Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Live-Zell-Videomikroskopie-Experiment durchzuführen, um die Phagozytose des humanen Pilzerregers Candida albicans zu untersuchen. Dies wird durch erste Kultivierung bei Candida albicans über Nacht erreicht, so dass sie in ihre stationäre Phase übergehen. Der nächste Schritt besteht darin, J 7 74-Makrophagen in 35-Millimeter-Bildgebungsschalen mit Glasboden zu plattieren und über Nacht zu kultivieren.

Am nächsten Tag werden Candida albicans mit pH-sensitivem Zi gefärbt und die sauren Organellen der Makrophagen mit Lisotracker Rot angefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, ein Video des Phagozytose-Assays zu erstellen, bei dem die J 7 7 4 Makrophagen mit den Candida albicans kultiviert werden. Letztendlich kann das resultierende Video eine pazifische Stadienanalyse der Erkennung der Makrophagenmigration, des Engulfments und der Reifung der FGA-Zone zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Immun-Zyto-Chemie, besteht darin, dass die Live-Videomikroskopie verwendet werden kann, um beobachtete Unterschiede in einzelne Stadien wie Migration, Engulfment und Phagosomenreifung aufzuschlüsseln, die beeinflusst werden können. Differenziell kann diese Methode jedoch einen Einblick in die Phagozytose von Canada Acan geben. Es kann auch auf andere Systeme wie andere Krankheitserreger, Fresszellen, einschließlich dendritischer Zellen und Neutrophilen, angewendet werden.

Diese Kultur erfordert eine fortgeschrittene Vorbereitung von SC minus U-Agarplatten. Sie können gekühlt gelagert werden, beginnen Sie mit dem Streifen des Candida albican Serotyps, eines Stammes CI vier plus CLP 10 aus Glycerinbeständen, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, auf eine SC U-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis sich die Kolonien bilden, typischerweise 48 Stunden.

Zu diesem Zeitpunkt kann die Platte bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wählen Sie nun eine einzelne Kolonie aus und kultivieren Sie sie in fünf Millilitern, SCU oder Medium über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einer Wippe, die auf 200 U/min eingestellt ist. Dabei entstehen Candida albicans in der stationären Phase.

Fügen Sie 10 Mikroliter der Candida albicans-Übernachtkultur zu 990 Mikrolitern PBS bei pH 7,4 hinzu und führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch, um die Candida albicans während der Phagozytose-Assays zu visualisieren. Färben Sie 100 Millionen Candida mit Zi für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als nächstes entfernen Sie den ungebundenen Fitzy, indem Sie die Candida albicans dreimal in PBS waschen, um die Candida fünf Minuten lang bei 3000 mal G zu waschen. Entfernen Sie das Futter und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter PBS Reese.

Suspendieren Sie das endgültige Pellet in PBS in einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Mikroliter. Für dieses Protokoll wurde eine Kultur von J 7 7 4 0,1 Makrophagen in 75 cm großen quadratischen Gewebekulturflaschen in supplementiertem DMEM bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid aus dem Kolben hergestellt. Verschrotten Sie die Makrophagen und geben Sie sie in eine 50 Milliliter Falcon Tube Zentrif.

Verwenden Sie die Makrophagen bei 600 mal G für fünf Minuten, um einen Zellgaumen zu erhalten. Entfernen Sie das Supinat und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Vorkriegszusatz DM dmm. Zählen Sie nun die Zellen mit einem Hämozytometer und plädieren Sie 1 Million Zellen in einer 35-Millimeter-Bildgebungsschale auf Glasbasis mit zwei Millilitern supplementiertem DMM-Medium.

Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius und am nächsten Tag mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie vor der Bildgebung das supplementierte DMM-Medium durch zwei Milliliter vorwarmes Kohlendioxid-unabhängiges Medium, das ein Mikromolar Liso tracker red DND 99 und die gleichen Ergänzungen wie das DMM enthält. Der Mikroskopaufbau muss einen invertierten Tisch und eine auf 37 Grad Celsius beheizte Klimakammer sowie Anregungsemissionsfilter für die ausgewählten Färbungen umfassen, die fit und trixy sind.

In diesem Beispiel wird ein angewendeter Präzisions-Delta-Vision-Kern verwendet. Schalten Sie zunächst die Mikroskopheizung so ein, dass die Kontrollkammer auf 37 Grad Celsius erwärmt ist. Schalten Sie dann das Mikroskop und den Computer ein und laden Sie die Bildgebungssoftware, montieren Sie die Bildgebungsschüssel auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus ein, um die Makrophagen J 7 74 0,1 zu finden.

Optimieren Sie das Erscheinungsbild von trixi- und DIC-Bildern, indem Sie den Prozentsatz des durchgelassenen Lichts und die Belichtungszeiten anpassen. Entfernen Sie die Bildgebungsschale und geben Sie 3 Millionen fitsy stained Candida albicans in die Schale. Erfassen Sie die Uhrzeit und stellen Sie das Gericht wieder auf die Bühne, optimieren Sie bei Bedarf das Erscheinungsbild fitzy images und richten Sie bei Bedarf die Points of Interest in der Imaging-Software ein.

Beginnen Sie nun mit der Bildgebung, wenn alle Punkte scharf sind und die Kanäle optimiert sind. Nehmen Sie sechs Stunden lang jede Minute fitzy-, trixi- und DIC-Bilder auf. Dies ist die kritischste Phase des Verfahrens.

muss Zeit in Anspruch genommen werden, um das Mikroskop richtig einzurichten. Wenn die Filme unter- oder überbelichtet sind oder wenn sie unscharf sind, sind sie unbrauchbar und das Experiment muss wiederholt werden. Dieses repräsentative Video zeigt die Aufnahme von Candida albicans durch die murine Makrophagen-Zelllinie J 7 74 0.1.

Während eines sechsstündigen Videomikroskopie-Experiments wurden die Candida albicans in Grün mit dem pH-empfindlichen Farbstoff Fitsi gefärbt, der während der Ansäuerung des Makrophagen-Phagosoms abgeschreckt wurde. Um zu bestätigen, dass die Candida internalisiert wurden, wurden die sauren Kompartimente der Makrophagen mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Beachten Sie die Variation in der Anzahl der Candida albicans, die von einzelnen J 7 74 0,1 Makrophagen aufgenommen wurden. In diesem Experiment verschlangen 82 % der J 7 74 0,1 Makrophagen innerhalb der sechs Stunden mindestens eine Candida albican Zelle.

Die durchschnittliche Anzahl der pro Makrophagen aufgenommenen Candida albicans betrug 3,4, aber interessanterweise konnten Makrophagen bis zu 16 Pilzzellen aufnehmen. Die Daten ermöglichen die Beobachtung von Makrophagen und Candida albicans vor und während der Erkennung und Aufnahme. Candida albicans hyer kann innerhalb der Makrophagen weiter wachsen, was zu einer Makrophagenlyse führen kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Live-Zell-Videomikroskopie-Experimente mit Candida albicans an der J 7 7 4 0,1 Mikrophagen-ähnlichen Zelllinie durchführt. Sie sollten in der Lage sein, über Nacht Kulturen beider Zelltypen einzurichten und einen Phagozytose-Assay durchzuführen, der eine stadienspezifische Analyse der Migrationserkennung und des Engulfments sowie der Phagosomenreifung ermöglicht.