mit den Prozessen und der Notwendigkeit der Sterilität zu kämpfen haben.

Daher haben wir sehr hart daran gearbeitet, Standardarbeitsanweisungen zu etablieren, um die Anwendung von Multi-Bank für nicht spezialisierte Benutzer so einfach wie möglich zu gestalten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Roboterschritte viel leichter zu verstehen sind, wenn der Prozess in Bewegung gezeigt wird. Dies kann man nicht einfach durch einen Blick auf Protokolle extrahieren, die aufgeschrieben sind, egal wie detailliert sie sind.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, ist es wichtig, die Co-Expression-Strategie sorgfältig zu planen. Es wird empfohlen, das Experiment zunächst zu simulieren. In silico.

Gene müssen auf den Akzeptor- und Donorplasmiden verteilt werden. Am besten funktioniert es, Untereinheiten zu gruppieren, die physiologische Untermodule bilden können. Da große Komplexe viele Proteinuntereinheiten haben, müssen viele Gene gleichzeitig exprimiert werden.

Das Multi-Back-System vereinfacht die Klonierung von Genen erheblich, indem es automatisierte Routinen verwendet, um Gene in kleinen DNA-Vorläufermolekülen zu platzieren, die eine kurze DNA-Sequenz namens locks P enthalten, die vom Cree-Rekombinase-Enzym erkannt wird. Diese Vorläuferzellen werden dann in einer einstufigen Reaktion durch Zugabe von Prärekombinase kombiniert, die alles, was eine lox-P-Stelle hat, zu einem großen DNA-Plasmid verkettet. Dieses Multi-Gen-Konstrukt wird anschließend in das Genom des Multi-Back-Bula-Virus eingefügt.

Soll eine große Anzahl von Konstrukten generiert werden, empfiehlt sich der Einsatz von robotischen Skripten und einer Liquid-Handling-Workstation. Die Workstation ist mit einem Vakuum für Mini-Preps und PCR-Cleanup ausgestattet, einem EEL für das automatische Laden von PCR-Proben. Ein Thermocycler für PCR und Inkubationsschritte, ein Schüttler für die Wiederbelebung von suspendierenden Zellen und Kälteblöcken.

Bei Enzymen werden Gene von Interesse in ausgewählte Donatoren und Akzeptoren eingefügt, indem Restriktionsenzyme und Ligase verwendet werden oder alternativ unter Verwendung ligationsunabhängiger Methoden alle Donor- und Akzeptorkonstrukte validiert werden, die durch Restriktionskartierung und Sequenzierung kloniert wurden. Diffuse Donorakzeptorkombinationen werden durch CRE LAX P-Rekombination hergestellt, um die Multigenexpressionskonstrukte der Wahl zu generieren. Die assemblierten Multi-Gen-Konstrukte werden durch analytische PCR-Reaktionen mit speziell entwickelten Primer-Sets validiert.

Hier sind Schnappschüsse des robotergestützten TR-Prozesses zu sehen. Sie umfassen die Vorbereitung von PCR-Reaktionen in Multi-Well-Platten, die Bereitstellung von Template-DNA und Primern, die PCR-Amplifikation von DNAs und die Präparation von Multi-Gen-Konstrukten, die in Bakterienkulturen durch alkalische Lyse in Multi-Well-Platten gezüchtet wurden. Um dieses Verfahren zu beginnen, integrieren Sie Multi-Gen-Transfervektoren in das virale Genom der Multi-Bula, indem Sie sich in DH 10-Zellen transformieren, die das virale Genom und die für die TN-7-Transposition erforderlichen Funktionalitäten enthalten.

Nach TN-7-Transposition werden Zellen mit kompositiertem Baula-Virus, die die interessierenden Gene enthalten, durch Blau-Weiß-Screening selektiert; eine erfolgreiche TN-7-Transposition führt zu einem Verlust der Alpha-Komplementation des Beta-Galaktos. Daher bleiben Kolonien mit korrekter TN-7-Transposition auf selektiven APLs, die xal enthalten, weiß. Bereiten Sie Bakterienkulturen aus den weißen Kolonien vor und isolieren Sie das Backin durch alkalische Lyse und Ethanol-Isopropanol-Fällung.

Als nächstes transfizieren Sie Insektenzellen mit dem gereinigten bao-Virusgenom, das in einer sterilen Haube arbeitet, und säen Aliquots von SS 21-Insektenzellen in der logarithmischen Phase in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Zu jedem wird das gereinigte bao-Virusgenom und ein Transfektionsreagenz in Nährmedien gemischt hinzugefügt. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 27 Grad Celsius ohne Bewegung für 48 bis 60 Stunden.

Ernten Sie nach 48 bis 60 Stunden das ursprüngliche Virus oder V Null, indem Sie das Medium entfernen, mit frischem Medium auffüllen und die Platte zwei bis drei Tage später wieder in den Inkubator stellen, um die Proteinproduktion zu testen. Und wenn ein YFP-Marker vorhanden ist, testen Sie auf Fluoreszenz für die Virusamplifikation. Verwenden Sie V zero, das ursprüngliche Virus, um 25 bis 50 Milliliter Zellen in logarithmischer Phase in kleinen Erlenmeyerkolben zu infizieren, die auf einer orbitalen Plattform bewegt werden.

Shaker zählen die Zellen und teilen die Zellen alle 24 Stunden, bis sie sich nicht mehr verdoppeln. Befolgen Sie eine geringe Multiplizität von Infektions- oder MOI-Schemata, die Zellen müssen sich mindestens einmal verdoppeln, andernfalls wiederholen Sie das Experiment mit einem kleineren Volumen von V Null. Das Bild links zeigt nicht infizierte Insektenzellen nach einer Infektion mit dem Multi-Back-Baula-Virus.

Infizierte Insektenzellen haben aufgehört, sich zu vermehren, und haben an Größe zugenommen, wie das Bild rechts zeigt. Nach 48 bis 60 Stunden wird das V-Eins-Virus durch Pelletieren der Zellen geerntet. Entfernen Sie die Datenträger, die den Virus enthalten, und bewahren Sie sie auf.

Bei der Wiederbelebung werden die Zellen mit frischen Medien suspendiert und zurück in den Erlenmeyerkolben übertragen. Alle 12 oder 24 Stunden werden einmal 10 der sechs Zellen durch Pelletierung entnommen und auf Proteinproduktion und Markerproteinsignal getestet, wenn größere Expressionsvolumina gewünscht werden. Amplifizieren Sie das Virus weiter, indem Sie bis zu 400 Milliliter Zellen in Zwei-Liter-Shaker-Flaschen mit dem V-One-Virus infizieren.

Nach dem niedrigen MOI-Schema empfehlen wir dringend, dass das V-Eins-Virus als Produktionsvirus gelagert wird, indem die mit dem Ularvirus infizierten Insektenzellen oder VIC-Methoden verwendet werden, um Modifikationen des rekombinanten Virus zu verhindern und hohe Expressionsniveaus zu erhalten. 24 Stunden nach dem Proliferationsstillstand wird ein Pellet-infizierter Zellen beobachtet. In diesem Stadium enthalten die Zellen vollständige Viruspartikel, kurz bevor sie in das Medium freigesetzt werden.

Entfernen Sie das Medium, resuspendieren Sie das Zellpellet in der Gefrierlösung und führen Sie das Einfrieren von BIIC in Kryoröhrchen für die Proteinproduktion durch. Verwenden Sie V, ein, V, zwei oder gefrorene BIC-Aliquots, um größere Zellkulturen zu infizieren. In der Regel halten sich 400 Milliliter in Zwei-Liter-Flaschen an das niedrige MOI-Regime.

Anpassen des für die Infektion verwendeten Virusvolumens so, dass sich die infizierte Kultur mindestens einmal verdoppelt. Wenn ein YFP-Markerprotein vorhanden ist, ziehen Sie eins mal 10 in definierten Abständen an die sechs Zellen zurück, beschallen und zentrifugieren Sie die Zellen und übertragen Sie die YFP-Spiegel in einem Standard-96-Well-Plattenlesegerät, das in der Lage ist, Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen und die Entwicklung des YFP-Signals zu überwachen, bis ein Plateau erreicht ist. die maximale rekombinante Proteinproduktion anzeigt. Ernten Sie Zellen in diesem Stadium, lagern Sie die Zellpellets kurzfristig bei minus 20 Grad Celsius oder langfristig bei minus 80 Grad Celsius Die Zellen sollten nach einer auf die Bedürfnisse des Proteins abgestimmten Methode und dann des Zytosols und der Zellkerne gelegt werden.

Fraktionierte Kernproteine befinden sich typischerweise im Kernpellet. Während zytosolische Proteine im Zytosol verbleiben. Die Proteinaufreinigung wird durch die Fraktionierung stark vereinfacht.

Denn viele Verunreinigungen können in einem einzigen Zentrifugationsschritt entfernt werden. Proteinkomplexe können bequem aus anfänglichen Zellkulturen in kleinem Maßstab aufgereinigt werden, indem miniaturisierte Aufreinigungsmethoden wie Multi-Well- oder Mikrospitzen-basierte Aufreinigung verwendet werden. In Verbindung mit kleinvolumigen Chromatographiesystemen wie dem ACTA micro wird ein zukünftiger Schritt darin bestehen, den gesamten Versuchsaufbau zu miniaturisieren und in eine kleine Tischanwendung zu integrieren, die mit der Klonierungs-Workstation verbunden ist.

Hier ist der in der Entwicklung befindliche mikroskalige Batch-Roboter zu sehen, der zu diesem Zweck zum Einsatz kommen wird. Eine starke Co-Expression heterologer Proteine wird durch das hier gezeigte Multi-Back-System erreicht. Die überexprimierten Proteinbanne sind im Ganzzellextrakt, WCE und dem geklärten Lysat deutlich erkennbar.

Sn.Die Qualität und Quantität des produzierten Proteinmaterials ist oft ausreichend. Ermöglicht die strukturierte Bestimmung von Proteinkomplexen, wie z. B. dem in diesem Diagramm gezeigten mitotischen Checkpoint-Komplex MCC. Oft reicht die Ausbeute dieser analytischen Aufreinigungsläufe aus, um die Struktur und Funktion des gereinigten Komplexes mit einer Vielzahl von Mitteln, einschließlich der Elektronenmikroskopie, zu analysieren.

Die von uns entwickelten Standardarbeitsanweisungen ermöglichen es auch nicht-spezialisierten Anwendern, unseren Ansatz problemlos anzuwenden, und unsere Technologie kann in vielen Labors eingesetzt werden, die sich für große Proteinkomplexe interessieren, ähnlich wie es heute bei kleinen Proteinen in Nikola der Fall ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Multi-Beutel verwenden, um Ihre interessanten Proteinkomplexe in unübertroffener Menge und Qualität für Ihre ehrgeizigen Forschungsziele herzustellen. Für die Arbeit mit unseren Systemen sind keine besonderen Sicherheitsbedingungen erforderlich.

Denken Sie jedoch daran, dass das Virus Sie infizieren wird, wenn Sie schlampig sind, auch wenn es sich nicht in Ihren Zellen repliziert. Daher ist ein sorgfältiger Umgang mit Ihren Steroidbedingungen bei der Durchführung dieses Verfahrens ein Muss. Unsere Methode ist bereits in mehr als 600 Labors weltweit sehr beliebt geworden.

Nutzen Sie unsere Technik. Wir glauben, dass unsere Methode in Zukunft zu einem integralen Bestandteil groß angelegter struktureller Genomik-Bemühungen werden wird, die sich mit der komplexen Zone des Menschen befassen. Dies kann dazu beitragen, die Grundlagen von Krankheiten aufzudecken und langfristig zu neuen und besseren Medikamenten und Therapien zu führen.