Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Adipozyten zu isolieren und ihre Differenzierung in Kultur zu beigen oder hellen Zellen zu induzieren. Der erste Schritt besteht darin, Fettgewebe von Mäusen zu präparieren. Als nächstes wird das Gewebe mit Kollagenase verdaut.

Sobald die vaskuläre Stromafraktion isoliert ist, werden die Zellen plattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Differenzierung der Zellen zu beigen oder hellen Zellen zu induzieren. Letztendlich werden analytische Methoden verwendet, um eine erhöhte Expression von braunen Adipozyten-spezifischen Genen zu zeigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, die Schlüsselfragen im braunen Fettgewebe zu beantworten, nämlich den molekularen Mechanismus, der die Entwicklung von hellen oder be-Zellen reguliert. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von Fettleibigkeit und anderen Zivilisationskrankheiten. Da die Manipulation von braunem Fettgewebe beim Menschen als potenzieller therapeutischer Eingriff genutzt werden kann, besteht der erste Schritt darin, das Verdauungsmedium vorzubereiten.

Nach der Euthanasie wird dann das Fettgewebe entfernt. Isolieren Sie zunächst das interscapularische braune Fettgewebe oder die Fledermaus, indem Sie entlang des Rückens des Tieres bis zum Hals schneiden. Zwei Lappen aus braunem Fettgewebe befinden sich direkt unter der Haut zwischen den Schultern.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig die dünne Schicht aus weißem Fett, die die Fledermaus bedeckt. Nach der Isolierung legen Sie das Gewebe direkt in sauberes PBS. Das leistenweiße Fettgewebe befindet sich auf beiden Seiten direkt unter der Haut.

Sie erstreckt sich bis zur Innenseite der Oberschenkel und hinunter zu den Hoden. Entfernen Sie das Tuch und legen Sie es in sauberes PBS. Die folgenden Schritte werden sowohl auf die Fledermaus- als auch auf die Nassprobe angewendet.

Entfernen Sie schnell alle Verunreinigungen wie Haare, Skelettmuskulatur und Bindegewebe aus den Gewebeabschnitten. Trocknen Sie das Taschentuch anschließend schnell auf einem Papiertuch ab, um eine Verdünnung des Seziermediums mit PBS zu verhindern, und legen Sie es auf eine trockene Platte. Geben Sie das Verdauungsmedium hinzu und hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke.

Übertragen Sie dann das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen, in dem sich der Rest des Verdauungsmediums befindet. Legen Sie das Röhrchen 40 bis 50 Minuten lang unter ständigem Rühren in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um es zu verdauen. Überprüfen Sie alle 10 bis 15 Minuten, um sicherzustellen, dass die Verdauung gut verläuft und um eine Überverdauung zu vermeiden.

Nachdem das Gewebe gut verdaut ist, stoppen Sie die Verdauung. Durch Zugabe von fünf Millilitern des kompletten Mediums und gutes Mischen sollten die Zellen fast vollständig homogen sein. Zentrifugieren Sie anschließend die Probe 10 Minuten lang bei 700 mal G.

Die stromale Gefäßfraktion sollte nun als bräunliches Pellet am Boden des Röhrchens sichtbar sein, die ölige reife Adipozytenschicht darüber und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht aspirieren. Als nächstes das Pellet in 10 Millilitern auflösen, auf mittlerer Stufe füllen und gut mischen. Nach dem Mischen ein Zellsieb über ein neues 50-Milliliter-Röhrchen legen und die Zellsuspension filtrieren.

Die gefilterte Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 700-fachem G zentrifugiert. Als nächstes aspirierst du das Medium und suspendierst das Pellet erneut. In 10 Millilitern des kompletten Mediums die Zellen nach Bedarf pipettieren und gut mischen.

Im Allgemeinen ergeben fünf Mäuse zwei 10 Zentimeter große Platten mit Leistenwasser und eine Platte mit Fledermaus. Ein bis zwei Stunden nach dem Plattieren. Aspirieren Sie die mittlere Waschung zweimal mit PBS und fügen Sie frisches Medium hinzu.

Dieser Schritt ist wichtig, da dadurch rote Blutkörperchen, Immunzellen und andere Verunreinigungen entfernt werden können. Die Wartungs- und Induktionsmedien werden im Voraus vorbereitet. Sobald die primären Adipozyten auf 95 bis 97 % Konfluenz angewachsen sind, wechseln Sie das reguläre vollständige Medium durch ein Induktionsmedium.

Wechseln Sie das Medium nach 48 Stunden gegen ein Erhaltungsmedium mit 0,5 mikromolaren RO-Glitazon. Wechseln Sie nach weiteren 48 Stunden für weitere zwei bis drei Tage zu einem frischen Erhaltungsmedium, das ein mikromolares RO-Glitazon enthält. Tröpfchen treten etwa drei bis vier Tage nach der Induktion auf, wie hier sechs bis sieben Tage nach der ersten Zugabe des Induktionsmediums.

Die Zellen sollten vollständig zu reifen Fettzellen differenziert sein und mit Öltröpfchen gefüllt sein. Zellen können nun geerntet und für weitere Analysen verwendet werden. Die Bräunung primärer Adipozyten kann durch Messung der mRNA von braunen Fett-spezifischen oder selektiven Genen mit Q-R-T-P-C-R beurteilt werden, wie hier zu sehen.

RO-Glitazon, robust induzierte UCP one mRNA-Expression FORSKOLIN-Behandlung, hier als zyklisches A MP bezeichnet. Die durch RO-Glitazon induzierte UCP-Eins-Expression wurde weiter erhöht. Cdia. Ein weiteres selektives Gen für braunes Fett war ebenfalls dosisabhängig stark erhöht. Die Behandlung mit RO-Glitazon erhöhte auch die Expression von FABP vier und dem adipogenen Marker sowohl für braunes als auch für weißes Fett.

Dieser Bräunungseffekt war nicht einfach auf eine Steigerung der Adipogenese an sich zurückzuführen. Da die Induktion von UCP 1 und CDIA-Expression immer noch signifikant war, selbst wenn die mRNA-Spiegel auf die von FABP vier normalisiert wurden, bestätigt dieser Western Blot den erhöhten Proteinspiegel von UCP eins. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Präadipozyten isoliert und wie man diese Zellen in Kultur in beige oder helle Zellen unterscheidet.