Name: Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die Generierung stabiler menschlicher Zelllinien mit Tet-on-induzierbarer shRNA- oder cDNA-Expression. Diese Methode ermöglicht reversible Genregulation für funktionelle Studien.

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Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors für hilfreiche Diskussionen. Wir danken Joanna Lisztwan und Christina Gewinner für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der BBSRC Gewährung BB/I021248/1 unterstützt und die Wellcome Trust Gewährung 090090/Z/09/ZAH ist ein Wellcome Trust Research Career Development Fellow an der UCL Cancer Institute.

Ein. Klonierung pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Wie in 3 dargestellt, führen einen teilweisen Verdau des Plasmids pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I, die TetR-Gen und den Promotor des Blasticidin Widerstand (BlastR)-Gen zu entfernen. Isolieren Sie die 4,6 kb Vektorfragment. </li><li> Um die Polyadenylierungssequenz aus der TetR-Gen zu entfernen, durch PCR einzuführen eine Xho I-Stelle unmittelbar nach dem Stop-Codon des TetR cDNA gleichzeitiger Schonung der Xba I-Stelle am 5&#39;-Ende der cDNA. Subklonieren das resultierende Fragment in pMigR1 17 unter Verwendung von Restriktionsenzymen XbaI und XhoI zur Erzeugung des pMigR1_TetR Plasmid. </li><li> Verdauen pMigR1_TetR Vektor mit den Restriktionsenzymen Xba I und Nco I-Fragment, um die TetR_IRES freizugeben. Isolieren Sie das 1,25 kb Insert-Fragment. </li><li> Ligieren das 4,6 kb pcDNA6/TR und die 1,25 kb TetR_IRES Fragmente. Transform des Ligationsprodukts in kompetente E.coli und Identifizierung des gewünschten pcDNA6_TetR_IRES_blast Konstrukt unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken. </li></ol> 2. Generierung von Zelllinien stabil exprimieren TetR <ol><li> Am Tag 1 Seed 1x10 6 Zellen pro 10-cm Gewebekulturplatte mit Ihrem Standard-Wachstumsmedium (zB DMEM ergänzt mit 10% FCS). Seed zwei Platten, eine für die Transfektion mit pcDNA6_TetR_IRES_blast, und die andere als eine negative Kontrolle für Blasticidin Selektion. Stellen Sie sicher, den günstigsten Durchgang möglich und die empfohlene Wachstumsmedium zu verwenden. </li><li> Am Tag 2 transfizieren eine Platte mit 2 ug pcDNA6_TetR_IRES_blast mit Fugene 6 (e2691, Promega) nach den Anweisungen des Herstellers. Nicht transfizieren die zweite Platte. </li><li> Am Tag 3, fügen Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin an beide Platten. Bitte beachten Sie, dass die optimale Auswahl Konzentration kann für eine bestimmte Zelllinie variieren und vielleicht need vorher festgelegt werden. </li><li> Am Tag 4 aufgeteilt, die Zellen mit 1/5, 1/25, 1/50 und 1/100 unter Verwendung von 10-cm Platten und Standard-Wachstumsmedium, das 5 mg / ml Blasticidin. Stellen Sie sicher, richtig zu beschriften Platten mit untransfizierte oder transfizierten Zellen. Bereiten Sie zwei Platten pro Verdünnungsstufe. </li><li> Überprüfen Zellen täglich, sicherzustellen, dass alle Zellen auf den transfizierten Platten haben innerhalb der ersten Woche gestorben. Auswahl ändern media alle 2-3 Tage. </li><li> Nach 1-2 Wochen sollte Blasticidin-resistente Kolonien beginnen zu erscheinen. Wählen Platten mit 5 bis 50 Kolonien, sicherzustellen, dass einzelne Kolonien ausgewählt werden können. </li><li> Wenn Kolonien haben einen Durchmesser von ca. 5 mm (oder größer) erreicht, Isolieren mindestens 12 unabhängigen Klonen mittels Klonierung Zylindern, um einzelne Kolonien zu wählen. Übertragen jeder Klon in ein separates Loch einer 24-Well Gewebekulturplatte. Wenn konfluent, spalten die Zellen aus jeder Vertiefung in einem einzigen Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte. </li><li> Weiter zu Kultur cldiejenigen in der Auswahl Medien. Wenn konfluent, geteilte Zellen aus jeder Vertiefung in zwei einzelne Vertiefungen einer 6-well Gewebekulturplatten. </li><li> Für jeden zu testenden Klon, eingefroren eine Vertiefung konfluenten Zellen und Ernte Zellen in der anderen gut für nachfolgende Prüfung durch Immunblotting. </li><li> Detect TetR durch Western-Blot mit dem monoklonalen anti-TET02 Antikörper (MoBiTec GmbH). Erinnern, um ein Lysat der parentalen Zelllinie als Negativkontrolle umfassen. </li><li> Wählen Sie 3 Klone mit der höchsten TetR Ausdruck und erweitern Sie jeden klonalen Kultur. Einfrieren Bestände jedes vielversprechende Klon so schnell wie möglich. Schließlich prüft die molekularen und zellbiologischen interessierenden Parameter durch Vergleichen der parentalen Zellinien mit den TetR-exprimierenden Klonen. Wählen Sie den &quot;besten&quot; Klon mit der höchsten TetR Ausdruck, der nicht angezeigt wird keine Veränderungen in den molekularen und zellbiologischen Parameter von Interesse. </li></ol> 3. Pilot Prüfung von pter und pT-Rex DEST30 Vektoren Expressten shRNA oder cDNAs, Jeweils <ol><li> Generieren PTER Plasmid mit shRNA Inserts 12, wie beschrieben. Konstrukt pT-Rex DEST30 Vektor (12.301 bis 016, Invitrogen), enthaltend die cDNA von Interesse mittels Gateway-Technologie (Invitrogen). Im Fall von cDNA-Expression wird die Zugabe eines Tags der cDNA später zu erleichtern Erkennung von exogen exprimierten Proteins. </li><li> Transient zu transfizieren die elterliche Zielzelle Einklang mit PTER oder pT-Rex DEST30 Plasmide (Ausdruck entweder shRNAs oder cDNAs von Interesse) mit dem Transfektionsreagenz der Wahl. Für die Prüfung von shRNA Expressionsplasmide, sorgen für eine hohe Transfektionseffizienz erreicht werden kann. </li><li> Ernte transfizierten Zellen und Verfahren zur Immunoblot mit den entsprechenden Antikörpern in der Erwartung, eine Verarmung oder Überexpression des Gens von Interesse zu erkennen. </li></ol> 4. Erzeugung von stabilen Zelllinien mit Tetrazyklin-induzierbarer (Tet-On) Expression von cDNAs oder shRNAs Verwenden PTER oder pT-Rex DEST30 Vektoren </p&gt; <ol><li> Am Tag 1, Saatgut 1x10 6 Zellen der &#39;besten&#39; TetR-exprimierenden Klon pro 10-cm-Platte mit Ihrem Standard-Wachstumsmedium mit zertifizierten Tetracyclin-Serum (zB FBS von Invitrogen; 16.000-014) ergänzt. Samen einer Platte für die Transfektion mit PTER (oder pT-Rex DEST30) und eine Platte als Negativkontrolle für Doppelselektion. Stellen Sie sicher, den günstigsten Durchgang möglich zu nutzen. </li><li> Am Tag 2 transfizieren eine Platte mit 2 ug PTER (oder pT-Rex DEST30) mit Fugene 6. Nicht transfizieren die zweite Platte. </li><li> Am Tag 3, fügen Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin und 500 ug / ml Zeocin (oder 1 mg / ml G418). </li><li> Am Tag 4 teilen die Zellen mit 1/5, 1/25, 1/50 und 1/100 mit 10-cm-Platten und Standard Wachstumsmedium mit 5 ug / ml Blasticidin und 500 ug / ml Zeocin (oder 1 mg / ml G418). Bereiten Sie zwei Platten pro Verdünnungsstufe. </li><li> Überprüfen Sie die Zellen täglich, um sicherzustellen, dass innerhalb der ersten Woche alle Zellen auf den transfizierten Platten sind gestorben.Ändern Sie den Standard-Wachstumsmedium mit Blasticidin und Zeocin (oder G418) alle 3-4 Tage. </li><li> Nach 2-3 Wochen, Blasticidin / Zeocin (oder blasticidin/G418) Doppel-resistente Kolonien sollten beginnen zu erscheinen. Wählen Platten mit 5 bis 50 Kolonien, um einzelne Kolonien zu pflücken. </li><li> Wenn Kolonien haben einen Durchmesser von ca. 5 mm (oder größer) erreicht, verwenden Klonen Zylindern, um einzelne Kolonien zu pflücken. Isolieren mindestens 24 einzelnen Klonen. Übertragen jeder Klon in ein separates Loch einer 24-Well Gewebekulturplatte. </li><li> Kultur Klone in Medium, das Wartungs-Konzentrationen von Blasticidin (5 ug / ml) und Zeocin (250 pg / ml) [oder G418 (0,5 mg / ml)]. Wenn konfluent, spalten die Zellen aus jeder Vertiefung in einem einzigen Well einer 6-Well-Gewebekulturplatte. </li><li> Für jeden zu testenden Klon, aufgeteilt ein konfluenter Well einer 6-Well-Platte in drei einzelnen Wells einer 6-Well-Platte. Wenn konfluent, einzufrieren Zellen von einem gut. Verwenden Sie die verbleibenden zwei Kavitäten für die Prüfung der TetracyclinE-induzierbare Expression. Fügen Tetracyclin in einer Konzentration von 1 pg / ml zu einem gut, während die zweite und Tetracyclin kostenlos. </li><li> Nach 24 bis 96 Stunden Inkubation mit Tetracyclin, Ernte-Zellen und Verfahren zur Immunoblotting unter Verwendung geeigneter Antikörper. Kürzere Tetracyclin Inkubationszeiten werden empfohlen, wenn Screenen für die Induktion von cDNA-Expression, während längere Tetracyclin Behandlungen notwendig sein wird, shRNA-vermittelte Abreicherung von endogenen Proteinen zu bestimmen. </li><li> Wählen Sie mindestens zwei Klone mit der gewünschten Abbau / Überexpression und erweitern jede Kultur. Einfrieren Bestände jedes vielversprechende Klon so schnell wie möglich. Beim Anbau von Tet-on-Klone für Experimente immer darauf achten, Medien mit Tetracyclin-freies Serum und den jeweiligen Selektionsantibiotika bei Wartung Konzentrationen ergänzt verwenden. </li></ol>

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<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
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<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
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<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir glauben, dass Tet-On-Systeme erheblich erleichtern die Analyse der Genfunktion, insbesondere in Zellsysteme, die schwierig zu manipulieren und / oder wenn die manipulierte Gen ist essentiell für das Überleben der Zelle sind. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, die Genexpression durch hochspezifische Tet-On-Systeme kontrollieren die Möglichkeit Genfunktionen in verschiedenen Phasen (zum Beispiel während der Zellzyklusprogression oder wohldefinierten Differenzierungsprozesse) studieren. Die hier vorgestellten Verfahr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Überprüft Tet-free </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA Laboratories </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml im Medium </td></tr><tr><td> Anti-TET02 </td><td> MoBiTec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Verwenden Sie bei 1/1000 bis 1/2000 für WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml in Ethanol </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml in Wasser </td></tr><tr><td> Cloning Zylinder </td><td> Bellco Glass Inc. </td><td> 2090-00808 </td><td> wieder verwendbare </td></tr></tbody></table>

generierung von stabilen menschlichen zelllinien mit tetracyclin-induzierbarer (tet-on) shrna oder cdna expression

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Ein wichtiger Ansatz im Bereich der Säugerzelle Biologie ist die Manipulation der die Expression von Genen von Interesse in ausgewählten Zellinien, mit dem Ziel, zu enthüllen einem oder mehreren der des Gens Funktion (en) unter Verwendung von transienten / stabile Überexpression oder Knockdown des Gens von Interesse. Leider für verschiedene zellbiologische Untersuchungen dieser Ansatz ist ungeeignet, wenn Manipulationen der Genexpression führen Zellwachstum / Zellproliferation Mängel oder unerwünschte Zelldifferenzierung. Daher haben Forscher die Tetracyclin-Repressorprotein (TetR), genommen aus dem E. angepaßt coli Tetracyclin-Resistenz-Operons 1, zu einer sehr effizienten und engen regulatorischen Systeme zu erzeugen, um cDNAs in Säugerzellen 2,3 auszudrücken. Kurz gesagt, hat TetR um entweder (1) Block Initiation der Transkription wurde durch Bindung an das Tet-Operator (TO) in der Promotorregion nach Zugabe von Tetracyclin (Tet-off bezeichnet System) oder (2) binden an die AN in modifizierter tEr Abwesenheit von Tetracyclin (sog. Tet-On-System) (Abbildung 1). Angesichts der Unannehmlichkeiten, das Tet-Off-System die kontinuierliche Anwesenheit von Tetracyclin (welches eine Halbwertszeit von etwa 24 Stunden in Gewebe Zellkulturmedium) erfordert das Tet-On-System wurden ausführlicher optimiert, was in der Entwicklung von sehr engen und effiziente Vektor-Systeme für die cDNA-Expression, wie hier verwendet. Kurz nach der Gründung der RNA-Interferenz (RNAi) für die Gen-Knockdown in Säugetierzellen 4, Vektoren, kurz-hairpin RNAs (shRNAs) beschrieben wurden diese Funktion sehr ähnlich siRNAs 5-11. Jedoch haben diese shRNA-vermittelte Knockdown Ansätze die gleiche Einschränkung wie herkömmliche Knockout Strategien, da stabile Abreicherung nicht durchführbar, wenn Genziele für zelluläre Überleben essentiell. Um diese Einschränkung zu umgehen, van de Wetering et al. 12 veränderte die shRNA Expressionsvektor pSUPER 5 </sup&gt; durch Einfügen eines TO in der Promotorregion, die sie zu stabilen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbare Depletion ihrer Zielgene von Interesse zu erzeugen aktiviert. Hier beschreiben wir ein Verfahren effizient zu erzeugen stabilen menschlichen Tet-On Zell-Linien, die zuverlässig fahren entweder induzierbare Überexpression oder Abreicherung des Gens von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich generiert Tet-on-Zelllinien, die wesentlich erleichtert die Analyse der MST / hMOB / NDR Kaskade in Zentrosom 13,14 und Apoptose Signalisierung 15,16. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Vektoren der Wahl, neben der Beschreibung der zwei aufeinander folgenden Manipulationen Schritte, die erforderlich sind, um effizient zu erzeugen sind menschliche Tet-on-Zelllinien (Abbildung 2). Außerdem neben umreißt ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen Tet-On Zell-Linien werden wir kritischen Aspekte hinsichtlich der technischen Verfahren und die Charakterisierung von Tet-On-Zellen zu diskutieren.

Ein Beispiel für die erstmalige Beschreibung RPE-1-Zelllinien stabil exprimieren TetR ist in Abbildung 4 dargestellt. Beachten Sie, dass alle RPE-1 Klone unterschiedlicher TetR ausdrücken (vgl. Bahnen 2 und 5), während die elterliche Zelllinie (die als negative Kontrolle) nicht exprimiert die exogene TetR-Protein (Abbildung 4, Spur 1). Diese Variation in TetR Expression unter RPE-1 Tet-On Zell-Klone wird erwartet, da die Expression des TetR exprimierenden Plasmiden ist stark abhängig vo...

Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.

Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens ist die Erzeugung stabiler humaner Zelllinien mit tetracyclininduzierbarer S-H-R-N-A- oder CDNA-Expression. Transfizieren Sie zunächst Zielzellen mit dem Tatar-Expressionsplasmid und selektieren Sie auf Blaster-Seiten-Resistenz. Anschließend einzelne Kolonien auswählen und auf Zellen screenen, die das Tet-Repressorprotein stabil exprimieren. Als Nächstes transfizieren Sie den besten Teta-exprimierenden Klon mit Plasmiden, die darauf ausgelegt sind, die Expression des Zielgens unter Kontrolle des Tet-Antwortelements zu modulieren. Die transfizierten Zellen unter Doppel-Auswahl werden dann einzeln kloniert, und einzelne Kolonien werden mittels Western Blot auf die gewünschten Teton-Klone untersucht. Letztendlich können die resultierenden Teton-Klone verwendet werden, um die Auswirkungen spezifischer Zielstrukturen auf ausgewählte biologische Parameter zu untersuchen.Die Durchführung des Verfahrens wird von einem Postoc im Labor durchgeführt. Marty Gomez Martinez erzeugt einen Vektor, der die Expression des Tet-Repressors und des Blain-Resistenzgens von demselben CMV-Promotor aus in zwei 10-Zentimeter-Zellkulturplatten mit einmaliger Zentrifugation der sechs Zellen in Standardwachstumsmedium steuert, wobei eine Platte für die Transfektion mit einem Tatar-Expressionsplasmid und die andere als negativer Kontrollansatz für die Blain-Selektion dient. Am nächsten Tag wird eine Platte mit zwei Mikrogramm des TTA-Expressionsplasmids unter Verwendung von FU Gen sechs transfiziert.Gemäß den Herstelleranweisungen die Kultur anschließend über Nacht neben beiden Platten inkubieren. Nach 24 Stunden Standardwachstumsmedium mit der optimalen Konzentration an Blastin für die verwendete experimentelle Zelllinie hinzufügen, die Zellen ernten und 10-Zentimeter-Platten zur seriellen Verdünnung beschriften. Anschließend Duplikate der seriellen Verdünnung unter Verwendung von Standardwachstumsmedium, das fünf Mikrogramm pro Milliliter Blaster enthalten soll, ausplattieren. Sicherstellen, dass die Platten mit den nicht-resezierten oder transfizierten Zellen ordnungsgemäß beschriftet sind. Die Zellen beobachten, wobei insbesondere zu beachten ist, dass alle Zellen auf den nicht-resezierten Platten innerhalb der ersten Woche abgestorben sind.Wechseln Sie das Selektionsmedium alle zwei bis drei Tage nach ein bis zwei Wochen, sobald die Blasticidin-resistenten Kolonien erscheinen. Wählen Sie Platten aus, die zwischen fünf und 50 Kolonien enthalten, um sicherzustellen, dass einzelne Kolonien abgegriffen werden können, sobald die Kolonien einen Durchmesser von etwa fünf Millimetern erreicht haben. Isolieren Sie mindestens 12 unabhängige Klone mithilfe von Klonierungszylindern, um einzelne Kolonien aufzunehmen.Überführen Sie jeden Klon in eine separate Vertiefung einer 24-Loch-Platte und kultivieren Sie die Zellen bis zur Konfluenz. Ernten und überführen Sie die Zellen jeder Kolonie in einzelne Vertiefungen einer sechslochigen Gewebekulturplatte. Kultivieren Sie die Klone weiterhin in Selektionsmedium, sobald die Kulturen konfluent sind.Teilen Sie die Zellen aus jedem Well in zwei einzelne Wells einer sechs-Well-Zellkulturschale auf. Für jeden zu testenden Klon frieren Sie einen Well der konfluenten Zellen ein. Ernten Sie die Zellen aus dem zweiten Well zur Evaluierung der Tatar-Proteinexpression.Führen Sie einen Westernblot an den Klonen unter Verwendung eines Lysats der ursprünglichen Zelllinie als negativen Kontrollansatz zur Detektion des Tatar-Proteins durch. Verwenden Sie den mausmonoklonalen Anti-Tet-zero-zwei-Antikörper. Fahren Sie mit der Ausweitung der drei Klone mit der höchsten Testar-Expression fort.Legen Sie so schnell wie möglich Freilager jeder vielversprechenden Klonlinie an. Nun sind die klonalen Zellen bereit, um Ihre gewünschten molekularen und zellulären Parameter zu untersuchen. Durch den Vergleich der ursprünglichen Zelllinien mit den Tatar exprimierenden Klonen wählen Sie den besten Klon mit der höchsten Tatar-Expression aus, der keine Veränderungen in den gewünschten molekularen und zellbiologischen Parametern aufweist.Erzeugen Sie PTER-Plasmide mit HRNA-Einschüssen der gewünschten Sequenzen. Konstruieren Sie außerdem einen PT REX desk 30-Vektor, der das CDNA von Interesse mittels Gateway-Technologie enthält. Transfektieren Sie die parentale Zielzelllinie vorübergehend mit PTER- oder P T-Rex S 30-Plasmiden.Unter Verwendung der gewünschten Transfektionsreagenzien. Danach die transfizierten Zellen gewinnen und die Expression des Zielgens durch Immunfärbungen überprüfen. Am ersten Tag zwei Platten des besten Tetracyclin-exprimierenden Klons mit Standard-Wachstumsmedium, ergänzt durch zertifiziertes, tetracyclinfreies Serum, über Nacht kultivieren.Am nächsten Tag transfectieren Sie nur eine Platte mit zwei Mikrogramm A-S-H-R-N-A- oder CDNA-Expressionsplasmid unter Verwendung von FU Gen sechs. Am Tag drei geben Sie Standard-Wachstumsmedium, das entweder fünf Mikrogramm pro Milliliter Blastin und 500 Mikrogramm pro Milliliter Eosin oder Blastin und G vier 18 enthält, hinzu. Am Tag vier dann teilen Sie die Zellen auf, um Verdünnungsansätze in duplizierter Form mittels Standard-Wachstumsmedium für die Doppel-Seletion herzustellen.Überprüfen Sie die Zellen täglich auf den Zelltod als Reaktion auf die Antibiotikabehandlung und ergänzen Sie das Medium alle drei bis vier Tage. Nach zwei bis drei Wochen, wenn in Zein oder G418 resistente Kolonien, die doppelt resistent sind, beginnen, sichtbar zu werden.Wählen Sie die Platten mit fünf bis 50 Kolonien aus, um einzelne Kolonien zu isolieren, und kultivieren Sie diese, bis die Kolonien einen Durchmesser von etwa fünf Millimetern oder größer erreicht haben. Mit Klonierungszylindern werden einzelne Kolonien ausgewählt und in getrennte Vertiefungen einer 24-Loch-Gewebekulturplatte übertragen. Die Klone werden in Medium mit Erhaltungskonzentrationen von fünf Mikrogramm pro Milliliter Blaster, Soin und 50 Mikrogramm pro Milliliter kultiviert.Eosin oder Blaster Soin und G vier 18. Wenn konfluent, teilen Sie die Zellen aus jedem Well in einen einzelnen Well einer sechs-Well-Zellkulturplatte auf. Wenn konfluent, teilen Sie die Zellen auf drei Wells einer sechs-Well-Platte auf, um sie bis zur 100 %igen Konfluenz zu kultivieren.Gefrieren Sie die Zellen aus einem Brunnen, um die induzierbare Expression zu testen, und geben Sie einen Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin zu einem Brunnen, während der zweite Zellbrunnen ohne Tetracyclin bleibt. Inkubieren Sie ohne Tetracyclin für 24 bis 96 Stunden, wobei kürzere Zeiträume der Überprüfung der Induktion der CD-NA-Expression dienen und längere Zeiträume der Bestimmung der S-H-R-N-A-vermittelten Depletion endogener Proteine dienen. Anschließend die Zellen gewinnen und mittels der geeigneten Antikörper zur Immunkomplexbildung aufarbeiten.Wählen Sie mindestens zwei Klone mit der gewünschten Verringerung oder Überexpression aus und vergrößern Sie jeweils die Kultur. Denken Sie daran, Bestände jedes vielversprechenden Klons so schnell wie möglich anzulegen. Diese erste Charakterisierung einer humanen retinalen Pigmentepithelzelllinie für die stabile Expression von tatar zeigt alle RPE-eins-Klone, die unterschiedliche Mengen an tatar exprimieren.Wie erwartet exprimiert die parentale RPE-eine-Zelllinie das exogene Tatar-Protein nicht. Die Variation der Tet-R-Expression unter den RPE-eine-Teton-Zellklonen spiegelt die Plasmidintegrationsstellen wider. Dieses Experiment charakterisiert stabile RPE-eine-Teton-Zellklone, die RNAs exprimieren, die gegen die MST-drei-Kinase gerichtet sind; drei Zellklone wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, verfügen Sie über ein gutes Verständnis dafür, wie stabile humane Zelllinien mit der unregulierten Expression Ihrer Forschungs-RNA oder cDNA Ihrer Wahl erzeugt werden können.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Dieses Video demonstriert das Genexpressionssystem von Tetracyclin oder Tet-On in einem Mausmodell. In Gegenwart von Doxycyclin, einem Tetracyclin-Derivat, wird das Tet-On-System, bestehend aus reversem Tetracyclin-kontrolliertem Transaktivatorprotein, aktiviert und exprimiert das interessierende Gen.

Induzierbare Tet-On-regulierbare systembasierte Genexpression in vivo: Ein Tetracyclin-induziertes Genexpressionssystem für die Aktivierung der Zielgentranskription im Mausmodell

Dieses Video beschreibt die Methode zur Regulierung der Genexpression in kultivierten Zellen durch Transfektion mit einem Plasmid, das ein Gen von Interesse und ein regulatorisches Plasmid enthält. Die Expression dieses Plasmids kann durch Tetracyclin oder seine synthetischen Analoga gesteuert werden, was dieses System zu einem nützlichen Modell für die Untersuchung der regulierbaren Genexpression macht.

Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren antigen-spezifische T-Zell-Rezeptoren (TCRs) durch Paarung der TCR &amp; agr; oder TCR &amp; bgr; TCR eines bestehenden, besitzen die Antigen-Spezifität von Interesse, mit komplementären hemichain der peripheren T-Zell-Rezeptor-Repertoire zu erzeugen. Die de novo erzeugt TZR behalten Antigen-Spezifität mit Affinität zu variieren.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.

Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Hier stellen wir ein Werkzeug vor, mit dem die posttranskriptionische Modulation eines Transkripts in primären Alveolarepithelzellen mithilfe eines induzierbaren Expressionssystems, das an eine Pipettenelektroporationstechnik gekoppelt ist, untersucht werden kann.

Effizientes transkriptionsgesteuertes Plasmidexpressionssystem zur Untersuchung der Stabilität von mRNA-Transkripten in primären Alveolar-Epithelzellen

In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Lernen Sie die Generierung stabiler menschlicher Zelllinien mit Tet-on-induzierbarer shRNA- oder cDNA-Expression. Diese Methode ermöglicht reversible Genregulation für funktionelle Studien.

Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

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