Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique
15. Mai 2013
Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich, um Messungen der Atmungsorgane Mechanik sowie die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin bei Mäusen mit der erzwungenen Schwingung Technik (flexiVent auszuführen; SCIREQ Inc, Montreal, QC , Kanada).
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, erzwungene Oszillationsmessungen der Atemmechanik bei Mäusen mit dem flex event, einem kommerziellen computergesteuerten Kolbenbeatmungsgerät, zu demonstrieren. Dies geschieht durch die Beurteilung der Reaktionsfähigkeit der Atemwege auf inhalatives Methylcholin. Der erste Schritt besteht darin, die erforderlichen Reagenzien, die Ausrüstung und den Probanden vorzubereiten.
Dann wird der Proband an das Beatmungsgerät angeschlossen, um die mechanische Beatmung und die Atemwegsmechanik zu messen. Unter Verwendung eines vordefinierten Skripts wird eine Sammlung von hochgradig kontrollierten automatisierten Messungen zu Studienbeginn und nach der Methylcholin-Herausforderung durchgeführt. Die Analyse der Ergebnisse kann eine Hyperreagibilität der Atemwege zeigen, was sich in den größeren maximalen Reaktionen von Resistenz und Elastin bei chlorexponierten Mäusen im Vergleich zu Kontrollpersonen zeigt.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie ein genaues Werkzeug zur umfassenden, detaillierten und translationalen Messung der Lungenfunktion bietet. Dies wird durch die Analyse von Druck- und Volumensignalen erreicht, die als Reaktion auf vordefinierte oszillierende Luftstromwellenformen erfasst werden, die an der Atemwegsöffnung des Probanden angewendet werden. Darüber hinaus können viele Faktoren, die die physiologische Reaktion beeinflussen, kontrolliert und standardisiert werden.
Schalten Sie mit dieser Methode das Flex Event FX-System ein und starten Sie die Software. Das vorliegende Protokoll gilt für eine der beiden Flex-Ereignisgenerationen, die von flexi unterstützt werden. Tragen Sie die Seven-Software bei der ersten Experimentiersitzung oder zu einem beliebigen Zeitpunkt davor. Öffnen Sie das Modul zur Studiendefinition und -planung, um die Studienstruktur vorzudefinieren.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Studie erstellen und folgen Sie dem Assistenten, um eine Studie zu erstellen. Skizzieren Sie das Protokoll und definieren Sie die Versuchsgruppen und Probanden, die untersucht werden sollen. Initiieren Sie eine Experimentiersitzung, indem Sie das Experimentiersitzungsmodul öffnen und der Startreihenfolge folgen.
Für das Studium und die Auswahl von Vorlagen. Weisen Sie der Messstelle ein Motiv zu und bestätigen Sie dessen Gewichtung. Fahren Sie mit der Kalibrierung des Systems fort, indem Sie die in der Betriebssoftware beschriebenen Schritte ausführen.
Es wird aufgefordert, die Kanüle, die zur Kalibrierung verwendet werden soll, am Y-Schlauch zu befestigen. Fahren Sie mit der Kalibrierung der Kanüle fort, indem Sie die Schritte im Kalibrierassistenten ausführen und überprüfen, ob die erhaltenen Kalibrierwerte innerhalb des angegebenen Bereichs liegen. Wiederholen Sie bei Bedarf den Kalibrierungsvorgang, sofern nicht bereit, und brechen Sie die Eingabeaufforderungen ab, um die Belüftung und Datenaufzeichnung zu starten.
Diese können zu einem späteren Zeitpunkt angestoßen werden. Betäuben Sie den Probanden mit geeigneten Dosen von Anästhetika. Stellen Sie sicher, dass der Proband ein chirurgisches Anästhesieniveau erreicht hat.
Der Proband sollte keine Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen zeigen und seine Atmung sollte regelmäßig und nicht mühsam sein. Positionieren Sie das Tier in Rückenlage mit einer Wärmequelle, um die richtige Körpertemperatur zu halten. Eine 60-Watt-Glühbirne, die 45 Zentimeter von der Maus entfernt platziert ist, ist ausreichend.
Reinigen Sie dann den Halsbereich mit Alkohol, um die Luftröhre freizulegen. Machen Sie einen Schnitt und trennen Sie vorsichtig die Unterkieferdrüse und die sie umgebende Muskelschicht. Heben Sie die Luftröhre vorsichtig mit einer Mikrozange an.
Führen Sie dann eine Naht darunter ein. Schneiden Sie zwischen den beiden Knorpelringen, die dem Kehlkopf am nächsten sind. Dadurch wird ein kleiner Schnitt in die Luftröhre gemacht, ohne sie zu durchtrennen.
Führen Sie die kalibrierte Kanüle in den Schnitt ein und schieben Sie sie sanft durch fünf Trachealringe. In diesem Beispiel ist eine 1,2 Zentimeter große 18-Gauge-Kanüle aus Metall in Betrieb. Es ist wichtig, die Kanüle mit der Naht zu sichern.
Der Aufsatz sollte die Kanüle luftdicht abschließen. Bringen Sie das kanülierte Tier in die Nähe des Beatmungsgeräts. Starten Sie die mechanische Lüftung, indem Sie im Lüftungsdocker ein vordefiniertes oder ein benutzerdefiniertes Lüftungsprofil auswählen.
Verbinden Sie nun das Tier über den Y-Schlauch mit dem Beatmungsgerät. Richten Sie das Tier vorsichtig auf das Beatmungsgerät aus und stellen Sie sicher, dass sich die Trachealkanüle auf gleicher Höhe mit dem Beatmungsgerät befindet. Dadurch wird eine mögliche Kanüle, Okklusion oder Trachealverdrehung in der Software vermieden.
Führen Sie eine tiefe Aufblasstörung aus, indem Sie auf den Namen der Störung doppelklicken, um das Einsetzen und Anbringen der Kanüle zu überprüfen. Sofern kein Leck vorliegt, hält das System über einen Zeitraum von drei Sekunden einen Druck von 30 Zentimetern Wasser aufrecht, ohne dass das Volumen übermäßig verschoben wird. Die aufgezeichneten Volumen- und Druckspuren sollten glatt sein und keine Anzeichen von Versatz oder Verformung aufweisen.
Andernfalls kann es an dieser Stelle zu einer Kanüle, einer Obstruktion oder einer Fehlplatzierung kommen. Bei Bedarf können Vitalzeichen-Schallköpfe zur Überwachung der Herzfrequenz und der Körpertemperatur angeschlossen werden. Die Datenaufzeichnung dieser Signale kann jederzeit manuell oder automatisch über ein Skript gestartet werden.
Messungen oder Befehle zur Aktivierung des Verneblers, Ereignismarkierungen usw. können mithilfe vordefinierter oder angepasster Skripte automatisiert werden, um einen hochgradig kontrollierten und wiederholbaren experimentellen Prozess zu gewährleisten. Sechs Familien von Störungen, die zu einer Reihe von Parametern führen, können verwendet werden, um die Mechanik des Atmungssystems zu Studienbeginn und nach einer gegebenen Herausforderung zu beschreiben. Wenn Sie bereit sind, mit der Messung zu beginnen, ist es wichtig, zuerst die tiefe Inflationsstörung durchzuführen, um geschlossene Lungenbereiche zu rekrutieren und die Lungenvolumenhistorie zu standardisieren.
Überprüfen Sie als Nächstes, ob es keine spontanen Inspirationsbemühungen gibt, indem Sie eine Testmessung durchführen. Beobachten Sie die Drucksignalspuren in der ausgewählten Datensatzansicht. Mit stufenweisen PV-Kurven.
Druckplateaus sollten gut definiert sein und keine Ablenkungen nach unten aufweisen. Ein Abwärtsschwung des Drucks würde auf eine Inspirationsanstrengung des Tieres hindeuten. Starten Sie nun das Skript zur Beurteilung der Reaktionsfähigkeit der Atemwege auf inhalatives Methylcholin mit einem Doppelklick auf den Titel.
In diesem Beispiel erstellt das Skript eine Sequenz von Basismessungen in dreifacher Ausfertigung. Dann gibt es eine Aufforderung, den Vernebler mit Kochsalzlösung zu befüllen. Oder in diesem Beispiel, eine Lösung von Methylcholin, die etwa 100 Mikroliter Lösung in den Vernebler füllt.
Die Vernebelung startet automatisch, sobald die Informationen in die Software eingegeben werden. Kurz nach Ende der Vernebelung wird eine Abfolge von eng beieinander liegenden Messungen für etwa drei Minuten eingeleitet. Als nächstes eine Aufforderung zur Ausführung.
Eine weitere Herausforderung ist gegeben und die Reihenfolge der Messungen kann zwischen den Herausforderungen wiederholt werden. Das Trocknen der Innenseite der Verneblerhalterung mit einem Tupfer kann verhindern, dass sich Tröpfchen oder Kondenswasser in der Inspirationsleitung bilden. Während der Datenerfassung berechnet die Software Parameter, die mit der Störung verbunden sind, und stellt einen Bestimmungskoeffizienten bereit, der auf der Anpassung der Daten an das Modell basiert.
Später kann über das Review- und Reporting-Modul der Software auf das Experiment zugegriffen werden, um Daten zu exportieren oder weiter zu analysieren. Stoppen Sie am Ende des Experiments die Belüftung und nehmen Sie das Subjekt ab. Nach dem Ablösen wird das Tier schnell mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital eingeschläfert, dann kann eine bronchoalveoläre Lavage durchgeführt oder die Lunge für weitere Analysen isoliert werden.
Bevor Sie zum nächsten Thema wechseln, spülen und trocknen Sie den Vernebleradapter, den Schlauch und die Kanüle. Wechseln Sie in der Bediensoftware zum nächsten Thema und bestätigen Sie dessen Gewicht. Fahren Sie dann mit den vorgeschlagenen Kalibrierungsschritten fort, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.
Spülen und trocknen Sie das Gerät am Ende des Tages. Denken Sie daran, vor dem Beenden der Versuchssitzung auch das Exspirationsventil des Systems gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen, um die Leistung Ihres Systems zu erhalten. Die folgenden Beispiele stellen eine Auswahl typischer Ergebnisse aus Experimenten mit naiven und chlorexponierten Mäusen dar, äquivalente Ergebnisse aus Versuchen mit naiven Mäusen.
Die Mäuse wurden zu Studienbeginn und nach Methylcholin-induzierter Bronchoverengung unter Verwendung einer der beiden Flex-Ereignisgenerationen gewonnen, die durch Flexi Wear Seven unterstützt wurden. Da Breitband-FOT-Messungen eine Aufteilung der Lungenantwort in Atemwegs- und Parenchymgewebeparameter ermöglichen, bieten sie ein Mittel zur Identifizierung betroffener Lungenregionen. Zum Beispiel zeigten naive AJ-Mäuse einen Anstieg des Ausgangswiderstands, wenn der exspiratorische Enddruck von drei auf neun Zentimeter Wasser erhöht wurde.
Die Änderung des exspiratorischen Enddrucks führte zu einer Abnahme des Atemwegswiderstands, die mit den bronchodilatierenden Effekten eines höheren Lungenvolumens und des größeren Aufblasdrucks übereinstimmte, sowie zu einer Erhöhung der Gewebedämpfung, ein Parameter, der eng mit dem Gewebewiderstand zusammenhängt und die Viskoelastizität des Gewebes und möglicherweise den Widerstand der kleinen Atemwege widerspiegelt. Letzteres ist dafür bekannt, dass es mit zunehmendem Lungenvolumen zunimmt. Dieses Protokoll wird häufig verwendet, um die Reaktionsfähigkeit der Atemwege auf inhalatives Methylcholin nach Exposition gegenüber Chlorgas zu beurteilen.
B.SEA-Mäuse zeigten im Vergleich zu luftexponierten Kontrollen eine Hyperreagibilität der Atemwege. Im vorliegenden Beispiel zeigten Mäuse, die Chlorgas ausgesetzt waren, bei allen FOT-Parametern größere maximale Reaktionen. Diese Mäuse zeigten auch eine statistisch signifikante Verschiebung der Konzentrationsreaktionskurve nach links oder eine Überempfindlichkeit gegen inhalatives Methylcholin, was sich in einer Verringerung der Methylcholinkonzentration zeigt, die erforderlich ist, um eine Verdoppelung der Resistenz und des Elastins zu bewirken.
Neben dem FOT kann das flex event system auch weitere Messungen wie z.B. Druckvolumenkurven aufzeichnen. Der obere Teil des Deflationsgliedes wird an die Salazar-Knolls-Gleichung angepasst, und die zugehörigen Parameter werden von der Software berechnet. Um mit dieser Technik erfolgreich zu sein, ist es wichtig, auf jeden Schritt zu achten, der besonders wichtig ist: die Kalibrierung des Systems, der Widerstand der endotrachealen Kanüle, die Positionierung des Tieres und die Standardisierung des Lungenvolumens.
Wenn diese Schritte genau befolgt werden, erhalten Sie mit dieser Methode eine genaue Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der Mauslunge.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Messung der Mechanik des Atmungssystems und zur Beurteilung der Atemwegsreaktionsfähigkeit auf inhaliertes Methacholin bei Mäusen unter Verwendung der erzwungenen Oszillationstechnik (flexiVent). Die Methode ermöglicht genaue und kontrollierte Messungen der Lungenfunktion.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Atemwegsphysiologie
- Tiermodelle
- Messtechniken
Hintergrund
- Die erzwungene Oszillationstechnik bietet eine nicht-invasive Methode zur Beurteilung der Lungenfunktion.
- Methachol wird zur Bewertung der Atemwegsüberempfindlichkeit eingesetzt.
- Das flexiVent-System ermöglicht eine präzise Steuerung der Beatmungsparameter.
- Die Standardisierung physiologischer Reaktionen ist für die Reproduzierbarkeit entscheidend.
Zweck der Studie
- Um die erzwungenen Oszillationsmessungen der Atemmechanik zu demonstrieren.
- Um die Atemwegsreaktionsfähigkeit in einem kontrollierten experimentellen Setup zu beurteilen.
- Um ein detailliertes Protokoll für Forscher in der Atemwegsphysiologie bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der Reagenzien und Geräte für das Experiment.
- Mechanische Beatmung des Versuchstieres mittels des flexiVent-Systems.
- Automatisierte Messungen der Atemmechanik an der Basislinie und nach der Methacholin-Herausforderung.
- Datenanalyse zur Bewertung der Atemwegsreaktionsfähigkeit und Lungenfunktion.
Hauptergebnisse
- Identifizierung der Atemwegsüberempfindlichkeit bei behandelten Mäusen.
- Genaue Messungen von Widerstand und Elastanz als Reaktion auf Methacholin.
- Standardisierte Protokolle verbessern die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
- Demonstration der Vorteile des flexiVent gegenüber traditionellen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Die erzwungene Oszillationstechnik ist effektiv zur Beurteilung der Atemmechanik.
- Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Ansatz für Forscher.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methodik aufbauen, um weitere Einblicke in die Atemwegsphysiologie zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The forced oscillation technique (FOT) provides a translational tool for assessing lung function in preclinical models, enabling mechanistic de-risking of respiratory targets. By delivering quantitative, reproducible measurements of respiratory system mechanics, FOT supports target validation and predictive confidence in early discovery. This approach aids in characterizing disease models and screening compounds for airway hyperresponsiveness, informing go/no-go decisions in respiratory therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying airway resistance and elastance changes in response to methacholine challenge.
- Operational Value: Provides standardized, automated measurements that reduce variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through precise phenotyping of lung mechanics in disease models, aiding portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-responsive data on airway function, enabling reliable compound screening for bronchodilatory or bronchoconstrictive effects.
- Operational Value: Supports assay standardization via predefined ventilation profiles and automated perturbation scripts, ensuring consistency across experiments.
- Scalability: The flexiVent system allows high-throughput, repeatable measurements, facilitating platform reuse in respiratory discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing clinically relevant lung function metrics that mirror human pulmonary assessments.
- Mechanistic De-risking: Partitions lung response into airway and tissue compartments, helping identify affected lung regions and mechanism of action.
- Disease Model Characterization: Enables comparison of naive and oxidative-stress models (e.g., chlorine-exposed mice) to validate pathophysiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
FOT integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory indications where lung mechanics are a key biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring changes in resistance and elastance following pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, automated lung function readouts that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resistance, elastance, tissue damping, and coefficient of determination, facilitating comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by offering translational biomarkers of lung function that predict in vivo responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across multiple projects studying airway diseases, fibrosis, or toxicant-induced lung injury.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung function assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility through system calibration, standardized ventilation, and automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative endpoints for airway hyperresponsiveness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on lung function profiles, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, anesthesia, and surgical techniques for tracheal cannulation in mice.
- Dependent on instrumentation such as the flexiVent system, nebulizers, and transducers for pressure, volume, and vital sign monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of ventilation profiles, challenge protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the technique across different mouse strains, disease models, or exposure paradigms.
- Includes practical limitations such as the need for precise cannula placement, leak-free seals, and controlled anesthetic depth to avoid confounding ventilatory efforts.
