Name: Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung funktionellen Plasma-Retinol-Binding-Proteins aus Bakterien für Echtzeit-Analysen des STRA6-Rezeptors. Diese Methode ermöglicht Untersuchungen zum Vitamin-A-Transport in der Zellbiologie.

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Ein. Produktion, Rückfaltung und HPLC Aufreinigung von Holo-RBP <ol><li> Transformieren BL-21cells mit dem pET3a Vektor beherbergen die cDNA für humanes RBP mit 6x His-Tag am N-Terminus. Wachsen die transformierten BL-21-Zellen in einem Schüttler bei 37 ° C in 40 ml LB-Medium mit Carbenicillin bis OD bei 600 nm erreicht, 0.5. Induzieren RBP Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C weitere 5 Stunden. </li><li> RBP in E.coli produziert wird meist in unlöslichen Einschlusskörpern. Um Einschlusskörper, Pellet-Zellen bei 10.000 × g für 20 min anzureichern. Dann beschallen die Zellen auf Eis in 5 ml PBS mit Protease-Inhibitoren, durch zwei Zyklen von Gefrieren und Auftauen, gefolgt. Pellet nach unten die Einschlusskörper bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und halten Sie die Pellets auf Eis. </li><li> Solubilisierung des inclusion body Pellet durch Beschallung in 10 ml 7,5 M Guanidinhydrochlorid. Hinzufügen eines Hälfte des Volumens (5 ml) von 25 mM Tris-Puffer, pH 9,0 und DTT zu einer endgültigen concentration von 10 mM. Kräftig mischen Lösung auf einem Vortex-Mischer über Nacht bei Raumtemperatur vollständig zu reduzieren und zu denaturieren Proteine. </li><li> Zentrifugieren der Proteinlösung, um unlösliches Material zu entfernen bei 18.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach dem Spin, den Überstand in ein neues Röhrchen und das Reagenzglas auf Eis. </li><li> Planen vier Volumina (60 ml) von Rückfaltungspuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM Cystin, 3,0 mM Cystein, 1 mM EDTA). Entgasen Rückfaltungspuffer. Bereiten auch 600 ul 10 mM Retinol in Ethanol unter dim rotes Licht. Halten Sie es im Dunkeln auf Eis. Sowohl die Rückfaltungspuffer und Retinol-Lösung müssen frisch zubereitet. </li><li> Abkühlen sowohl die Proteinlösung und die Rückfaltungspuffer auf Eis für mindestens 30 min. Höhere Temperaturen wahrscheinlich reduziert die Qualität der rückgefaltet RBP. 1 ml Rückfaltungspuffer zugetropft und 10 ul Retinol Lösung wiederum während Proteinlösung wird kräftig in einem Becherglas auf Eis gemischt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Rückfaltungspuffer und Retinolzugegeben. Halten Rühren der Reaktionsflüssigkeit auf Eis im Dunkeln für 5 Stunden. </li><li> Abzentrifugieren der Neufaltungsreaktion bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Es ist wesentlich, um die Aggregate direkt nach dem Neufaltungsreaktion entfernen. </li><li> Konzentrieren die überstehende Lösung mittels Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO 10 K) bis etwa 10 ml beträgt. Nicht konzentrieren die rückgefaltet Lösung mehr als dieser Ebene. Konzentrieren zu viel wird, um Proteinaggregation führen und senkt die endgültige Ausbeute und Qualität des korrekt gefalteten RBP. Verdünnen der konzentrierten Probe mit kaltem PBS auf 100 ml. Der Zweck dieses Schrittes ist es, die Komponenten in dem Neufaltungsreaktion, die mit Nickel stören Reinigung entfernen. </li><li> Drehe den Lösung noch einmal bei 24.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Es ist wichtig, einen Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in zwei 50 ml Röhrchen, die jeweils 1 ml Ni-NTA Gülle, die mit PBS gewaschen wurde. Drehen werden die Röhrchen bei 4 ° C für eine Stunde. Inkubation verdünnte Lösung foder 1 h kann das Ausfällen von fehlgefalteten Proteinen, die entfernt werden müssen. </li><li> Spin down die Röhrchen bei 500 xg für 3 min. Überstand entfernen vorsichtig. Alles floating entfernt werden sollte. Kaltes PBS auf 30 ml für jede Röhre. Spin wieder und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie nichts Beads im Röhrchen zu sehen. </li><li> Übertragen der Ni-NTA-Harz in einen leeren Spalte. Waschen Harz mit 20 Säulenvolumina 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl in PBS. Eluieren His-RBP in 5 Säulenvolumen 100 mM Imidazol in PBS. Nicht speichern diese Lösung über einen längeren Zeitraum, und Einfrieren verringert die endgültige Ausbeute und Qualität. Für das beste Ergebnis, reinigen RBP mittels HPLC sofort. </li><li> Dialysieren His-RBP von der Ni-NTA-Harz gegen 25 mM Tris, pH 8,4, und 120 mM NaCl gereinigt. Ein Konzentrator kann auch für Puffer-Wechsels benutzt. Klare Proben für die HPLC durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C direkt vor jedem Durchlauf. </li><li> Entschlacken Holo-RBP auf HPLC unter Verwendung einer Ionen-Austauschkolonne AX-300 durch einen NaCl-Stufengradienten (220 mM 12 min, 360 mM 15 min und 1000 mM 15 min) unter Verwendung von 25 mM Tris, pH 8,4 als mobile Phase mit 1 ml / min. Als NaCl-Konzentration ansteigt, wird Holo-His-RBP während apo-RBP freigegeben und fehlgefaltete RBP bleiben an die Säule gebunden (Abbildung 1). Wenn RBP Rückfaltung nicht getan ist optimal, fehlgefaltete RBP (zB fehlgefaltete RBP-I in Abbildung 1) kann die ganze Vorbereitung überwiegen. </li><li> Wiederherstellen der korrekt gefalteten Holo-RBP aus den Peak-Fraktionen bei 360 mM NaCl. Sorgfältig überwachen das Elutionsprofil von korrekt gefalteten und fehlgefaltete His-RBP. Bei 1.000 mM NaCl, fehlgefaltete meisten His-RBP freigelassen werden sollten. </li><li> Fraktionen, die Holo-RBP werden vereinigt, eingeengt, und gegen PBS über Nacht bei 4 ° C. Überprüfen Sie die endgültige Ausbeute und Qualität (330 nm/280 nm) durch Spektralphotometer. Korrekt gefalteten Produkt sollte eine 330 nm/280 nm Verhältnis etwas höher als 1 (Abbildung 1). </li><li> Um die Produktivität zue apo-RBP, fügen Sie ein gleiches Volumen Heptan zu den gereinigten Holo-RBP und vorsichtig mischen durch Drehen über Nacht bei 4 ° C. Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C und vorsichtig übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues Röhrchen (Vermeidung des Niederschlages an der Grenzfläche). Den Vorgang wiederholen, dreimal mit einer 3-stündigen Inkubation für jede. Überprüfen Absorption auf einer Nanodrop Spektralphotometer sicherstellen, dass die 330 nm Peak hat in den Hintergrund Ebene verringert. </li></ol> 2. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Release and Retinol Loading <ol><li> Blockieren eines schwarzen 96-Well-Microfluor-2 Platte (Thermo Scientific) mit 200 ul Blocker Casein (Pierce) über Nacht bei 4 ° C, um unspezifische Anhaften von Holo-RBP auf den Kunststoff zu vermeiden. Blocker Casein bietet die beste Sperrwirkung der alle Sperren Lösungen, die wir getestet. </li><li> Membranen frisch aus Zellen, die Stra6 oder Kontrolle Zellen hergestellt werden gewaschen mit PBS und durch eine Hamilton-Spritze (Gasti übergebenght # 1710) 6 mal, um eine gleichmäßige Suspension in PBS erzeugen. Wir verwenden typischerweise Membranen von 1/100 bis 1/20 der Zellen auf einer 100 mm Schale pro Reaktion gezüchtet abgeleitet. </li><li> Waschen Sie die beschichteten Wells der Microfluor-2 Platte einmal mit 200 ul PBS. Man kühlt die Platte auf Eis vor Zugabe Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Echtzeit-Überwachung von Retinol Fluoreszenz gemessen mittels Fluoreszenz Optik des POLARstar Omega (BMG Labtech) mit dem Anregungsfilter 320EX und dem Emissionsfilter 460-10. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 gesetzt. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Um die Retinol-Release-Assay zu starten, werden die Vertiefungen einmal mit dem Endpoint Lesen m lesenode vor Holo-RBP (typischerweise 1 pM Endkonzentration) bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. Um das Retinol Belastung Assay, all-trans-Retinol (typischerweise 1 uM Endkonzentration) gestartet wird den Brunnen unter dim rotes Licht aufgenommen. Die Platte wird einmal vor apo-RBP bei 0 min zugegeben wird gelesen. Sobald apo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 2 gezeigt) aus dem Omega Data Analysis Software (BMG Labtech) in Microsoft Excel für die Datenanalyse. Jeder Zeitpunkt erzeugt eine Datei, die die Messwerte aller experimentellen Bedingungen enthält. Zum Beispiel, wenn es 20 Zeitpunkte sind, zu festigen 20 Dateien in eine Excel-Datei für die Datenanalyse. </li><li> Zur Datenanalyse, werden die Fluoreszenzsignale vor der Zugabe von Retinol oder Holo-RBP bei 0 min als ein Hintergrundsignaled subtrahiert von den endgültigen Fluoreszenzsignale zu allen Zeitpunkten. Obwohl die Hintergrundsignale niedrig zu Retinol Fluoreszenz in Holo-RBP verglichen werden, Subtrahieren der Hintergrund eliminiert den Einfluss der unspezifischen Lichtstreuung durch die Membranen und macht es möglich, auf der Fluoreszenz von Retinol Holo-RBP oder Retinol hinzugefügt bei 0 min konzentrieren. </li></ol> 3. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Transport von Retinol Von Holo-RBP um CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP ist eine neue Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET)-Paar, das vor kurzem 41 gegründet. Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I wird in Echtzeit durch Messung Retinol-EGFP überwacht FRET. EGFP-CRBP-I-Fusionsprotein mit 6 × His-Tag (EGFP-CRBP-I) in Säugetierzellen hergestellt und wird auf Ni-NTA-Harz vor dem Experiment gereinigt. EGFP-CRBP-I kann in PBS mit Proteaseinhibitoren für eine kurze Zeit bei 4 ° C gelagert Alternativ kann das Fusionsprotein is in 80 ° C in kleinen Aliquots eingefroren. </li><li> Vor den Reaktionen, bereiten eine blockierte Microfluor-2 Platte und Membranen wie oben beschrieben. Waschen der beschichteten Wells der Platte Microfluor-2 einmal mit 200 ul PBS vor der Zugabe von Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Real-time Retinol-EGFP FRET gemessen mit POLARstar Omega mit dem Anregungsfilter 320EX und den Emissionsfilter 460-10 und 510-10 mit gleichzeitiger Duell Emissionsfluoreszenz Optik. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 pro Kanal. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Die Reaktionen, EGFP-CRBP-I (typischerweise 1 pM Endkonzentration) gestartet wird zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird auf Lesence mit dem Endpoint-Lesemodus, bevor Holo-RBP wird bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich durch Messung überwacht jeden 5-10 min für 1-2 Stunden. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 3 dargestellt) aus der Omega Data Analysis Software an Microsoft Excel zur Datenanalyse wie oben beschrieben. </li><li> Retinol-EGFP FRET wird durch die dynamische Änderung im Verhältnis der Akzeptor / Donor Emissionspeaks 47 berechnet. Die Gleichung 41, um dieses Verhältnis zu berechnen ist [(510 -510 t b) / (-460 460 t b)], worin T 510, 510 b, 460 t und 460 b repräsentieren Emissionen bei 510 nm nach der Initiierung der Reaktion ( t = Zeitpunkt), wird bei 510 nm vor Retinol oder Holo-RBP zugegeben (b = Hintergrund), bei 460 nm nach der Initiierung der Reaktion (t = Zeitpunkt), und bei 460 nm vor Retinol oder Holo-RBP angefügt (b = Hintergrund), jeweils. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir teilen hier eine optimierte RBP Produktion Protokoll, weil RBP Produktion und Reinigung Verfahren kritisch zu generieren korrekt gefaltet RBP sind. Angesichts der Möglichkeit von falsch gefalteten Spezies RBP und das Vorhandensein von Spurenmengen von bakteriellen Proteinen, auch bei HPLC gereinigten RBP bakteriell gebildete, ist es hilfreich zu nativem RBP aus Serum zu verwenden, um eine Aussage bezüglich RBP bestätigen. Urin RBP, welches kommerziell erhältlich ist, ist ein komplexes Gemisch von vielen Arten von RB...

Vitamin A ist ein organisches Molekül, das essentiell für das Überleben der Menschheit und das reibungslose Funktionieren fast aller menschlichen Organen. Vitamin A-Derivate (Retinoide) in verschiedenen biochemischen und zellulären Ereignisse, einschließlich der Erfassung von Licht zum Sehen 1,2 und der Regulation der Genexpression und Proteintranslation während der Embryonalentwicklung und in adulten Geweben 3-6 teilzunehmen. Obwohl Retinol hat die Fähigkeit, systemisch diffundieren, kam Evolution mit Plasma Retinol bindendes Protein, ein spezifischer Trägerprotein für Vitamin A im Blut eine hohe Effizienz und Spezifität zu erreichen und Toxizität mit zufälligen Diffusion 7-10 einhergehen, zu vermeiden. Ein Rezeptor mit hoher Affinität, die RBP bindet und nimmt Vitamin A wurde in den 1970er Jahren 11-13 vermutet. Trotz Beweise in drei Jahrzehnten von der Existenz des RBP-Rezeptor 14-31 angesammelt, wurde der Rezeptor-Hypothese seit vielen Jahren aufgrund der existenc diskutierte einer falschen Definition von Holo-RBP. Die korrekte Definition von Holo-RBP ist, dass es die hohe Affinität 1:1-Komplex aus Retinol und RBP ist. Wiederholte Extraktion von Holo-RBP durch organische Lösungsmittel ist notwendig, um apo-RBP produzieren. Diese Definition wird von fast allen Labors studieren RBP 7,9,32-35 oder die RBP-Rezeptor 14-31,36-42 verwendet. Die falsche Definition von Holo-RBP, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zu widerlegen wurde, ist die akute Mischung aus freien Retinol mit apo-RBP. Da die Funktion des Rezeptors in RBP Vitamin A Aufnahme von Holo-RBP ist Retinol von Holo-RBP freisetzen würde die RBP-Rezeptor keine Rolle spielen, wenn Retinol Aufnahme Retinol frei zu beginnen (wie durch die falsche Definition von Holo vorgeschlagen -RBP). Die jüngste Identifizierung von RBP Rezeptors als multitransmembrane Domain Protein namens STRA636 und seine Funktion in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP 36-43 dringend spricht gegen die Hypothese, dass RBP nichtbenötigen einen Rezeptor an Vitamin A. Detaillierte Analysen zeigten, dass Stra6 9 Transmembrandomänen mit dem N-Terminus extrazellulär lokalisiert und C-Terminus lokalisiert intrazellulär 40 weist liefern. Das zwischen Transmembran 6 und 7 ist ein wesentlicher RBP Bindungsdomäne 39. Stra6 ist sowohl LRAT und CRBP-I in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP verbunden, aber weder LRAT noch CRBP-I ist absolut für eine verbesserte Stra6 Aktivität 41 erforderlich. Stra6 Fähigkeit zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren ist der Schlüssel zu ihrer Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität 41. Durch das Abstützen auf Stra6 seiner Retinol freisetzen kann Vitamin A Lieferung durch RBP transportieren Vitamin A, um Zellen in den peripheren Geweben mit hoher Spezifität und Effizienz zielen. Die kritische Bedeutung des Holo-RBP Definition und Vorbereitung wird nicht nur durch die historische Debatte über die Existenz der RBP-Rezeptor dargestellt, sondern auch durch drei verwandten letzten Papiere auf Holo-RBP Definitionen dif Basisschiedenen von der ursprünglichen und korrekte Definition 44-46. Das erste Papier verwendet den Holo-RBP-Definition, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zur Untersuchung der RBP-Rezeptor 44 missbilligen wurde. Die zweite und dritte Papieren kam mit einer dritten Definition von Holo-RBP daß sie noch weniger wahrscheinlich Retinol untersucht werden, um eine ordnungsgemäße Anlage mit RBP 45,46 bilden. Diese Studien vorbereitet 3 H-retinol/RBP durch Mischen Holo-RBP (auch nicht apo-RBP) mit 3 H-Retinol. Da dieser Test nicht über 3 H-retinol/RBP gebildet und entfernte nicht übermäßigen freien 3 H-Retinol 45,46, es ist nicht ein Assay für 3 H-Aufnahme aus Retinol 3 H-retinol/RBP, sondern eine freie 3 H-Retinol Diffusionsassay. Es wurde zuvor daß Stra6 verbessert nicht zelluläre Aufnahme von Retinol frei von LRAT 38 oder CRBP-I 41 gezeigt. Praktisch alle Retinol zwangsläufig im Blut RBP und es keinen nachweisbaren free Retinol. Eine Hauptfunktion des RBP Rezeptor zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren während Retinol-Aufnahme von Holo-RBP 41. Wenn das Retinol künstlich freigesetzt wird oder in der freien Form mit 45,46 beginnen, wird die RBP-Rezeptor nicht erforderlich. Die drastisch unterschiedliche Ergebnisse aus der freien Retinol Diffusionsassay erhalten, um Tests auf richtig vorbereiteten Holo-RBP zeigen, dass die richtige Zubereitung von RBP Basis gegenüber ist entscheidend für seine funktionellen Assays. RBP kann aus menschlichem Serum 41 gereinigt werden, aber das Verfahren ist aufwendig, und die Ausbeute ist gering. Ein alternativer Ansatz ist die RBP in E. produzieren coli. Weil E. coli nicht in der Lage, richtig zu falten Säuger sezernierten Proteinen mit mehr als einem Paar von Disulfidbindungen wie RBP, ist es wesentlich, refold Rbp und reinigen das korrekt gefaltete Protein. Falsch gefaltete Proteine ​​nicht nur anders korrigiert gefalteten RBP in verschiedenen Tests verhalten,aber auch dazu führen, Proteinaggregation während der Lagerung. Aus dem gleichen Grund wird apo-RBP nur aus hochwertigem Holo-RBP hergestellt. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll zur Herstellung von hochwertigen RBP 100% mit Retinol durch bakterielle Expression, Rückfaltung und HPLC-Reinigung geladen. HPLC-Reinigung entfernt nicht nur falsch gefaltete RBP aber auch erhebliche bakterielle Kontamination, die schwere Artefakte verursachen kann, wenn RBP in der Signaltransduktion Assays verwendet wird. Wir beschreiben auch zwei empfindliche Echtzeit-Monitoring-Techniken zu Retinol Transport per Stra6 studieren. Beide Techniken sind abhängig von hoher Qualität RBP. Aus Platzgründen werden die klassischen Techniken der radioaktiven Retinoid-basierten und HPLC-basierte Vitamin-A-Aufnahme-Assays werden hier nicht beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fischer </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> Retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Fischer </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Casein </td><td> Durchstechen </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Platte </td><td> Fischer </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze Gasdichte # 1710 </td><td> Fischer </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyse von retinol transport durch die membran-rezeptor von plasma retinol binding protein

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A ist für das Sehen wichtig und das Wachstum / Differenzierung von fast allen menschlichen Organen. Plasma Retinol bindendes Protein (RBP) ist das Prinzip und spezielle Träger von Vitamin A im Blut. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Holo-RBP und zwei Echtzeitüberwachung Techniken, um den Transport von Vitamin A durch den hochaffinen Rezeptor RBP Stra6 studieren. Die erste Technik ist es möglich, eine große Menge an qualitativ hochwertigen Holo-RBP (100% mit Retinol-loaded) für Vitamin A Transport-Assays zu erzeugen. Hochwertige RBP ist essentiell für funktionelle Assays, weil fehlgefaltete RBP Versionen Vitamin A leicht und bakterielle Kontamination in RBP Vorbereitung kann Artefakte verursachen. Echtzeit-Überwachung Techniken wie Elektrophysiologie wurden kritische Beiträge zu den Untersuchungen von Membran-Transport gemacht. Die RBP rezeptorvermittelte Retinol Transport nicht in Echtzeit bis vor kurzem wurden analysiert. Der zweite hier beschriebene Technik ist der Grundl-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Freisetzung oder loading. Die dritte Technik ist die Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP, um zelluläre Retinol bindendes Protein I (CRBP-I). Diese Techniken bieten eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung bei der Aufdeckung RBP Rezeptors Vitamin A-Aufnahme-Mechanismus.

Wir stellen Ihnen hier repräsentative Ergebnisse für Holo-RBP Produktion und Reinigung durch HPLC (Abbildung 1), Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Release von Holo-RBP und Retinol Laden in apo-RBP (Abbildung 2) und Echtzeit-Analyse Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I (Abbildung 3). Ohne Rückfaltung, hergestellt RBP in Bakterien fast vollständig fehlgefaltete aufgrund der Anwesenheit von vielen fal...

Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Dieses Protokoll zeigt die Produktion von hochwertigem Plasma-Retinol-Bindungsprotein, das verwendet wird, um die Aktivitäten des Retinol-Bindungsproteinrezeptors in Echtzeit zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine große Menge an Retinol-Bindungsprotein aus Bakterien exprimiert und gereinigt wird. Das gereinigte Retinol-Bindungsprotein wird vollständig denaturiert und in Gegenwart seines Liganden Retinol langsam wieder gefaltet.Dann wird das korrekt gefaltete Retinol-Bindungsprotein mittels HPLC aufgereinigt, um falsch gefaltete Proteine und bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Sobald ein hochwertiges Retinol-Bindungsprotein erhalten ist, kann es verwendet werden, um die Aktivitäten seines Membranrezeptors bei der Katalyse der Retinolfreisetzung, der Retinol-Beladung oder des Retinol-Transports zum zellulären Retinol-Bindungsprotein eins zu untersuchen. In Echtzeit.Heute werde ich unser verbessertes Protokoll zur Reform und Reinigung von retinalen Bindungsproteinen produzierenden Bakterien vorstellen. Mit dieser Technik kann ein hochwertiges retinales Bindungsprotein hergestellt werden, das für funktionelle Assays unerlässlich ist. Ich werde die neu entwickelten Techniken zur Untersuchung des Rezeptors für das retinale Bindungsprotein demonstrieren.Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden wie auf Radioaktivität oder HPRC basierenden Techniken besteht darin, dass Sie den Fortschritt mehrerer Reaktionen in Echtzeit überwachen können. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist die RVP-Einbehaltung, die sowohl die Qualität als auch die Ausbeute von RVP bestimmen kann. Wird das Protein nicht korrekt hergestellt, kann das resultierende RVP-Präparat nicht für funktionelle Säuren verwendet werden.Hier stellen wir einige Verbesserungen vor, die wir im Laufe der Jahre entwickelt haben und die den Erfolg sicherstellen werden. Beginnen Sie dieses Protokoll mit den unlöslichen Einschlusskörpern aus einer 40-Milliliter-Kultur von BL 21 e coli, in denen humanes RBP-Protein mit einem sechsfachen His-Tag 10 Milliliter 7,5 molares Guineehydrochlorid zu den Einschlusskörpern hinzufügt und beschallt. Fügen Sie dann fünf Milliliter 25 Millimolar Triss pH neun und 75 Mikroliter 10 Millimolar DTT hinzu und drehen Sie über Nacht.Am nächsten Tag zentrifugieren Sie bei 18 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um die unlöslichen Proteine zu entfernen. Nach dem Schleudern den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und das Röhrchen auf Eis legen. Bereite dann den Faltpuffer auf Eis vor, wie im Begleittext beschrieben.Schalten Sie dann das Raumlicht aus, um unter einem schwachen roten Licht zu arbeiten, während Sie die Proteinlösung in einem Becherglas auf Eis kräftig mischen. Alternativ können Sie 10 Mikroliter Retinollösung für jeden Milliliter Rückfaltungspuffer hinzufügen, um insgesamt 600 Mikroliter Retinollösung und 60 Milliliter Rückfaltungspuffer zu erhalten. Nach einer weiteren Zentrifugation fünf Stunden lang im Dunkeln weiterrühren.Konzentrieren Sie den Überstand mit Anacon Ultra 15 auf etwa 10 Milliliter. Nach dem Konzentrieren verdünnen Sie die Probe auf 100 Milliliter. Mit kaltem PBS.Es ist wichtig, an dieser Stelle jeglichen Niederschlag zu entfernen. Reinigen Sie dann das gefaltete RBP auf Nickel-NTA-Harzeluierung in 100 Millimolar Ole in PBS. Konzentrieren Sie das EIT mit einem Konzentrator mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 Kilodalton auf das Volumen, das ein Fünftel bis ein Zehntel des ursprünglichen Volumens beträgt.Dann fünf- bis zehnmal mit Tris plus Natriumchlorid verdünnen und den Konzentrationsschritt nach dem Konzentrieren des Proteins wiederholen. Unmittelbar vor dem HPLC-Lauf wird es in ein 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt, um die Proben bei 16.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren. Als nächstes reinigen Sie hohles RBP auf der HPLC mit einer Ionenaustauschersäule durch einen Natriumchlorid-Stufengradienten von 220 Millimolar für 12 Minuten.360 Millimolar für 15 Minuten und 1000 Millimolar für 15 Minuten. Verwendung von 25 Millimolaren Triss pH 8,0 als mobile Phase bei einem Milliliter pro Minute. Wenn die Natriumchloridkonzentration ansteigt, wird hohles Zischen RBP freigesetzt.Während APO RBP und falsch gefaltetes RBP an die Säule gebunden bleiben. Wenn die RBP-Umfaltung nicht optimal durchgeführt wird, kann falsch gefaltetes RBP die gesamte Vorbereitung dominieren. Überwachen Sie sorgfältig das Elutionsprofil von korrekt gefaltetem und falsch gefaltetem Hiss RBP bei 1000 Millimolar Natriumchlorid.Der größte Teil des fehlgefalteten Rauschens RBP sollte freigesetzt werden. Das korrekt gefaltete hohle RBP wird aus den Peakfraktionen bei 360 Millimolar Natriumchlorid zurückgewonnen. Nach der HPLC werden die RBP-haltigen Fraktionen in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis gesammelt.Verwenden Sie dann den 10-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrator, um zu konzentrieren, nachdem das Volumen um das Fünf- bis Zehnfache reduziert wurde. Fügen Sie PBS hinzu, um die Probe zu verdünnen und am nächsten Tag erneut zu konzentrieren. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die endgültige Ausbeute und Qualität zu bestimmen, wie hier gezeigt.Korrekt gefaltetes Produkt sollte ein Verhältnis von 330 Nanometern bis 280 Nanometern haben. Fast ein falsch gefaltetes Protein hat ein Verhältnis von weniger als eins, um A-O-R-B-P zu produzieren. Geben Sie das gleiche Volumen Heptan in den gereinigten hohlen RBP und mischen Sie vorsichtig, indem Sie ihn über Nacht bei einer Zentrifuge von vier Grad Celsius bei 16.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius drehen.Nach dem Spin werden die obere organische Phase und die untere wässrige Phase durch eine weiße Schicht getrennt. Die weiße Schicht besteht aus denaturiertem APO RBP. Um die wässrige Phase zu gewinnen, führen Sie die Spitze einer 500-Mikroliter-Spritzennadel an den Boden des Röhrchens und saugen Sie die Lösung vorsichtig ab.Vermeiden Sie das weiße Material in der Schnittstelle und geben Sie die Lösung in ein neues Röhrchen. Fügen Sie erneut Heptan hinzu und wiederholen Sie den Extraktionsvorgang dreimal mit einer dreistündigen Drehung bei jeweils vier Grad Celsius nach der letzten Extraktion. Überprüfen Sie die Absorption auf einem NanoDrop-Spektralphotometer, um sicherzustellen, dass der 330-Nanometer-Peak auf das Hintergrundniveau gesunken ist. STR RRA sechs katalysiert.Die Retinolfreisetzung und die Retinolbeladung können in Echtzeit überwacht werden, indem die Retinolfluoreszenz überwacht wird, wenn Retinol gebunden ist, es gibt einen Anstieg der Fluoreszenz bei 460 Nanometern, wenn Retinol freigesetzt wird. Es ist eine Abnahme der Fluoreszenz durchzuführen Dieser Assay beginnt mit der Zugabe von 200 Mikrolitern Blocker Kasein in jede Vertiefung eines schwarzen 96-Well-Mikrofluor-Zweiplatten-Inkubats über Nacht bei vier Grad Celsius, um ein unspezifisches Anhaften von hohlem RBP am Kunststoff zu verhindern. Am nächsten Tag waschen Sie die beschichteten Vertiefungen der Mikroflora zwei Platten einmal mit 200 Mikrolitern PBS.Nach dem Aspirieren des PBS kühlen Sie die Platte auf Eis ab. Geben Sie 100 Mikroliter PBS zu den frisch vorbereiteten Membranen von einer bis 5 Millionen Zellen, die T RRA sechs exprimieren, oder Kontrollzellen und passieren Sie die Membranen sechsmal durch eine Hamilton-Spritze mit der Gastypnummer 1710, um eine gleichmäßige Suspension herzustellen. Als nächstes verdünnen Sie die Membransuspension mit PBS auf einen Milliliter.Geben Sie 50 Mikroliter der Membransuspension in jede Vertiefung und legen Sie die Platte dann wieder auf Eis. Hier. Die Echtzeitüberwachung der Retinol-Fluoreszenz wird mit Hilfe der Fluoreszenzoptik des Polarsterns Omega gemessen. Richten Sie das Gerät wie im Begleittext beschrieben mit einem Anregungsfilter von 320 und dem Emissionsfilter von 460 Strich 10 ein.Mit diesem Gerät wird ein Retinol-Freisetzungsassay durchgeführt, bei dem nach einem Hintergrund-Read hohler RBP hinzugefügt und alle 10 Minuten für ein bis drei Stunden Messungen durchgeführt werden. Führen Sie dann einen Retinol-Loading-Assay durch, bei dem das gesamte trans-Retinol auf die Platte gegeben wird. Bei schwachem rotem Licht wird die Platte einmal abgelesen und dann A-O-R-B-P hinzugefügt.Die Reaktion wird dann alle fünf bis 10 Minuten für ein bis drei Stunden kontinuierlich überwacht, nachdem alle Messungen durchgeführt wurden. Die Rohdaten werden in der Datenanalysesoftware Omega angezeigt. Übertragen Sie die Rohdaten nach Microsoft Excel.Für die Datenanalyse ist Retinol EGFP ein Fluoreszenz-Resonanz-Transfer oder Bundpaar, bei dem Retinol als Donor und EGFP als Akzeptor dient. Der katalysierte Retinoltransport von S stra six vom hohlen R BP zum EEG FP crbp one wird in Echtzeit durch Messung des Retinol-EEG-FP-Bunds überwacht, bevor eine Echtzeitüberwachung des EEG FP crbp one Fusionsproteins mit sechs x Hiss-Tag E GFP crbp one wird in Säugetierzellen hergestellt, auf Nickel-NTA-Harz gereinigt und in PBS mit Proteaseinhibitoren für einen kurzen Zeitraum bei vier Grad Celsius oder bei negativen Temperaturen gelagert. 80 Grad Celsius für längere Zeiträume. Bereiten Sie eine blockierte Mikroflora, zwei Platten und Membranen vor, wie im vorherigen Abschnitt dieses Videos beschrieben, und fügen Sie 50 Mikroliter Membransuspension hinzu.wie bisher. Stellen Sie den Polarstern-Omega mit den gleichen Einstellungen wie zuvor ein, mit einem zusätzlichen Emissionsfilter von 510 bis 10 und gleichzeitiger Dual-Emissions-Fluoreszenzoptik in diesem Assay. EG FP crbp wird jeder Vertiefung eine bis eins mikromolare Endkonzentration zugesetzt, um die Reaktion zu starten, und es wird eine Hintergrundmessung durchgeführt.Dann wird ein Millimolar hohler RBP hinzugefügt und die Messungen werden alle fünf bis 10 Minuten für ein bis zwei Stunden durchgeführt, nachdem alle Messungen durchgeführt wurden. Laden Sie die Rohdaten wie bisher herunter. Der Retinol-EGFP-Bund wird durch die dynamische Änderung des Verhältnisses von Akzeptor- zu Donor-Emissionsspitzen berechnet.Die Gleichung zur Berechnung dieses Verhältnisses ist hier dargestellt, wobei 510 T, 510 B, 460 T und 460 B Emissionen bei 510 Nanometern nach Beginn der Reaktion bei 510 Nanometern darstellen, bevor ein Retinol oder hohles RBP bei 460 Nanometern nach Beginn der Reaktion hinzugefügt wird, das 460 Nanometer vor Zugabe von Retinol bzw. hohlem RBP hinzugefügt wird. Um die katalytischen Aktivitäten des RBP-Rezeptors STRA six zu untersuchen, wird hochwertiges RBP hergestellt und gereinigt und dann zur Überwachung der katalysierten Reaktionen von stra six in Echtzeit verwendet. Diese Abbildung zeigt eine dramatische zeitabhängige Erhöhung der Retinolfluoreszenz in den Reaktionen, die TA six, Retinol und A-O-R-B-P enthalten.Es gibt einen geringen Anstieg der Retinolfluoreszenz bei Reaktionen ohne TA six. Dieses Experiment zeigt die katalysierte Retinolbeladung von stra six in APO R bp, wenn der stra-katalysierte Retinoltransport von hohlem R BP zu EEG FP crbp eins bewertet wurde. Es gab einen zeitabhängigen Anstieg des Retinol-EEG-FP-Frets in den Reaktionen, die TA sechs enthielten.Dies deutet darauf hin, dass stra sechs den Transport von Retinol aus dem hohlen R BP zum EEG FP crbp eins stark beschleunigt. Bei der Verwendung von Bakterien, die IBP produzieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass qualitativ hochwertiges IVP für funktionelles Säure-beteiligtes IBP unerlässlich ist, und es ist wichtig, das Ergebnis von RBP aus Bakterien mit nativem RVP aus dem Serum zu bestätigen. Sobald qualitativ hochwertiges RVP verfügbar ist, kann es verwendet werden, um die Funktion des RBP-Rezeptors in Echtzeit mit der gerade beschriebenen Technik zu untersuchen.Diese Techniken ergänzen die klassischen, wirklich aktivitätsbasierten oder HPRC-basierten Assays.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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