Name: Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer Preadipozyten aus Mausgewebe und deren Differenzierung zu beigen/briten Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Adipozyten-Browning und metabolischer Regulation.

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Wir danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda und Lauren Ruiz für Diskussionen, technische Hilfe und redaktionelle Unterstützung auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DK087853), aus dem Programm für Breakthrough Biomedical Research und von Asubio Pharm Inc. SKULA wurde von einem Anteil PhD-Stipendien an der Universität von Kopenhagen und dem EU FP7 Projekt Diabat (HEALTH-F2 abgestützt -2.011-278.373) an Lise Madsen und Karsten Kristiansen. Wir erkennen auch die DERC Zentrum Zuschuss (NIH P30 DK063720).

Ein. Bereiten Verdauung Medium Make 5 ml pro 5 Mäuse pro Gewebe (ca. 1 ml / 1 g Fettgewebe). <ol><li> Wiegen in Verdauungsenzyme: - Collaginase D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70.334.223) - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11.466.200) </li><li> 25 ml PBS und gut mischen sich aufzulösen </li><li> Hinzufügen CaCl 2 unmittelbar vor dem Aufschluss des Gewebes bei einer Endkonzentration von 10 mM </li></ol> 2. Dissect Fettgewebe von Mäusen <ol><li> Dissection sollte sorgfältig durchgeführt werden, und unmittelbar nach der Mäuse (6-8 Wochen alt) geopfert werden. Arbeiten sterile mit Ethanol auf der Maus Fell gesprüht, bevor Sie es öffnen. Legen Sie das Gewebe direkt in sauberen PBS, separate interskapularen BAT und des Unterhautzellgewebes inguinal WAT. </li><li> Für interskapularen BAT: die Maus mit dem Rücken stellten sich gelegt, geschnitten entlang der Rückseite und den ganzen Weg bis zum Hals offen. Die brauneFettgewebe kann direkt unter der Haut zwischen den Schultern (interskapularen) gefunden werden. BAT als zwei Lappen, Schmetterling geformt gesehen werden. Eine dünne Schicht aus weißem Fett Abdecken der BAT sollte sorgfältig entfernt werden. </li><li> Für die subkutane WAT (inguinal WAT): Haut entfernen. Leistenbruch WAT wird direkt unter der Haut auf beiden Seiten gefunden, beginnend fast auf den Rücken und geht neben, Innenseite der Oberschenkel und nach unten in Richtung des Hodens. </li></ol> 3. Ausschneiden und Digest Fettgewebe <ol><li> Schnelles Entfernen alle Verunreinigungen wie Haare, Skelettmuskulatur und Bindegewebe von den Gewebeschnitten. </li><li> Trocknen Gewebe schnell auf Papier nicht verwässern Dissektion Medium mit PBS und legen Sie sie auf einer trockenen Platte. </li><li> Fügen Digestionsmedium (hinzugefügt CaCl 2 vor der Verdauung) und Mince das Gewebe in kleine Stücke schneiden. Mix sehr gut durch Auf-und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette. Übertragen der zerkleinerten Gewebe in 50 ml Röhrchen mit dem Rest des Aufschlusses medium, mischen noch mehr durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Digest 37 ° C mit konstantem Rühren bei 150 UpM für 40-50 min. Überprüfen Sie alle 10-15 min sicherstellen, dass die Verdauung gut und über-Verdauung zu verhindern. </li></ol> Hinweis: Die korrekte Digestionsmedium und Zeit sind wichtig. Das Gewebe muss gut verdaut werden, aber überschüssige Verdauung kann die Zellen schädigen. 4. Filter Zellsuspension <ol><li> Stoppen Verdau durch Zugabe von 5 ml Vollmedium (DMEM/F12 mit 10% FPS und P / S). Die Zellen sollten fast völlig homogen. Gut mischen durch Pipettieren. </li><li> Zentrifuge bei 700 × g für 10 min. </li><li> SVF kann nun als bräunliches Pellet am Boden des Röhrchens gesehen werden. Saugen Sie die ölige reife Adipozyten Schicht auf der Oberseite und die meisten der flüssigen Schicht - halten Sie das Pellet und löst ihn in 10 ml Vollmedium. Gut mischen. </li><li> Legen Sie eine Zellsieb (50-70 Mikrometer Durchmesser) über einen neuen 50<html> ml-Tube und Filtern der Zellsuspension. </li></ol> 5. Platte Cells <ol><li> Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 700 × g für 10 min. </li><li> Anzusaugen Mediums und Resuspendieren Pellet in 10 ml Vollmedium. Pipette und gut mischen. </li><li> Schätzen Sie, wie viele Platten benötigt werden. Dies kann variieren und hängt von der Pelletgröße. Eine allgemeine Regel ist 2 von 10 cm Platten aus 5 Mäusen inguinal WAT und eine 10 cm Platte für BAT. </li><li> Platte Zellen auf Kollagen beschichteten Platten (R &amp; D) in Vollmedium </li><li> 1-2 Stunden nach Ausplattieren der Zellen, absaugen Medium, zweimal mit PBS waschen und mit frischem Medium. Dieser Schritt ist wichtig, da dies roten Blutzellen, Immunzellen und andere Verunreinigungen entfernen kann. </li></ol> 6. Differenzieren Cells <ol><li> Die Wartung und die Induktion Medien. </li></ol> Erhaltungsmedium Komplett-Medium mit: ent &quot;&gt; Insulin, Endkonzentration. 5 pg / ml (5 mg / ml Brühe, *** 100 ul Essigsäure in 10 ml H 2 O zur Vorbereitung angesäuert Wasser pH-Wert 2,5. aufzulösen Insulin in der angesäuerten Wasser. Shop bestellt -20 ° C) 3,3 &#39;,5-Triiodo-L-thyronine (T3), Endkonzentration. 1 nM (10 uM Lager auflösen *** in 1N NaOH T3 und fügen mittel-bis 10 uM Lager zu machen. Sigma cat # T-2877) Lagerung bei 4 ° C, gut für 1 Woche Induktionsmedium Erhaltungsmedium enthält folgende Verbindungen: Indomethacin, Endkonzentration. 125 uM (0,125 M Lager in Ethanol, Sigma cat # I-7378). Indomethacin muss erwärmt auf 60 ° C aufgelöst werden. Dexamethason, Endkonzentration. 2 pg / ml (2 mg / ml Socke in Ethanol, Sigma cat # D-1756) 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), Endkonzentration. 0,5 mm (0,25 M Stammlösung in DMSO, Sigma cat # I-5879) Rosiglitazon, Endkonzentration. 0,5 uM(10 mM Stammlösung in DMSO, Sigma cat # R-2408) Hinweis: Stellen Sie frische Induktionsmedium jeder Zeit. <ol start="2"><li> Wachsen primären Adipozyten zu 95-97% Konfluenz in Vollmedium (konfluent, aber nicht zu voll) </li><li> Anderer regelmäßigen Vollmedium mit Induktionsmedium (Tag 0) </li><li> Nach 48 Stunden (Tag 2), ändern Sie mittel-bis Erhaltungsmedium mit Rosiglitazon (0,5 uM) </li><li> Nach weiteren 48 Stunden (Tag 4), an die frische Wartung Medium mit Rosiglitazon (1 pM) für 2-3 Tage ändern. 6-7 Tage nach dem Hinzufügen des Induktionsmedium werden Zellen vollständig differenziert zu reifen Fettzellen und sind mit Öltröpfchen gefüllt. Tröpfchen etwa 3-4 Tage nach der Induktion erscheinen. </li></ol> Hinweis: Ändern Medium alle 2-3 Tage, bis die Zellen vollständig differenziert. Zellen können jetzt geerntet und mRNA-Expression von UCP1 und other braunen Adipozyten-spezifische Gene können durch qRT-PCR gemessen werden. Western Blot verwendet, um Proteine ​​zu detektieren.

<ol><li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+genetic%2C+molecular%2C+and+environmental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li>
<li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li>
<li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRDM16+controls+a+brown+fat%2Fskeletal+muscle+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li>
<li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li>
<li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+leukotrienes%2C+and+essential+fatty+acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li>
<li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316%2C243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa%2Ffa+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+and+Related+Metabolic+Disorders%3A+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li>
<li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+metabolism%22%5BJournal%5D)">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+%28PPARgamma%29+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent%2C+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li>
<li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db%2Fdb+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li>
<li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li>
<li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li>
<li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+thiazolidinedione%2C+NC-2100%2C+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator%2C+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li>
<li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li>
<li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li>
<li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige zelluläre System, um die Entwicklung von beige / brite Zellen in primären kultivierten Adipozyten in Mäusen untersucht werden. Wie zu mehreren verfügbaren immortalisierten Zelllinien verglichen werden, ist dieses System dürfte verbesserte Relevanz für die Bräunung der weißen Fett in vivo bieten. Obwohl die Studie dieser primären Adipozyten bietet einige Vorteile, es existieren auch einige Einschränkungen und Bedenken, die unbedingt zu be...

<html> Adipositas ist dramatisch zunehmenden weltweit und ist heute eines der schwerwiegendsten Bedenken für die öffentliche Gesundheit 1 betrachtet. Dieser Zustand ist mit einem Ungleichgewicht in der Energieaufnahme relativ zu Ausgaben und führt überschüssige Energie als Lipid in weißem Fettgewebe (WAT) gespeichert verwandt. Vergrößerten WAT ist mit einer erhöhten Körpermasse und Gewicht zugeordnet ist, während braunes Fettgewebe hat die Fähigkeit, überschüssige Energie abzuleiten, um Wärme zu erzeugen. Daher BAT kann als Schutz gegen Kälte und Übergewicht 2,3 funktionieren. Dies wird durch Auskuppeln der Elektronentransport in Mitochondrien durch entkoppelnde Protein 1 (UCP1) erreicht. Dieses Protein wird als ein Markenzeichen für nonshivering Thermogenese in BAT 3. Mehrere Studien in den letzten Jahren gezeigt, dass erwachsene Menschen funktionale BAT 4-8 haben und somit Manipulation von BAT beim Menschen kann eine mögliche therapeutische Intervention im Kampf gegen Fettleibigkeit und die damit verbundenen Krankheiten. jove_content &quot;&gt; Aktuelle Daten zeigen, dass zwei Arten von braunen Fettzellen bei Nagetieren existieren;&quot; klassischen &quot;oder&quot; pre-existierenden &quot;braunes Fett entwickelt sich während der pränatalen Phase und bildet gewidmet braunen Fettgewebe Depots in interskapularen Region und anderen peripheren Geweben Auf der anderen Seite. ein &quot;induzierbare&quot; Form von braunem Fett (sogenannte brite oder beige Zellen) entwickelt sich während der postnatalen Stufe und erscheint durchsetzt im weißen Fettgewebe. Die zwei Typen von braunen Fettzellen auch von verschiedenen Entwicklungsstadien Ursprünge getrennt. Während die vorbestehenden braunen Fettzellen entstehen aus myoblastsic-ähnliche Myf5 Vorstufen entstehen die induzierbare brite / beige Zellen in WAT durchsetzt von einem nicht-Abstammungslinie Myf5 9,10. Zusätzlich Regulationswege dieses Zelltyps wahrscheinlich unterschiedlich vom Myf5 abgeleiteten braun ist Adipozyten 11. Die Entwicklung der beige Zellen (dh &quot;Bräunungs&quot; von weißem Fett) in Reaktion auf chronische Kälteexposition und aktiviert werdenβ3-Adrenozeptor-Agonisten oder PPAR &amp;ggr;-Agonisten bei Erwachsenen 12-14. Die beige / brite Zellen wahrscheinlich ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Manipulation Gesamtenergiebilanz sein und kann potentiell Teil Entfettungskur geworden, daher ist es wichtig, genaue molekulare Mechanismen und Signalwege durch welche Umweltreize steuern die Entwicklung der beige verstehen Zellen. Um die molekulare Kontrolle der Bräunung von weißem Fett zu verstehen, werden in vitro-Versuche am besten als Differenzierung von Präadipozyten erfolgt vielmehr asynchron geeignet und es ist schwierig, die Zellen in situ 15 detektieren. Obwohl Studien zur Entwicklung Adipozyten somit haben bis jetzt überwiegend auf Zelllinien wie 3T3-L1, 3T3-F442A oder HIB1 durchgeführt erscheinen diese Zelllinien, die molekulare Unterschrift beige Zellen fehlt. Auf der anderen Seite, sind primäre Adipozyten aus subkutaner WAT isoliert am ehesten die Verarbeitung rekapitulierens der Bräunung der weiße Fett in einer Zelle autonom. Hier bieten wir ein Protokoll für eine effektive Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion aus Fettgewebe und zur Induktion der Bräunung von weißem Fett in Reaktion auf PPAR &amp;ggr;-Agonisten. Rosiglitazon ist gezeigt worden, eine besonders effektive Mediator Bräunungsgrad in diesen Zellen vorhanden sein. Wie zuvor 16 angedeutet, kann dieses zellulare System verwendet, um eine zuverlässige Zellularsystem um die Entwicklung von beige / brite Zellen zu untersuchen dienen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> Roche </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM-Medium </td><td> Fischer </td><td> 10017-CV </td><td> Mit 2,5 g / l Glukose und L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat </td></tr><tr><td> Insulin </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3,3 &#39;,5-Triiod-L-Thyronin) </td><td> Sigma </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Indomethacin </td><td> Sigma </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethasone </td><td> Sigma </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> Sigma </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Kollagen beschichteten Schalen </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> 10 cm Platten </td></tr><tr><td> 70 um-Filter </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td> Zellsieb, 70 um Nylon 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation und differenzierung von stroma-vascular cells beige / brite cells

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Braunen Fettzellen haben die Fähigkeit, die Atmungskette der Mitochondrien entkoppeln und dissipieren chemische Energie als Wärme. Entwicklung UCP1-positiven braunen Fettzellen in weißem Fettgewebe (sogenannte beige oder brite Zellen) hoch ist durch eine Vielzahl von Umweltreize wie chronische Kälteexposition oder durch PPAR &amp;ggr; Agonisten induziert wird, somit hat dieses Zelltyps Potential als therapeutisches Ziel für Behandlung von Fettleibigkeit. Obwohl die meisten verewigt Adipozyten Linien nicht rekapitulieren können den Prozess der &quot;Bräunung&quot; der weißen Fett in Kultur, primären Adipozyten aus stromalen vaskulären Fraktion im subkutanen weißen Fettgewebe (WAT) isoliert eine zuverlässige zelluläre System, um die molekulare Kontrolle der beige / brite-Zell-Entwicklung zu studieren . Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine effektive Trennung von Primär-und Präadipozyten zur Induzierung der Differenzierung zu beige / brite Zellen in Kultur. Die Bräunung Effekt kann durch die Expression von braunem Fett-selektive Markierung beurteilt werdenten wie UCP1.

Browning von primären Adipozyten kann durch Messung mRNA-Expression von UCP1 und andere braune Fett-spezifisch oder selektiv Gene durch qRT-PCR zugegriffen werden. Präsentiert in Abbildung 1 ist Genexpressionsdaten in inguinal WAT-abgeleiteten primären Adipozyten. Die Zellen wurden induziert in der Gegenwart von zwei verschiedenen Dosen von Rosiglitazon bei 50 nM und 500 nM unterscheiden sind. Eine Untergruppe von Zellen wurde mit Forskolin bei 10 pM für 4 Stunden vor der Ernte behandelt. Dies ...

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von &quot;Bräunung&quot; der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Adipozyten zu isolieren und ihre Differenzierung in Kultur zu beigen oder hellen Zellen zu induzieren. Der erste Schritt besteht darin, Fettgewebe von Mäusen zu präparieren. Als nächstes wird das Gewebe mit Kollagenase verdaut.Sobald die vaskuläre Stromafraktion isoliert ist, werden die Zellen plattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Differenzierung der Zellen zu beigen oder hellen Zellen zu induzieren. Letztendlich werden analytische Methoden verwendet, um eine erhöhte Expression von braunen Adipozyten-spezifischen Genen zu zeigen.Diese Methode kann dazu beitragen, die Schlüsselfragen im braunen Fettgewebe zu beantworten, nämlich den molekularen Mechanismus, der die Entwicklung von hellen oder be-Zellen reguliert. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Fettleibigkeit und anderen Zivilisationskrankheiten. Da die Manipulation von braunem Fettgewebe beim Menschen als potenzieller therapeutischer Eingriff genutzt werden kann, besteht der erste Schritt darin, das Verdauungsmedium vorzubereiten.Nach der Euthanasie wird dann das Fettgewebe entfernt. Isolieren Sie zunächst das interscapularische braune Fettgewebe oder die Fledermaus, indem Sie entlang des Rückens des Tieres bis zum Hals schneiden. Zwei Lappen aus braunem Fettgewebe befinden sich direkt unter der Haut zwischen den Schultern.Entfernen Sie anschließend vorsichtig die dünne Schicht aus weißem Fett, die die Fledermaus bedeckt. Nach der Isolierung legen Sie das Gewebe direkt in sauberes PBS. Das leistenweiße Fettgewebe befindet sich auf beiden Seiten direkt unter der Haut.Sie erstreckt sich bis zur Innenseite der Oberschenkel und hinunter zu den Hoden. Entfernen Sie das Tuch und legen Sie es in sauberes PBS. Die folgenden Schritte werden sowohl auf die Fledermaus- als auch auf die Nassprobe angewendet.Entfernen Sie schnell alle Verunreinigungen wie Haare, Skelettmuskulatur und Bindegewebe aus den Gewebeabschnitten. Trocknen Sie das Taschentuch anschließend schnell auf einem Papiertuch ab, um eine Verdünnung des Seziermediums mit PBS zu verhindern, und legen Sie es auf eine trockene Platte. Geben Sie das Verdauungsmedium hinzu und hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke.Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen, in dem sich der Rest des Verdauungsmediums befindet. Legen Sie das Röhrchen 40 bis 50 Minuten lang unter ständigem Rühren in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um es zu verdauen. Überprüfen Sie alle 10 bis 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Verdauung gut verläuft und um eine Überverdauung zu vermeiden.Nachdem das Gewebe gut verdaut ist, stoppen Sie die Verdauung. Durch Zugabe von fünf Millilitern des kompletten Mediums und gutes Mischen sollten die Zellen fast vollständig homogen sein. Zentrifugieren Sie anschließend die Probe 10 Minuten lang bei 700 mal G.Die stromale Gefäßfraktion sollte nun als bräunliches Pellet am Boden des Röhrchens sichtbar sein, die ölige reife Adipozytenschicht darüber und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht aspirieren. Als nächstes das Pellet in 10 Millilitern auflösen, auf mittlerer Stufe füllen und gut mischen. Nach dem Mischen ein Zellsieb über ein neues 50-Milliliter-Röhrchen legen und die Zellsuspension filtrieren.Die gefilterte Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 700-fachem G zentrifugiert. Als nächstes aspirierst du das Medium und suspendierst das Pellet erneut. In 10 Millilitern des kompletten Mediums die Zellen nach Bedarf pipettieren und gut mischen.Im Allgemeinen ergeben fünf Mäuse zwei 10 Zentimeter große Platten mit Leistenwasser und eine Platte mit Fledermaus. Ein bis zwei Stunden nach dem Plattieren. Aspirieren Sie die mittlere Waschung zweimal mit PBS und fügen Sie frisches Medium hinzu.Dieser Schritt ist wichtig, da dadurch rote Blutkörperchen, Immunzellen und andere Verunreinigungen entfernt werden können. Die Wartungs- und Induktionsmedien werden im Voraus vorbereitet. Sobald die primären Adipozyten auf 95 bis 97 % Konfluenz angewachsen sind, wechseln Sie das reguläre vollständige Medium durch ein Induktionsmedium.Wechseln Sie das Medium nach 48 Stunden gegen ein Erhaltungsmedium mit 0,5 mikromolaren RO-Glitazon. Wechseln Sie nach weiteren 48 Stunden für weitere zwei bis drei Tage zu einem frischen Erhaltungsmedium, das ein mikromolares RO-Glitazon enthält. Tröpfchen treten etwa drei bis vier Tage nach der Induktion auf, wie hier sechs bis sieben Tage nach der ersten Zugabe des Induktionsmediums.Die Zellen sollten vollständig zu reifen Fettzellen differenziert sein und mit Öltröpfchen gefüllt sein. Zellen können nun geerntet und für weitere Analysen verwendet werden. Die Bräunung primärer Adipozyten kann durch Messung der mRNA von braunen Fett-spezifischen oder selektiven Genen mit Q-R-T-P-C-R beurteilt werden, wie hier zu sehen.RO-Glitazon, robust induzierte UCP one mRNA-Expression FORSKOLIN-Behandlung, hier als zyklisches A MP bezeichnet. Die durch RO-Glitazon induzierte UCP-Eins-Expression wurde weiter erhöht. Cdia. Ein weiteres selektives Gen für braunes Fett war ebenfalls dosisabhängig stark erhöht. Die Behandlung mit RO-Glitazon erhöhte auch die Expression von FABP vier und dem adipogenen Marker sowohl für braunes als auch für weißes Fett.Dieser Bräunungseffekt war nicht einfach auf eine Steigerung der Adipogenese an sich zurückzuführen. Da die Induktion von UCP 1 und CDIA-Expression immer noch signifikant war, selbst wenn die mRNA-Spiegel auf die von FABP vier normalisiert wurden, bestätigt dieser Western Blot den erhöhten Proteinspiegel von UCP eins. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Präadipozyten isoliert und wie man diese Zellen in Kultur in beige oder helle Zellen unterscheidet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Im Jahr 2001 beschrieben Forscher an der UCLA die Isolierung einer Population von adulten Stammzellen, sogenannte Fettgewebe gewonnene Stammzellen oder ASC, aus dem Fettgewebe. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung des ASC aus lipoaspirates mit einem manuellen, enzymatische Verdauung mit Kollagenase-Protokoll.

Manuelle Isolierung von Fettgewebe gewonnene Stammzellen aus menschlichen Lipoaspirates

Blutgefäße innerhalb der menschlichen Skelettmuskulatur Hafen mehrere Multi-Linie Vorläuferpopulationen, die sich ideal für die regenerative Anwendungen sind. Dieses Isolierungsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Reinigung von drei multiVorläuferZellPopulationen jeweils drei Strukturschichten der Blutgefäße: myogenen Endothelzellen aus Intima, Perizyten von Medien und Adventitia-Zellen von Adventitia.

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden.  Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung, Reinigung und Kultur primärer marginaler Zellen aus der Maus-Stria vascularis sowie zur Etablierung von in-vitro-Modellen von oxidativem Stress und zellulärer Seneszenz zur Untersuchung von cochlearen lateralen Wandstörungen.

Isolierung und Kultur primärer Randzellen der Stria vascularis aus neonatalen Mäusen

Lernen Sie die Isolierung primärer Preadipozyten aus Mausgewebe und deren Differenzierung zu beigen/briten Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen der Adipozyten-Browning und metabolischer Regulation.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

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