Name: Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung funktionellen Plasma-Retinol-Binding-Proteins aus Bakterien für Echtzeit-Analysen des STRA6-Rezeptors. Diese Methode ermöglicht Untersuchungen zum Vitamin-A-Transport in der Zellbiologie.

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Ein. Produktion, Rückfaltung und HPLC Aufreinigung von Holo-RBP <ol><li> Transformieren BL-21cells mit dem pET3a Vektor beherbergen die cDNA für humanes RBP mit 6x His-Tag am N-Terminus. Wachsen die transformierten BL-21-Zellen in einem Schüttler bei 37 ° C in 40 ml LB-Medium mit Carbenicillin bis OD bei 600 nm erreicht, 0.5. Induzieren RBP Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C weitere 5 Stunden. </li><li> RBP in E.coli produziert wird meist in unlöslichen Einschlusskörpern. Um Einschlusskörper, Pellet-Zellen bei 10.000 × g für 20 min anzureichern. Dann beschallen die Zellen auf Eis in 5 ml PBS mit Protease-Inhibitoren, durch zwei Zyklen von Gefrieren und Auftauen, gefolgt. Pellet nach unten die Einschlusskörper bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und halten Sie die Pellets auf Eis. </li><li> Solubilisierung des inclusion body Pellet durch Beschallung in 10 ml 7,5 M Guanidinhydrochlorid. Hinzufügen eines Hälfte des Volumens (5 ml) von 25 mM Tris-Puffer, pH 9,0 und DTT zu einer endgültigen concentration von 10 mM. Kräftig mischen Lösung auf einem Vortex-Mischer über Nacht bei Raumtemperatur vollständig zu reduzieren und zu denaturieren Proteine. </li><li> Zentrifugieren der Proteinlösung, um unlösliches Material zu entfernen bei 18.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach dem Spin, den Überstand in ein neues Röhrchen und das Reagenzglas auf Eis. </li><li> Planen vier Volumina (60 ml) von Rückfaltungspuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM Cystin, 3,0 mM Cystein, 1 mM EDTA). Entgasen Rückfaltungspuffer. Bereiten auch 600 ul 10 mM Retinol in Ethanol unter dim rotes Licht. Halten Sie es im Dunkeln auf Eis. Sowohl die Rückfaltungspuffer und Retinol-Lösung müssen frisch zubereitet. </li><li> Abkühlen sowohl die Proteinlösung und die Rückfaltungspuffer auf Eis für mindestens 30 min. Höhere Temperaturen wahrscheinlich reduziert die Qualität der rückgefaltet RBP. 1 ml Rückfaltungspuffer zugetropft und 10 ul Retinol Lösung wiederum während Proteinlösung wird kräftig in einem Becherglas auf Eis gemischt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Rückfaltungspuffer und Retinolzugegeben. Halten Rühren der Reaktionsflüssigkeit auf Eis im Dunkeln für 5 Stunden. </li><li> Abzentrifugieren der Neufaltungsreaktion bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Es ist wesentlich, um die Aggregate direkt nach dem Neufaltungsreaktion entfernen. </li><li> Konzentrieren die überstehende Lösung mittels Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO 10 K) bis etwa 10 ml beträgt. Nicht konzentrieren die rückgefaltet Lösung mehr als dieser Ebene. Konzentrieren zu viel wird, um Proteinaggregation führen und senkt die endgültige Ausbeute und Qualität des korrekt gefalteten RBP. Verdünnen der konzentrierten Probe mit kaltem PBS auf 100 ml. Der Zweck dieses Schrittes ist es, die Komponenten in dem Neufaltungsreaktion, die mit Nickel stören Reinigung entfernen. </li><li> Drehe den Lösung noch einmal bei 24.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Es ist wichtig, einen Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in zwei 50 ml Röhrchen, die jeweils 1 ml Ni-NTA Gülle, die mit PBS gewaschen wurde. Drehen werden die Röhrchen bei 4 ° C für eine Stunde. Inkubation verdünnte Lösung foder 1 h kann das Ausfällen von fehlgefalteten Proteinen, die entfernt werden müssen. </li><li> Spin down die Röhrchen bei 500 xg für 3 min. Überstand entfernen vorsichtig. Alles floating entfernt werden sollte. Kaltes PBS auf 30 ml für jede Röhre. Spin wieder und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie nichts Beads im Röhrchen zu sehen. </li><li> Übertragen der Ni-NTA-Harz in einen leeren Spalte. Waschen Harz mit 20 Säulenvolumina 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl in PBS. Eluieren His-RBP in 5 Säulenvolumen 100 mM Imidazol in PBS. Nicht speichern diese Lösung über einen längeren Zeitraum, und Einfrieren verringert die endgültige Ausbeute und Qualität. Für das beste Ergebnis, reinigen RBP mittels HPLC sofort. </li><li> Dialysieren His-RBP von der Ni-NTA-Harz gegen 25 mM Tris, pH 8,4, und 120 mM NaCl gereinigt. Ein Konzentrator kann auch für Puffer-Wechsels benutzt. Klare Proben für die HPLC durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C direkt vor jedem Durchlauf. </li><li> Entschlacken Holo-RBP auf HPLC unter Verwendung einer Ionen-Austauschkolonne AX-300 durch einen NaCl-Stufengradienten (220 mM 12 min, 360 mM 15 min und 1000 mM 15 min) unter Verwendung von 25 mM Tris, pH 8,4 als mobile Phase mit 1 ml / min. Als NaCl-Konzentration ansteigt, wird Holo-His-RBP während apo-RBP freigegeben und fehlgefaltete RBP bleiben an die Säule gebunden (Abbildung 1). Wenn RBP Rückfaltung nicht getan ist optimal, fehlgefaltete RBP (zB fehlgefaltete RBP-I in Abbildung 1) kann die ganze Vorbereitung überwiegen. </li><li> Wiederherstellen der korrekt gefalteten Holo-RBP aus den Peak-Fraktionen bei 360 mM NaCl. Sorgfältig überwachen das Elutionsprofil von korrekt gefalteten und fehlgefaltete His-RBP. Bei 1.000 mM NaCl, fehlgefaltete meisten His-RBP freigelassen werden sollten. </li><li> Fraktionen, die Holo-RBP werden vereinigt, eingeengt, und gegen PBS über Nacht bei 4 ° C. Überprüfen Sie die endgültige Ausbeute und Qualität (330 nm/280 nm) durch Spektralphotometer. Korrekt gefalteten Produkt sollte eine 330 nm/280 nm Verhältnis etwas höher als 1 (Abbildung 1). </li><li> Um die Produktivität zue apo-RBP, fügen Sie ein gleiches Volumen Heptan zu den gereinigten Holo-RBP und vorsichtig mischen durch Drehen über Nacht bei 4 ° C. Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C und vorsichtig übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues Röhrchen (Vermeidung des Niederschlages an der Grenzfläche). Den Vorgang wiederholen, dreimal mit einer 3-stündigen Inkubation für jede. Überprüfen Absorption auf einer Nanodrop Spektralphotometer sicherstellen, dass die 330 nm Peak hat in den Hintergrund Ebene verringert. </li></ol> 2. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Release and Retinol Loading <ol><li> Blockieren eines schwarzen 96-Well-Microfluor-2 Platte (Thermo Scientific) mit 200 ul Blocker Casein (Pierce) über Nacht bei 4 ° C, um unspezifische Anhaften von Holo-RBP auf den Kunststoff zu vermeiden. Blocker Casein bietet die beste Sperrwirkung der alle Sperren Lösungen, die wir getestet. </li><li> Membranen frisch aus Zellen, die Stra6 oder Kontrolle Zellen hergestellt werden gewaschen mit PBS und durch eine Hamilton-Spritze (Gasti übergebenght # 1710) 6 mal, um eine gleichmäßige Suspension in PBS erzeugen. Wir verwenden typischerweise Membranen von 1/100 bis 1/20 der Zellen auf einer 100 mm Schale pro Reaktion gezüchtet abgeleitet. </li><li> Waschen Sie die beschichteten Wells der Microfluor-2 Platte einmal mit 200 ul PBS. Man kühlt die Platte auf Eis vor Zugabe Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Echtzeit-Überwachung von Retinol Fluoreszenz gemessen mittels Fluoreszenz Optik des POLARstar Omega (BMG Labtech) mit dem Anregungsfilter 320EX und dem Emissionsfilter 460-10. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 gesetzt. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Um die Retinol-Release-Assay zu starten, werden die Vertiefungen einmal mit dem Endpoint Lesen m lesenode vor Holo-RBP (typischerweise 1 pM Endkonzentration) bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. Um das Retinol Belastung Assay, all-trans-Retinol (typischerweise 1 uM Endkonzentration) gestartet wird den Brunnen unter dim rotes Licht aufgenommen. Die Platte wird einmal vor apo-RBP bei 0 min zugegeben wird gelesen. Sobald apo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 2 gezeigt) aus dem Omega Data Analysis Software (BMG Labtech) in Microsoft Excel für die Datenanalyse. Jeder Zeitpunkt erzeugt eine Datei, die die Messwerte aller experimentellen Bedingungen enthält. Zum Beispiel, wenn es 20 Zeitpunkte sind, zu festigen 20 Dateien in eine Excel-Datei für die Datenanalyse. </li><li> Zur Datenanalyse, werden die Fluoreszenzsignale vor der Zugabe von Retinol oder Holo-RBP bei 0 min als ein Hintergrundsignaled subtrahiert von den endgültigen Fluoreszenzsignale zu allen Zeitpunkten. Obwohl die Hintergrundsignale niedrig zu Retinol Fluoreszenz in Holo-RBP verglichen werden, Subtrahieren der Hintergrund eliminiert den Einfluss der unspezifischen Lichtstreuung durch die Membranen und macht es möglich, auf der Fluoreszenz von Retinol Holo-RBP oder Retinol hinzugefügt bei 0 min konzentrieren. </li></ol> 3. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Transport von Retinol Von Holo-RBP um CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP ist eine neue Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET)-Paar, das vor kurzem 41 gegründet. Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I wird in Echtzeit durch Messung Retinol-EGFP überwacht FRET. EGFP-CRBP-I-Fusionsprotein mit 6 × His-Tag (EGFP-CRBP-I) in Säugetierzellen hergestellt und wird auf Ni-NTA-Harz vor dem Experiment gereinigt. EGFP-CRBP-I kann in PBS mit Proteaseinhibitoren für eine kurze Zeit bei 4 ° C gelagert Alternativ kann das Fusionsprotein is in 80 ° C in kleinen Aliquots eingefroren. </li><li> Vor den Reaktionen, bereiten eine blockierte Microfluor-2 Platte und Membranen wie oben beschrieben. Waschen der beschichteten Wells der Platte Microfluor-2 einmal mit 200 ul PBS vor der Zugabe von Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Real-time Retinol-EGFP FRET gemessen mit POLARstar Omega mit dem Anregungsfilter 320EX und den Emissionsfilter 460-10 und 510-10 mit gleichzeitiger Duell Emissionsfluoreszenz Optik. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 pro Kanal. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Die Reaktionen, EGFP-CRBP-I (typischerweise 1 pM Endkonzentration) gestartet wird zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird auf Lesence mit dem Endpoint-Lesemodus, bevor Holo-RBP wird bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich durch Messung überwacht jeden 5-10 min für 1-2 Stunden. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 3 dargestellt) aus der Omega Data Analysis Software an Microsoft Excel zur Datenanalyse wie oben beschrieben. </li><li> Retinol-EGFP FRET wird durch die dynamische Änderung im Verhältnis der Akzeptor / Donor Emissionspeaks 47 berechnet. Die Gleichung 41, um dieses Verhältnis zu berechnen ist [(510 -510 t b) / (-460 460 t b)], worin T 510, 510 b, 460 t und 460 b repräsentieren Emissionen bei 510 nm nach der Initiierung der Reaktion ( t = Zeitpunkt), wird bei 510 nm vor Retinol oder Holo-RBP zugegeben (b = Hintergrund), bei 460 nm nach der Initiierung der Reaktion (t = Zeitpunkt), und bei 460 nm vor Retinol oder Holo-RBP angefügt (b = Hintergrund), jeweils. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir teilen hier eine optimierte RBP Produktion Protokoll, weil RBP Produktion und Reinigung Verfahren kritisch zu generieren korrekt gefaltet RBP sind. Angesichts der Möglichkeit von falsch gefalteten Spezies RBP und das Vorhandensein von Spurenmengen von bakteriellen Proteinen, auch bei HPLC gereinigten RBP bakteriell gebildete, ist es hilfreich zu nativem RBP aus Serum zu verwenden, um eine Aussage bezüglich RBP bestätigen. Urin RBP, welches kommerziell erhältlich ist, ist ein komplexes Gemisch von vielen Arten von RB...

Vitamin A ist ein organisches Molekül, das essentiell für das Überleben der Menschheit und das reibungslose Funktionieren fast aller menschlichen Organen. Vitamin A-Derivate (Retinoide) in verschiedenen biochemischen und zellulären Ereignisse, einschließlich der Erfassung von Licht zum Sehen 1,2 und der Regulation der Genexpression und Proteintranslation während der Embryonalentwicklung und in adulten Geweben 3-6 teilzunehmen. Obwohl Retinol hat die Fähigkeit, systemisch diffundieren, kam Evolution mit Plasma Retinol bindendes Protein, ein spezifischer Trägerprotein für Vitamin A im Blut eine hohe Effizienz und Spezifität zu erreichen und Toxizität mit zufälligen Diffusion 7-10 einhergehen, zu vermeiden. Ein Rezeptor mit hoher Affinität, die RBP bindet und nimmt Vitamin A wurde in den 1970er Jahren 11-13 vermutet. Trotz Beweise in drei Jahrzehnten von der Existenz des RBP-Rezeptor 14-31 angesammelt, wurde der Rezeptor-Hypothese seit vielen Jahren aufgrund der existenc diskutierte einer falschen Definition von Holo-RBP. Die korrekte Definition von Holo-RBP ist, dass es die hohe Affinität 1:1-Komplex aus Retinol und RBP ist. Wiederholte Extraktion von Holo-RBP durch organische Lösungsmittel ist notwendig, um apo-RBP produzieren. Diese Definition wird von fast allen Labors studieren RBP 7,9,32-35 oder die RBP-Rezeptor 14-31,36-42 verwendet. Die falsche Definition von Holo-RBP, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zu widerlegen wurde, ist die akute Mischung aus freien Retinol mit apo-RBP. Da die Funktion des Rezeptors in RBP Vitamin A Aufnahme von Holo-RBP ist Retinol von Holo-RBP freisetzen würde die RBP-Rezeptor keine Rolle spielen, wenn Retinol Aufnahme Retinol frei zu beginnen (wie durch die falsche Definition von Holo vorgeschlagen -RBP). Die jüngste Identifizierung von RBP Rezeptors als multitransmembrane Domain Protein namens STRA636 und seine Funktion in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP 36-43 dringend spricht gegen die Hypothese, dass RBP nichtbenötigen einen Rezeptor an Vitamin A. Detaillierte Analysen zeigten, dass Stra6 9 Transmembrandomänen mit dem N-Terminus extrazellulär lokalisiert und C-Terminus lokalisiert intrazellulär 40 weist liefern. Das zwischen Transmembran 6 und 7 ist ein wesentlicher RBP Bindungsdomäne 39. Stra6 ist sowohl LRAT und CRBP-I in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP verbunden, aber weder LRAT noch CRBP-I ist absolut für eine verbesserte Stra6 Aktivität 41 erforderlich. Stra6 Fähigkeit zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren ist der Schlüssel zu ihrer Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität 41. Durch das Abstützen auf Stra6 seiner Retinol freisetzen kann Vitamin A Lieferung durch RBP transportieren Vitamin A, um Zellen in den peripheren Geweben mit hoher Spezifität und Effizienz zielen. Die kritische Bedeutung des Holo-RBP Definition und Vorbereitung wird nicht nur durch die historische Debatte über die Existenz der RBP-Rezeptor dargestellt, sondern auch durch drei verwandten letzten Papiere auf Holo-RBP Definitionen dif Basisschiedenen von der ursprünglichen und korrekte Definition 44-46. Das erste Papier verwendet den Holo-RBP-Definition, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zur Untersuchung der RBP-Rezeptor 44 missbilligen wurde. Die zweite und dritte Papieren kam mit einer dritten Definition von Holo-RBP daß sie noch weniger wahrscheinlich Retinol untersucht werden, um eine ordnungsgemäße Anlage mit RBP 45,46 bilden. Diese Studien vorbereitet 3 H-retinol/RBP durch Mischen Holo-RBP (auch nicht apo-RBP) mit 3 H-Retinol. Da dieser Test nicht über 3 H-retinol/RBP gebildet und entfernte nicht übermäßigen freien 3 H-Retinol 45,46, es ist nicht ein Assay für 3 H-Aufnahme aus Retinol 3 H-retinol/RBP, sondern eine freie 3 H-Retinol Diffusionsassay. Es wurde zuvor daß Stra6 verbessert nicht zelluläre Aufnahme von Retinol frei von LRAT 38 oder CRBP-I 41 gezeigt. Praktisch alle Retinol zwangsläufig im Blut RBP und es keinen nachweisbaren free Retinol. Eine Hauptfunktion des RBP Rezeptor zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren während Retinol-Aufnahme von Holo-RBP 41. Wenn das Retinol künstlich freigesetzt wird oder in der freien Form mit 45,46 beginnen, wird die RBP-Rezeptor nicht erforderlich. Die drastisch unterschiedliche Ergebnisse aus der freien Retinol Diffusionsassay erhalten, um Tests auf richtig vorbereiteten Holo-RBP zeigen, dass die richtige Zubereitung von RBP Basis gegenüber ist entscheidend für seine funktionellen Assays. RBP kann aus menschlichem Serum 41 gereinigt werden, aber das Verfahren ist aufwendig, und die Ausbeute ist gering. Ein alternativer Ansatz ist die RBP in E. produzieren coli. Weil E. coli nicht in der Lage, richtig zu falten Säuger sezernierten Proteinen mit mehr als einem Paar von Disulfidbindungen wie RBP, ist es wesentlich, refold Rbp und reinigen das korrekt gefaltete Protein. Falsch gefaltete Proteine ​​nicht nur anders korrigiert gefalteten RBP in verschiedenen Tests verhalten,aber auch dazu führen, Proteinaggregation während der Lagerung. Aus dem gleichen Grund wird apo-RBP nur aus hochwertigem Holo-RBP hergestellt. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll zur Herstellung von hochwertigen RBP 100% mit Retinol durch bakterielle Expression, Rückfaltung und HPLC-Reinigung geladen. HPLC-Reinigung entfernt nicht nur falsch gefaltete RBP aber auch erhebliche bakterielle Kontamination, die schwere Artefakte verursachen kann, wenn RBP in der Signaltransduktion Assays verwendet wird. Wir beschreiben auch zwei empfindliche Echtzeit-Monitoring-Techniken zu Retinol Transport per Stra6 studieren. Beide Techniken sind abhängig von hoher Qualität RBP. Aus Platzgründen werden die klassischen Techniken der radioaktiven Retinoid-basierten und HPLC-basierte Vitamin-A-Aufnahme-Assays werden hier nicht beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fischer </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> Retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Fischer </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Casein </td><td> Durchstechen </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Platte </td><td> Fischer </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze Gasdichte # 1710 </td><td> Fischer </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyse von retinol transport durch die membran-rezeptor von plasma retinol binding protein

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A ist für das Sehen wichtig und das Wachstum / Differenzierung von fast allen menschlichen Organen. Plasma Retinol bindendes Protein (RBP) ist das Prinzip und spezielle Träger von Vitamin A im Blut. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Holo-RBP und zwei Echtzeitüberwachung Techniken, um den Transport von Vitamin A durch den hochaffinen Rezeptor RBP Stra6 studieren. Die erste Technik ist es möglich, eine große Menge an qualitativ hochwertigen Holo-RBP (100% mit Retinol-loaded) für Vitamin A Transport-Assays zu erzeugen. Hochwertige RBP ist essentiell für funktionelle Assays, weil fehlgefaltete RBP Versionen Vitamin A leicht und bakterielle Kontamination in RBP Vorbereitung kann Artefakte verursachen. Echtzeit-Überwachung Techniken wie Elektrophysiologie wurden kritische Beiträge zu den Untersuchungen von Membran-Transport gemacht. Die RBP rezeptorvermittelte Retinol Transport nicht in Echtzeit bis vor kurzem wurden analysiert. Der zweite hier beschriebene Technik ist der Grundl-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Freisetzung oder loading. Die dritte Technik ist die Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP, um zelluläre Retinol bindendes Protein I (CRBP-I). Diese Techniken bieten eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung bei der Aufdeckung RBP Rezeptors Vitamin A-Aufnahme-Mechanismus.

Wir stellen Ihnen hier repräsentative Ergebnisse für Holo-RBP Produktion und Reinigung durch HPLC (Abbildung 1), Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Release von Holo-RBP und Retinol Laden in apo-RBP (Abbildung 2) und Echtzeit-Analyse Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I (Abbildung 3). Ohne Rückfaltung, hergestellt RBP in Bakterien fast vollständig fehlgefaltete aufgrund der Anwesenheit von vielen fal...

Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Dieses Protokoll zeigt die Produktion von hochwertigem Plasma-Retinol-Bindungsprotein, das verwendet wird, um die Aktivitäten des Retinol-Bindungsproteinrezeptors in Echtzeit zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine große Menge an Retinol-Bindungsprotein aus Bakterien exprimiert und gereinigt wird. Das gereinigte Retinol-Bindungsprotein wird vollständig denaturiert und in Gegenwart seines Liganden Retinol langsam wieder gefaltet.Dann wird das korrekt gefaltete Retinol-Bindungsprotein mittels HPLC aufgereinigt, um falsch gefaltete Proteine und bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Sobald ein hochwertiges Retinol-Bindungsprotein erhalten ist, kann es verwendet werden, um die Aktivitäten seines Membranrezeptors bei der Katalyse der Retinolfreisetzung, der Retinol-Beladung oder des Retinol-Transports zum zellulären Retinol-Bindungsprotein eins zu untersuchen. In Echtzeit.Heute werde ich unser verbessertes Protokoll zur Reform und Reinigung von retinalen Bindungsproteinen produzierenden Bakterien vorstellen. Mit dieser Technik kann ein hochwertiges retinales Bindungsprotein hergestellt werden, das für funktionelle Assays unerlässlich ist. Ich werde die neu entwickelt

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Forschung

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Biology

Biologie

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