Optogenetische Aktivierung der Zebrafisch Somatosensory Neuronen mit Chef-tdTomato

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne somatosensorische Neuronen in Larven von Zebrafischen zu aktivieren. Dazu wird zunächst ein Glasfaserkabel vorbereitet und an den blauen A-D-P-S-S-S-Laser angeschlossen. Der zweite Schritt besteht darin, das Transgen in Embryonen im Zellstadium zu injizieren.

Als nächstes werden fette Embryonen, die C-H-E-F-T-D-Tomate exprimieren, in somatosensorischen Neuronen untersucht und in sie eingebaut. Der letzte Schritt besteht darin, einen kurzen Impuls aus blauem Licht für die Aktivierung einzelner Neuronen abzugeben und das resultierende Verhalten aufzuzeichnen. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden, die Option zwei der Kanalwurzel verwenden, besteht darin, dass dieser Ansatz verwendet werden könnte, um Verhaltensreaktionen von einzelnen Neuronen hervorzurufen, die bis zu mindestens vier Tage nach dem Krankenhausaufenthalt aktiviert werden.

Diese Methode wird jedoch verwendet, um Einblicke in die Funktion bestimmter somatosensorischer Neuronen in Zebrafischlarven zu geben. Dieser Ansatz könnte auch angepasst werden, um Verhaltensweisen zu untersuchen, die von einer neuronalen Population im Zebrafisch wie inneren Neuronen oder Motoneuronen hervorgerufen werden. Dieser genetische Ansatz könnte verwendet werden, um spezifische Neuronen in vivo zu aktivieren, die funktionelle Entwicklung zu charakterisieren, die Auswirkungen von Mutationen oder phänomenologischen Blockaden spezifischer Proteine auf das Verhalten zu bewerten und nachgeschaltete neuronale Netzwerke zu kartieren, die zu unterschiedlichen Verhaltensreaktionen führen.

Um diesen Vorgang zu starten, erstellen Sie eine Aufbewahrungseinheit für das Glasfaserkabel, indem Sie den sich verjüngenden Hals eines Glases schmelzen. Nudeln pipettieren Sie über eine Bunts und einen Brenner, um einen 150-Grad-Winkel zu bilden. Schneiden Sie anschließend mit einem Drahtschneider oder einer Rasierklinge das Glasfaserkabel vorsichtig in zwei Teile.

Jedes Stück sollte ein freiliegendes Ende und ein Ende mit einem FC-PC-Adapter haben. Ziehen Sie dann das Glasfaserkabel bis auf die Ummantelung ab, indem Sie den Fasermantel entfernen, die Fasern verstärken und von 5,0 Zentimetern des abgeschnittenen Endes des Kabels beschichten. Führen Sie anschließend das Glasfaserkabel in die vorbereitete Nudelpipette ein.

Stellen Sie sicher, dass sich das Kabel mit einem Diamantglasschneider oder einer Pinzette mit feiner Spitze leicht in die Pipettenspitze hinein- und herausbewegen lässt. Kerben Sie die Glasfaser ein und brechen Sie das Ende ab, um einen sauberen Schnitt am Ende der Faser zu erzeugen. Ziehen Sie dann das Glasfaserkabel in die Nudelpipette ein.

Positionieren Sie dann das Glasfaserkabel in der Nudelpipette mit einem Mikromanipulator unter dem Mikroskop. Behandeln Sie anschließend manuell 24 bis 48 HPF-Embryonen mit einer Pinzette, betäuben Sie die Larven mit 0,02%trica mit einem Fluoreszenzmikroskop. Identifizieren Sie die Larven mit Ron-Beard-Neuron oder Trigeminus-Neuronenexpression Embryonen mit spärlicher Expression in leicht identifizierbaren Zellen sind optimal, aber einzelne Neuronen werden für die Aktivierung mit einem Glasfaserkabel anvisiert, so dass ein großer Bereich der Expressionsdichte akzeptabel ist. Setzen Sie die Larven in eine neue Schale mit frischem PTU Blue Embryo Wasser um.

Lagern Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius im Dunkeln bis zum gewünschten Versuchsstadium. Stellen Sie in diesem Abschnitt 1,5 % niedriges Maltase und doppelt destilliertes Wasser her und lagern Sie es in einem 42 Grad Celsius heißen Block, um ein Festigen zu verhindern. Mit einer Glaspastapipette wird eine der Larven vor dem Screening in ein Röhrchen mit 1,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzgehalt und so wenig blauem Embryowasser wie möglich überführt.

Dann geben Sie die Larve in einem Tropfen Agarose auf eine kleine Petrischale. Positionieren Sie unter einem Präpariermikroskop die dorsale Seite der Lava nach oben, wenn der Aros erstarrt ist. Schneide mit einer dünnen Rasierklinge Aros von beiden Seiten der Lava ab.

Füllen Sie den Bereich um den Aros mit blauem Wasser aus dem Embryo. Machen Sie dann zwei diagonale Schnitte an beiden Seiten des Eigelbs, wobei Sie darauf achten, dass die Lava nicht einkerbt. Anschließend ziehst du den Agrow vom Stamm und dem Schwanz der Lava weg.

Montieren Sie nun die Hochgeschwindigkeitskamera auf das Präparierfernrohr und schließen Sie die Kamera an den Computer an. Schalten Sie dann den Computer und die Hochgeschwindigkeitskamera ein. Öffnen Sie die Videobildsoftware und passen Sie die Kameraeinstellungen an.

Verbinden Sie als Nächstes das Glasfaserkabel, den Laser und den Stimulator miteinander. Schalten Sie dann den Stimulator ein und stellen Sie ihn auf maximal fünf Volt und die Impulsdauer von fünf Millisekunden ein. Schalten Sie anschließend den Laser ein.

Verwenden Sie als Nächstes das Fluoreszenz-Präpariermikroskop, um die Spitze des optischen Kabels in der Nähe eines Neuronenzellkörpers mit C-H-E-F-T-D-Tomatenexpression zu positionieren. Geben Sie einen Impuls aus blauem Licht ab, um das sensorische Neuron zu aktivieren. Nehmen Sie dann die Antworten mit einer Hochgeschwindigkeitskamera auf.

Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 500 oder 1000 Bilder pro Sekunde ein und wiederholen Sie das Experiment mit mindestens einer Minute zwischen den Aktivierungen, um eine Gewöhnung zu vermeiden, um den Lavavorteil, den Aris, mit einer Pinzette freizusetzen und darauf zu achten, dass das Tier nicht eingedrungen wird. Übertragen Sie es dann in frisches blaues Embryowasser. Die Tiere können sich weiterentwickeln und das Verfahren kann in älteren Stadien wiederholt werden.

Der Embryo könnte auch für eine hochauflösende konfokale Bildgebung der aktivierten Zelle wieder montiert werden, um das Verhalten mit der Zellstruktur zu korrelieren. Die hier dargestellte Zebrafisch-Lava ist teilweise in 1,5 % niedrigem Malz-Aris gelagert, dargestellt durch die gestrichelten Linien, die ihren rostralen Teil umgeben. Ein Trigeminusneuron und ein Rohan-Bartneuron sind in roten Mundzellen dargestellt, die in der Abbildung durch die gestrichelten Linien umrandet sind.

Hier ist ein Film, der zeigt, dass die Aktivierung eines einzelnen Rohan-Bartneurons, das C-H-E-F-T-D-Tomate exprimiert, in einer Lava mit etwa 35 HPF eine Verhaltensreaktion auslöst. Dieser Film zeigt die Aktivierung von C-H-E-F-T-D-Tomaten-exprimierenden Rohan-Bartneuronen in einer 60 HPF-Lava, und dieser Film zeigt die Aktivierung von C-H-E-F-T-D-Tomaten-Expressions-Rohan-Bartneuronen in einer Lava mit vier DPF, die einmal gemeistert wurde. Dieser gegene Ansatz kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Neuronen und Larven von Waage-Fischen zu verschiedenen Zeitpunkten aktiviert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer die richtigen Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.