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General Laboratory Techniques

Eine Einführung in das Zentrifugieren

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An Introduction to the Centrifuge

1.2: Introduction to the Microplate Reader

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07:52 min

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April 30, 2023

Overview

Die Zentrifuge ist en Instrument, das in fast jedem Forschungslabor weltweit Verwendung findet. Das Zentrifugieren ist ein Prozess bei dem durch Verwendung einer Zentrifuge Stoffgemische in ihre verschiedenen Bestandteile getrennt werden können. Durch schnelle kreisförmige Drehbewegungen werden die einzelnen Bestandteile eines Stoffgemisches der Zentrifugalkraft ausgesetzt, was dazu führt dass Partikel mit höherer Dichte weg von der Zentrifugationsachse migrieren, wohingegen Partikel mit niedrigerer Dichte näher an der Zentrifugationsachse bleiben. Diese Partikel setzen sich am Unterboden des Zentrifugierröhrchens in einem sogenannten Pellet ab. Das Pellet oder die übrig gebliebene Lösung, auch Überstand genannt, können dann weiter verarbeitet oder analysiert werden.

Dieses Video ist dazu da um Studenten in die einfachen Grundlagen der Zentrifugierung und die Bedienung einer Zentrifuge einzuführen. Zum Beispiel wird der Unterschied zwischen Umdrehungen pro Minute (RPM) und relativer Zentrifugalkraft (RCF) als Messeinheit der Zentrifugierung erläutert, und dargestellt das RCF unabhängig von der Größe des Rotors ist. Zusätzlich zu einfachen Konzepten und Anwendungen werden Sicherheits und Vorsichtsmaßnahmen erklärt, und erläutert welche verschiedenen Zentrifugen und Rotoren es gibt.

Procedure

Eine Zentrifuge ist ein Instrument das in fast allen Labors weltweit genutzt wird.

Das Zentrifugieren ist ein wichtiges Laborverfahren um mit Hilfe einer Zentrifuge Stoffgemische in ihre einzelenen Bestandteile zu trennen.

Durch die gleichförmige Kreisbewegung bei hoher Geschwindigkeit werden die Bestandteile des zu zentrifugierenden Stoffgemisches der Zentrifugalkraft ausgesetzt. Dadurch migrieren Stoffe mit höherer Dichte weg von der Rotationsachse, wohingegen Stoffe mit niedrigerer Dichte näher an der Rotationsachse bleiben.

Diese Stoffe sammeln sich an der Unterseite des Zentrifugenröhrchens an, was auch als Pellet bezeichnet wird. Die übriggebliebene Lösung, auch Überstand genannt, oder das Pellet können dann weiter verarbeitet oder analysiert werden.

Der wichtigste Bestandteil einer Zentrifuge ist der Rotor, der sich kreisförmig mit hoher Geschwindigkeit bewegt. Der Rotor kann entweder fest auf der Antriebswelle montiert sein, oder mehrere Rotoren können an einer sogenannten Spindel befestigt werden. Normalerweise hat der Rotor einen Deckel, der fest angeschraubt ist, um zu vermeiden das Proben rausfliegen.

Viele Zentrifugen haben eine Kühlung eingebaut, damit die Temperatur während der Zentrifugierung kontrolliert werden kann.

Außerdem haben Zentrifugen Knöpfe und Tasten, womit man die Zentriefugierparameter eingeben kann.

zum Beispiel: die Dauer der Zentrifugierung, die Temperatur, Geschwindigkeit oder relative Zentrifugierkraft.

Die Zentrifugiergeschwindigkeit wird in RPM (auch Umdrehungen pro minute) angegeben. Bei der Einheit RPM ist zu beachten, dass nicht die Geschwindigkeit das Stoffgemisch trennt, sondern die Kraft, die auf die einzelnen Bestandteile einwirkt.

Die Kraft, die auf die zu zentrifugierenden Bestandteile einwirkt, ist abhängig vom Radius des Rotors. Verschiedene Zentrifugen haben verschieden große Rotoren, was bedeutet das die gleiche Zentrifugiergeschwindigkeit in eine andere Kraft resultiert.

Die Stärke der Zentrifugierung kann auch als relative Zentrifugalkraft, auch RCF genannt, gemessen werden. RCF wird normalerweise als Vielfaches der Erdbeschleunigung angegeben.

RCF wird berechnet durch das Produkt des Radius des Rotors und dem Quadrat der Winkelgeschwindigkeit, geteilt durch die Erdbeschleunigung.

RCF kann durch die folgende Gleichung in RPM umgerechnet werden. R ist der Radius der Zentrifuge gemessen in cm.

Das Benutzen dieser Gleichung kann den Unterschied zwischen einem erfolgreichen und einem misslungenen Experiment bedeuten. Man muss die Gleichung jedoch nicht jedes Mal von Neuem benutzen. Zentrifugen haben oft Nomogramme, mit denen man einfach RCF in RPM umrechnen kann. Hierfür benutzt man ein Lineal und verbindet den Radius der Zentrifuge mit dem RPM Wert, um dann einen RCF Wert abzulesen.

Vor Beginn des Zentrifugierens ist als erstes an die Temperatur zu denken. Wenn eine gekühlte Probe zentrifugiert wird, sollte vor Beginn die Temperatur im Inneren der Zentrifuge mit der Temperatur der Probe übereinstimmen. Man kann allerdings auch andere Wege finden den Rotor zu kühlen.

Unmittelbar vor Beginn des Zentrifugierens sollte man sich versichern, dass alle Deckel fest und sicher auf den Zentrifugierröhrchen verschraubt sind.

Ausserdem sollte sichergestellt werden, dass jede Probe mit einer direkt gegenüberliegenden Probe gleichen Gewichts ausgeglichen ist.

Wenn nur eine Probe zu zentrifugieren ist, sollte eine zweite Probe vorbereitet werden, die als Gegengewicht eingesetzt werden kannk.

Drei Proben kann man auch als Dreieck anordnen, so dass die Proben gleich voneinander entfernt sind.

Der Gewichtsausgleich in einer Zentrifuge ist extrem wichtig. Rotoren erreichen sehr hohe Geschwindigeiten und damit kinetische Energien. Bei ungenauem Gewichtsausgleich kann die gesamte Zentrifuge aus ihrem Platz ausbrechen und dabei schwere Schäden verursachen.

Nachdem man nachschaut, dass der Rotor und der Deckel der Zentrifuge gesichert sind, kann man die Zentrifuge anschalten. Es ist empfehlenswert in der Nähe der Zentrifuge zu bleiben, bis die gewünschte Geschwindigkeit erreicht ist. Bei Problemen sollte man immer einen erfahrenen Labormitarbeiter um Hilfe bitten.

Wenn der Zentrifugationsprozess abegeschlossen ist, sollte man an der Unterseite des Zentrifugierröhrchens das Pellet sehen, dass sich aus der uebriggebliebenen Flüssigkeit, oder Überstand, abgesetzt hat.

Der Überstand kann durch Dekantieren entfernt werden. Dekantieren ist ein kompliziertes Wort für Abgießen. Der Überstand kann auch aspiriert werden, was ein kompliziertes Wort für Absaugen ist.

Die aufbereiteten Proben können dann wieder in Lösung gebracht werden. Diesen Prozess nennt man Resuspendieren. Das Wiederholen von Zentrifugieren, Aspirieren und Resuspendieren in Pufferlösung nennt man das Waschen von Zellen.

Nun das wir uns mit den Prinzipien des Zentrifugierens auseinandergesetzt haben, ist es Zeit das wir uns anschauen welche verschiedenen Arten von Zentrifugen es gibt und welche Experimente man damit machen kann.

Festwinkelzentrifugen mit zentral montierten Antriebswellen sind die am häufigsten verwendeten Zentrifugen. Viele Tischzentrifugen fallen in diese Kategorie.

Zentrifugen in denen die Proben mit konstantem Winkel und Position zentrifugiert werden, werden oft für Differenzialzentrifugationsprotokolle genutzt. Bei diesen Protokollen werden mehrere Zentrifugierschritte mit verschiedenen Geschwindigkeiten durchgeführt, um zum Beispiel biologische Proben wie Tierzellen aufzubereiten. Normalerweise braucht man dabei auch mehrere Waschschritte.

Im Gegensatz zu Festwinkelzentrifugen haben Zentrifugen mit Ausschwingrotor flexibele Röhrchenhalterungen, die erlauben das sich Proben unter dem Einfluss der Zentrifugalkraft nach außen bewegen. Diese Art von Rotoren sind besonders für Proben die sich durch Zentrifugieren in bestimmte Schichten abtrennen geeignet. Diese Zentrifugtionsart wird häufig angewendet um verschiedene Zellarten oder Zellorganellen voneinander zu trennen.

Die Ultrazentrifuge ist der große Bruder aller Zentrifugen, die man im Labor antrifft. Eine Ultrazentrifuge kann mit mehr als 70000 rpm zentrifugieren. Dadurch kann man sehr kleine Substanzen, wie zum Beispiel DNA der Viren, isolieren.

Wegen der hohen Geschwindigkeiten sollte man besonders genau auf den Gewichtsausgleich achten und sicherstellen sowohl der Rotor als auch der Schraubverschluss gesichert sind.

Das war die Einführung in die Zentrifugation von JoVE. In diesem Video haben wir gelernt was eine Zentrifuge ist und wie sie funktioniert, wie man eine Zentrifuge bedient, welche Sicherheits und Vorsichtsmaßnahmen man zu beachten hat, und für welche Anwendungen sich welche Zentrifugen eignen. Danke für eure Aufmerksamkeit und vergesst nicht eure Zentrifugenröhrchen durch ein Gegengewicht auszugleichen!

Transcript

The centrifuge is an instrument used in nearly every biomedical research lab across the globe.

Centrifugation is a process by which a centrifuge is used to separate components of a complex mixture.

By spinning laboratory samples at very high speeds, the components of a given mixture are subjected to centrifugal force, which causes more dense particles to migrate away from the axis of rotation and lighter ones to move toward it. These particles can sediment at the bottom of the tube into what’s known as a pellet, and this isolated specimen, or the remaining solution, the supernatant, can be further processed or analyzed.

The principle component of a centrifuge is the rotor, which is the moving part that spins at high speeds.

Rotors can be fixed in position, or a centrifuge can use multiple rotors fixed atop part called the spindle.

Usually, the centrifuge rotor will have a lid that is screwed down tightly to prevent samples from flying out.

Many centrifuges will have a refrigeration unit that allows the internal temperature to be controlled during the spin.

They also have knobs or buttons for inputting the parameters for each run, which can include the duration of the spin, the temperature, and the magnitude of the spin in terms of speed or relative force.

Spin speed is measured as RPM, or revolutions per minute. RPM is tricky value, because it’s not the speed of the centrifuge that causes particles to separate from a mixture, but the force acting on these particles.

The force acting on a particle is related to the radius of the centrifuge rotor, and since different centrifuges have different rotor sizes, different forces can be applied at the same speed, or RPM.

Centrifugation strength can also be quantified as Relative centrifugal force, or RCF. RCF is generally presented as a multiple of earth’s gravitational acceleration.

RCF is expressed as the product of the radius of the rotor and the square of the angular velocity divided by earth’s gravitational acceleration.

RCF can be related to RPM by the following equation, where r stands for the radius of the centrifuge measured in centimeters.

Using this equation can mean the difference between a failed or successful experiment, but you don’t have to apply this calculation for every new procedure. Centrifuges often come with nomograms that can help convert RCF to RPM quite easily. Use a ruler to connect the radius of the centrifuge and a given RPM value, in order to obtain RCF.

To begin spinning your samples consider temperature. If you are using a refrigerated centrifuge, then you will want the machines internal temperature to reach the desired value before starting the spin, or you can find other ways to cool the rotor.

Immediately before a spin ensure all of the caps on your tubes are tightened and secure.

When you loading your tubes, ensure that each sample is counterbalanced with another sample directly across from it.

If you’ve only got one tube, then make another tube that can act as a counterweight.

If you’ve got three tubes, you can arrange them in a triangle so they are equidistant from each other.

Balancing weights in a centrifuge is critical. Centrifuge rotors reach high speeds and have a lot of kinetic energy. If improperly balanced, the entire centrifuge unit can be propelled from its resting place and do serious damage.

Once you confirm that the rotor and lid are secure, start the centrifuge and hang around until it’s reached the desired speed. If you notice a problem call and experienced member of the lab to come help you.

When your centrifugation is complete, you should be able to see your biological specimen at the bottom of the tube in a pellet, which has separated from the rest of the solution, or supernatant.

The supernatant can be removed by either decanting it – a fancy name for pouring it off, or it can be aspirated – a fancy term for using suction to remove it.

The purified specimen can then be returned to a solution via a process called, resuspending. Repetitions of centrifuging, or spinning cells, followed by aspirating cells, and resuspending in buffer, is often referred to as, washing cells.

Now that you’ve seen some basics of centrifugation, its time to have a look at some of the types of centrifuges out there and the procedures you can carry out with them.

Fixed angle rotor centrifuges are probably the most common type of this instrument you’ll encounter in the lab. Many table top centrifuges fit in this category.

These centrifuges, in which tubes sit in a fixed and angled position, are used in differential centrifugation protocols. In these protocols, a series of centrifugations at different speeds can be used to purify biological specimens like animal cells. Typically, these protocols involve several cell washing steps.

In contrast to fixed angle rotors, swing rotors have flexible tube holders allow samples to rotate outward. These rotors are beneficial in applications like density gradient centrifugation, where biological samples migrate to distinct layers of gradient media. This type of centrifugation is useful for quickly isolating one cell type from another, or for isolating individual organelles.

Lastly, the ultracentrifuge is the big brother of all the centrifuges you’ll find in the lab. It can spin in excess of 70,000 rpm, which makes it well suited for the isolation of small particles, like DNA or viruses.

Because of the high speeds of this centrifuge extra care should be taken to ensure that the loads are properly balanced and that both the rotor and lid are secure.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Centrifugation. In this video we reviewed: what a centrifuge is and how it works, how to operate and run a centrifuge, some safety precautions, and different applications of your centrifugation. Thanks for watching and remember to balance your tubes.

Tags

Centrifuge Biomedical Research Lab Centrifugation Complex Mixture Centrifugal Force Dense Particles Lighter Particles Sedimentation Pellet Supernatant Rotor Spindle Lid Refrigeration Unit Input Parameters Spin Duration Temperature Control Spin Speed RPM