Name: Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie Live-Cell-Video-Mikroskopie zur Untersuchung der Phagozytose von Candida albicans durch Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Analyse einzelner Stadien wie Migration, Erkennung und Phagosomenreifung.

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LPE ist ein schottischer Senior Clinical Fellow und erkennt die Unterstützung des Chief Scientist Office (SCD/03). Diese Arbeit wurde vom Wellcome Trust Project Grant LPE (089.930) finanziert. NarG wurde von einem Wellcome Trust Programm Grant (080.088) und einer Ausrüstung Grant (075.470) (für DeltaVision), und durch eine FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 bis 260.338-Allfun) finanziert. Wir würden gerne die University of Aberdeen Bildgebung Anlage, insbesondere Kevin MacKenzie, für hilfreiche Unterstützung und Beratung danken.

Ein. C. albicans Wachstum und AGB <ol><li> Planen SC Ura-Agarplatten, indem 6,9 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenin Hemisulfat-Salz und 20 g technisches Agar (zuvor ausführlich in 11 beschrieben). Make-up Volumen auf 900 ml mit destilliertem H 2 O. Autoklaven ermöglichen Agar abkühlen, aber nicht genug, sich zu verfestigen, und fügen Sie dann 50 ml sterile 40% D-Glucose und 50 ml sterile 4% SC-Ura Dropout unter aseptischen Bedingungen. Mischen, in Petrischalen gießen und verlassen Agarplatten zu kühlen und zu verfestigen. Laden Agarplatten bei 5 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Streak C. albicans Serotyp Stamm CAI4 + CIp10 aus Glycerinstammkulturen bei -80 ° C auf SC Ura-Agar-Platte. </li><li> Inkubieren Platte bei 30 ° C bis Kolonien bilden und speichern bei 5 ° C. </li><li> Kultur ein einziges C. albicans-Kolonie in 5 ml SC-URA-Medium (Rezeptur wie in 1.1, aber ohne technische Agar) und Inkubation über Nacht bei 30° C, 200 Upm bis zur stationären Phase C zu erzeugen albicans. </li></ol> 2. C. albicans Färbung mit Fluorescein Isothiocyanate (FITC) <ol><li> Fügen Sie 10 ul C. albicans Übernachtkultur zu 990 ul PBS (pH 7,4) und führen eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Zur Visualisierung von C. helfen albicans während Phagozytose-Assays, Fleck 1 × 10 8 C. albicans unter Verwendung von 1 mg / ml FITC in 0,05 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Um ungebundenen FITC entfernen, waschen C. albicans in 1 ml 1 x PBS, Zentrifuge bei 3.000 × g für 5 min, entfernen Überstand und Pellet in 1 ml 1 x PBS. 3 Mal wiederholen. </li><li> Pellet bei 1 × 10 6 Zellen / ul in 1 x PBS. </li></ol> 3. Herstellung des J774.1 Maus-Makrophagen-Zelllinie <ol><li> Pflegen J774.1 Makrophagen in 75 cm 2 GewebeKulturflaschen in DMEM-Medium mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin bei 37 ° C mit 5% CO 2. Die Herstellung der primären Makrophagen anderer Stelle im Detail 12, 13 beschrieben. </li><li> Kratzen J774.1 Zellen aus der Zellkulturflasche und übertragen auf eine 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min, um eine Zelle Pellet zu erhalten. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in 10 ml vorgewärmten ergänzt DMEM Medium. Zählen von Zellen mit einem Hämocytometer und Platte 1 × 10 6 J774.1 Makrophagen in 2 ml ergänzt DMEM-Medium in einer 35 mm Glas-basierten Imaging Gericht. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Vor der Bebilderung, ersetzen ergänzt DMEM-Medium mit 2 ml vorgewärmt ergänzt CO 2-unabhängiges Medium (mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS), 200 U / ml Penicillin / Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) mit 1 uM LysoTracker Red DND-99.</li></ol> 4. Live Cell Video Microscopy Phagozytose Assay <ol><li> Die Wahl des Mikroskops wird auf das, was lokal verfügbar ist, sondern das Mikroskop Setup benötigen, um eine invertierte Bühne, ein Klimakammer erhitzt bis 37 zählen ° C und Anregung / Emission Filter für die ausgewählten Flecken (FITC und TRITC). </li><li> Einschalten des Mikroskops Heizeinrichtung vor dem Experiment und wenn genügend Zeit für die Umwelt Steuerkammer auf 37 ° C erwärmen Die Zeit für Kammertemperatur zu stabilisieren getroffen werden für verschiedene Mikroskop Setups variieren. </li><li> Schalten Sie das Mikroskop und Computer, und laden Sie die Imaging-Software. Montieren Sie den Imaging-Schüssel auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus auf die J774.1 Makrophagen zu finden. Optimieren das Aussehen TRITC und DIC Bildern durch Einstellen des Prozentsatzes von übertragenem Licht und Belichtungszeiten. </li><li> Entfernen Sie die Imaging-Schüssel und fügen Sie 3 × 10 6 FITC gefärbten C. albicans bis ter austeilen. Notieren Sie sich die Zeit, dass C. albicans ist zu der Schale hinzugefügt. Bringen Sie den Teller auf die Bühne und optimieren das Erscheinungsbild der FITC Bilder, wenn nötig. Richten Sie eine Punkteliste, falls erforderlich. </li><li> Abbildungssystem beginnen, wenn alle Punkte in Fokus sind, und die Kanäle optimiert sind. Erfassen FITC, TRITC und DIC Bilder pro Minute für 6 Stunden. </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren. NG ist ein Empfänger des uneingeschränkten Zuschüsse für die Grundlagenforschung von Gilead Sciences. LE arbeitet als Berater für GSK in der frühen Entwicklung von Medikamenten.

Hier wird das Verfahren für die Verwendung von lebenden Zellen zu Makrophagen Videomikroskopie Phagozytose zu untersuchen beschrieben. Video-Mikroskopie bietet mehrere zusätzliche Schichten von Informationen für die Analyse. Ein wesentlicher Vorteil ist, dass die Aufnahme von Daten erzeugt werden (aus einem einzigen Experiment) für jeden Zeitpunkt während des Beobachtungszeitraums von 6 Stunden werden. Noch wichtiger ist, ermöglicht das beschriebene Verfahren differentiellen Analyse der einzelnen Phasen der Phagozytose. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass Veränderungen in der gesamten Aufnahme von C. albicans Glykosylierung und Morphogenese Mutanten durch Makrophagen Zelllinien und primäre Makrophagen kann entweder eine Folge von Änderungen der Makrophagen-Migrations-Richtung Zielzellen oder Rate von einmal engulfment Zell-Zell-Kontakt hergestellt 7 sein. Es gibt eine Anzahl von Fallen zu vermeiden, wenn die Durchführung dieser Versuche. Erstens ist es sehr wichtig, um stabile Umgebungsbedingungen über den Versuchszeitraum Verfah sicherzustellenDure. Dies wird am besten in einer Klimakammer, die den experimentellen Bedingungen mehrere Stunden vor Beginn des Experiments eingestellt ist erreicht. Video Qualität ist stark abhängig von anspruchsvollen Module, Infrarot-Laser verwenden, um automatisch die Probe z-Position, unabhängig von mechanischen oder thermischen Veränderungen wodurch die Notwendigkeit für manuelle Fokussierung Korrekturen. Angesichts der verlängerte Natur der Experimente ist es wichtig, Laserlicht ausgesetzt und die damit verbundenen Photobleichen und Photokonversion Effekte, die durch den Einsatz stark fluoreszierende Marker, die geringer Belichtungszeiten erleichtern minimiert werden kann, einschränken. Die FITC Färbung hier beschriebene Protokoll ist schnell und zuverlässig. Als FITC ist ein sehr helles und stabile Fleck, niedrige Belichtungszeiten erforderlich sind und dies macht FITC ideal für ausgedehnte Zeitraffer-Filme. Allerdings verwenden wir routinemäßig eine Vielzahl von verschiedenen Ziel-Flecken, einschließlich Calcofluor Weiß und PKH Farbstoffe sowie getaggt Organismen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die meisten unserer veröffentlichten Arbeit wird unter Verwendung eines Weitwinkel-Mikroskop, sondern Exposition kann durch die Verwendung eines Spinning Disc konfokalen Mikroskop und in unseren Händen das ist wesentlich für Zeitraffer-3D-Video-Mikroskopie minimiert werden. Während dieser Studie wurden Bilder von 1 min Intervallen über einen 6 h Phagozytose Assay erfasst. Das Intervall zwischen den Bildern kann angepasst je nach Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel kann der Abstand verringert, wenn die Untersuchung schnelle Prozesse, wie Vesikeltransport werden. Das minimale Zeitintervall wird von Mikroskop und Kamera Spezifikationen. Es gibt einige Überlegungen zu bedenken, beim Einstellen Timings. Zunächst wird die Verringerung der Abstand zwischen Snapshots bedeutet weniger Punkte abgebildet werden können und die Dateigröße erheblich erhöht werden. Im Gegenteil, wird die Erhöhung der Bild-Intervall zu viel machen den Film zu verlieren Kontinuität. Dieser Ansatz kann angewendet werdenim Prinzip zu studieren anderen Krankheitserregern und die Aufnahme von sterbenden Wirtszellen. Zum Beispiel haben wir vor kurzem gezeigt, dass Knochenmark-Makrophagen aus Sialoadhesin-defizienten Mäusen erheblich weisen verminderte Bindung und Phagozytose von sialylierten Campylobacter jejuni 8. Jedoch ist Zielgröße eine wichtige Determinante für Durchführbarkeit als Bildanalyse wird zunehmend schwieriger mit einer Reduzierung der Zielzelle skalieren. Anspruchsvolle Bildanalysesoftware notwendig für schnelle Videomikroskopie Analyse, und dies sollte mit entsprechenden Bioinformatik Träger gekoppelt werden, um die Erzeugung von Algorithmen, um die Migration der einzelnen Zellen und ganzen Zellpopulationen 7 studieren erleichtern. Live-cell Videomikroskopie in Kombination mit anspruchsvollen Bildanalyse-Software für die von Minute zu Minute Analyse von Migration und individuellen Makrophagen-C.albicans Interaktionen, bietet einen einzigartigen Einblick in die Komplexität von C. albicans Phagozytose durch macrophages. Es gibt ein enormes Potenzial, um diese Methoden zu erweitern, um andere Krankheitserreger und Fresszellen (dendritische Zellen, Neutrophile) zu studieren und 3D-Video-Mikroskopie Bild Zell-Zell-Interaktionen näher oder mehr physiologischen Oberflächen wie Epithel-und Endothelzellen Schichten zu entwickeln. Diese Technik ist Teil der nächsten Generation von Werkzeugen in der Studie der Wirt-Pathogen-Interaktionen und wird dazu beitragen detaillierte räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Adenin Hemisulfat Salz </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar technischen (Nr. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura Dropout </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Natriumcarbonat </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Lonza </td><td> BE17-605e </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 mm Glas-Gerichte </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video mikroskopie pilzpathogenentwicklung phagozytose

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagozytische Abstand von pilzlichen Pathogenen und Mikroorganismen allgemein kann als aus vier verschiedenen Phasen bestehen: (i) die Migration von Phagozyten an den Ort, wo Krankheitserreger befinden, (ii) die Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) durch Muster Erkennungsrezeptoren (PRRs), (iii) engulfment von Mikroorganismen gebunden an den Phagozyten Zellmembran, und (iv) Verarbeitung des Reifung verschlungen Zellen innerhalb Phagosomen und Verdauung der eingenommenen Teilchens. Studien, die Phagozytose Beurteilung in seiner Gesamtheit sind informativ 1, 2, 3, 4, 5, aber begrenzt sind, dass sie in der Regel nicht zu brechen den Vorgang ab in die Migration, engulfment und Phagosomenreifung, die unterschiedlich betroffen sein. Weiterhin Messung solcher Studien Aufnahme als ein einziges Ereignis, und nicht als ein kontinuierlicher dynamischer Prozess. Wir haben vor kurzem erweiterten Live-Cell-Imaging-Technologien entwickelt und kombiniert haben diese mit genetischen funktionelle Analyse von sowohlErreger und Wirtszellen, um eine übergreifende Plattform für die Analyse des angeborenen Immunsystems Zellfunktion und Pathogenität von Pilzen. Diese Studien haben neue Aspekte der Phagozytose, die nur beobachtet, wenn systematische zeitliche Analyse der molekularen und zellulären Interaktionen zwischen menschlichen Phagozyten und pilzlichen Krankheitserregern und infektiösen Mikroorganismen allgemein werden konnte aufgedeckt. Zum Beispiel haben wir begonnen, folgendes zu definieren: (a) die Komponenten der Zelloberfläche für jede Stufe des Prozesses der Erkennung, engulfment und Tötung von Pilzzellen 1, 6, 7, 8 erforderlich, (b), wie Oberflächengeometrie Einfluss auf die Effizienz der Makrophagen Aufnahme und Tötung von Hefe und Hyphen Zellen 7 und (c) wie engulfment führt zu Veränderungen des Zellzyklus und das Verhalten der Makrophagen 9, 10. Im Gegensatz zum einzigen Zeitpunkt Momentaufnahmen, ermöglicht die Live-Video-Mikroskopie Zelle eine Vielzahl von Wirtszellen und Pathogenen als Co untersuchendenntinuous Sequenzen über längere Zeiträume, eine räumliche und zeitliche Informationen über eine breite Palette von dynamischen Prozessen, einschließlich der Zellmigration, Replikation und Vesikeltransport. Hier beschreiben wir detailliert, wie Host-und Pilzzellen vorzubereiten, und die Video-Mikroskopie Experimente durchzuführen. Diese Methoden können eine Benutzer-Leitfaden für künftige Studien mit anderen Phagozyten und Mikroorganismen.

Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse für C. albicans Aufnahme durch einen murinen Makrophagen-Zelllinie J774.1 während einer 6 Stunden lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment. Abbildung 1 ist eine repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Film und zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Live-cell Videomikroskopie können Internalisierung von C. albicans zu sein, ohne die Notwendigkeit, externe Candida Färbung visualisiert. jedoch während dieser Experimente, C. albicans wurde angefärbt unter Verwendung des pH-empfindlichen Farbstoff FITC (grün), die während des Ansäuerns des Makrophagen Phagosom abgeschreckt wird, und erleichtert eine Bestätigung, dass Candida internalisiert wurde (Abbildung 1). Zur weiteren Unterstützung Visualisierung der aufgenommenen C. albicans, Makrophagen wurden angefärbt unter Verwendung des roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99, welche Flecken sauren Abteile und dient als ein nicht-spezifischer Marker für Phagosomenreifung.2 ist ein Standbild von einer Live-Video-Mikroskopie Zelle Experiment und veranschaulicht die Veränderung in der Anzahl von C. albicans eingenommen durch einzelne J774.1 Makrophagen. In diesem Experiment wurden 82% der verschlungen J774.1 Makrophagen mindestens eine C albicans-Zelle am Ende der 6 h Phagozytose Assay. In Abbildung 3 ist die Zahl der verinnerlichten C. albicans Zellen pro Makrophagen gemeldet. Die mittlere Anzahl der C. albicans pro up Makrophagen aufgenommen ist 3,4, aber interessanterweise Makrophagen kann Ingest bis 16 Pilzzellen. Abbildung 4 ist eine Folge von Standbildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen phagozytierenden C. albicans-Zellen, Hyphe Wachstum mit der Makrophagen und letztlich Makrophagen Lyse. Abbildung 4 zeigt, dass Videomikroskopie ermöglicht die Analyse von Ereignissen nach engulfment von Zielzellen, dh Daten des ki erzeugt werdenlling von Makrophagen durch C. albicans Hyphen in Bezug auf die Anzahl der aufgenommenen und Morphogenese Zielzellen und wie Makrophagen Tötung betrifft Phagosomenreifung die in Echtzeit untersucht werden kann. Abbildung 1. Live-cell Videomikroskopie Film zeigt Phagozytose von C. albicans by murine J774.1 Makrophagen. Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Makrophagen und C. albicans wurden für einen Zeitraum von 6 h ​​bei 37 ° C co-kultiviert in vollständiger CO 2-unabhängiges Medium. Die Bilder wurden bei 1 min Intervalle für 6 Stunden gefangen. Makrophagen ersichtlich Einrichtung Zell-Zell-Kontakt mit C werden albicans, die dann durch Aufnahme von C folgt albicans in Makrophagen Phagosomen. Pfeile zeigen auf C. albicans vor durch J774.1 Makrophagen Phagozytose. Dieses Video zeigt auch, dass FITC Fluoreszenz QuEnched folgenden engulfment von C. albicans. Maßstab, 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative lebenden Zellen Videomikroskopie Standbild zeigt Variierung in der Anzahl von C.albicans durch einzelne Makrophagen verschlungen. Makrophagen (gebeizt mit LysoTracker roten DND-99) wurden mit FITC-gefärbte C. co-kultiviert albicans (grün). Es gibt Schwankungen in der Anzahl von C. albicans verschlungen (eine Zahl neben einem Pfeil zeigt die Anzahl von C. albicans verschlungen) und in C. albicans Morphologie (dh Hefe Verse Hyphen). Maßstab, 20 mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Abbildung 3. Graph zeigt die Anzahl der C. albicans pro Einnahme J774.1 murinen Makrophagen am Ende der 6 h Phagozytose Assays. Die Daten repräsentieren 2 unabhängigen Experimenten. Insgesamt 100 Makrophagen wurden aus 3 Felder aus jedem Experiment gezählt, was eine Gesamtzahl von 600 einzelnen Makrophagen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Abbildung 4. Eine Reihe von Bildern von einer repräsentativen lebenden Zellen Videomikroskopie Experiment zeigt eine Makrophagen (M) und C. albicans (C) vor und während der Erkennung (A, B), und während und nach der Aufnahme (C, D). C. albicans Hyphen weiterhin im Makrophagen-(E, F), die in Makrophagen Lyse (G) führen können wachsen. Andere Makrophagen gezielt zum Ort des Bruches und versuchen, den Freigabe C. Ingest rekrutiert albicans (H). Makrophagen sind gefärbt mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff LysoTracker roten DND-99 und C albicans gefärbt mit FITC (grün). Beachten Sie, dass FITC Färbung nach C abgeschreckt albicans Aufnahme durch Makrophagen J774.1 (C). Maßstab, 10 mm.

Wir beschreiben Methoden für Live-Cell-Video-Mikroskopie<em&gt; Candida albicans</em&gt; Phagocytose durch Makrophagen. Diese Methoden ermöglichen stage-spezifische Analyse der Makrophagen-Migrations-, Anerkennung, engulfment und Phagosomenreifung und zeigen neue Aspekte der Phagozytose.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Live-Zell-Videomikroskopie-Experiment durchzuführen, um die Phagozytose des humanen Pilzerregers Candida albicans zu untersuchen. Dies wird durch erste Kultivierung bei Candida albicans über Nacht erreicht, so dass sie in ihre stationäre Phase übergehen. Der nächste Schritt besteht darin, J 7 74-Makrophagen in 35-Millimeter-Bildgebungsschalen mit Glasboden zu plattieren und über Nacht zu kultivieren.Am nächsten Tag werden Candida albicans mit pH-sensitivem Zi gefärbt und die sauren Organellen der Makrophagen mit Lisotracker Rot angefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, ein Video des Phagozytose-Assays zu erstellen, bei dem die J 7 7 4 Makrophagen mit den Candida albicans kultiviert werden. Letztendlich kann das resultierende Video eine pazifische Stadienanalyse der Erkennung der Makrophagenmigration, des Engulfments und der Reifung der FGA-Zone zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Immun-Zyto-Chemie, besteht darin, dass die Live-Videomikroskopie verwendet werden kann, um beobachtete Unterschiede in einzelne Stadien wie Migration, Engulfment und Phagosomenreifung aufzuschlüsseln, die beeinflusst werden können. Differenziell kann diese Methode jedoch einen Einblick in die Phagozytose von Canada Acan geben. Es kann auch auf andere Systeme wie andere Krankheitserreger, Fresszellen, einschließlich dendritischer Zellen und Neutrophilen, angewendet werden.Diese Kultur erfordert eine fortgeschrittene Vorbereitung von SC minus U-Agarplatten. Sie können gekühlt gelagert werden, beginnen Sie mit dem Streifen des Candida albican Serotyps, eines Stammes CI vier plus CLP 10 aus Glycerinbeständen, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden, auf eine SC U-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius, bis sich die Kolonien bilden, typischerweise 48 Stunden.Zu diesem Zeitpunkt kann die Platte bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wählen Sie nun eine einzelne Kolonie aus und kultivieren Sie sie in fünf Millilitern, SCU oder Medium über Nacht bei 30 Grad Celsius auf einer Wippe, die auf 200 U/min eingestellt ist. Dabei entstehen Candida albicans in der stationären Phase.Fügen Sie 10 Mikroliter der Candida albicans-Übernachtkultur zu 990 Mikrolitern PBS bei pH 7,4 hinzu und führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer durch, um die Candida albicans während der Phagozytose-Assays zu visualisieren. Färben Sie 100 Millionen Candida mit Zi für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als nächstes entfernen Sie den ungebundenen Fitzy, indem Sie die Candida albicans dreimal in PBS waschen, um die Candida fünf Minuten lang bei 3000 mal G zu waschen. Entfernen Sie das Futter und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter PBS Reese.Suspendieren Sie das endgültige Pellet in PBS in einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Mikroliter. Für dieses Protokoll wurde eine Kultur von J 7 7 4 0,1 Makrophagen in 75 cm großen quadratischen Gewebekulturflaschen in supplementiertem DMEM bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid aus dem Kolben hergestellt. Verschrotten Sie die Makrophagen und geben Sie sie in eine 50 Milliliter Falcon Tube Zentrif.Verwenden Sie die Makrophagen bei 600 mal G für fünf Minuten, um einen Zellgaumen zu erhalten. Entfernen Sie das Supinat und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern Vorkriegszusatz DM dmm. Zählen Sie nun die Zellen mit einem Hämozytometer und plädieren Sie 1 Million Zellen in einer 35-Millimeter-Bildgebungsschale auf Glasbasis mit zwei Millilitern supplementiertem DMM-Medium.Inkubieren Sie das Gericht über Nacht bei 37 Grad Celsius und am nächsten Tag mit 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie vor der Bildgebung das supplementierte DMM-Medium durch zwei Milliliter vorwarmes Kohlendioxid-unabhängiges Medium, das ein Mikromolar Liso tracker red DND 99 und die gleichen Ergänzungen wie das DMM enthält. Der Mikroskopaufbau muss einen invertierten Tisch und eine auf 37 Grad Celsius beheizte Klimakammer sowie Anregungsemissionsfilter für die ausgewählten Färbungen umfassen, die fit und trixy sind.In diesem Beispiel wird ein angewendeter Präzisions-Delta-Vision-Kern verwendet. Schalten Sie zunächst die Mikroskopheizung so ein, dass die Kontrollkammer auf 37 Grad Celsius erwärmt ist. Schalten Sie dann das Mikroskop und den Computer ein und laden Sie die Bildgebungssoftware, montieren Sie die Bildgebungsschüssel auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Fokus ein, um die Makrophagen J 7 74 0,1 zu finden.Optimieren Sie das Erscheinungsbild von trixi- und DIC-Bildern, indem Sie den Prozentsatz des durchgelassenen Lichts und die Belichtungszeiten anpassen. Entfernen Sie die Bildgebungsschale und geben Sie 3 Millionen fitsy stained Candida albicans in die Schale. Erfassen Sie die Uhrzeit und stellen Sie das Gericht wieder auf die Bühne, optimieren Sie bei Bedarf das Erscheinungsbild fitzy images und richten Sie bei Bedarf die Points of Interest in der Imaging-Software ein.Beginnen Sie nun mit der Bildgebung, wenn alle Punkte scharf sind und die Kanäle optimiert sind. Nehmen Sie sechs Stunden lang jede Minute fitzy-, trixi- und DIC-Bilder auf. Dies ist die kritischste Phase des Verfahrens.Es muss Zeit in Anspruch genommen werden, um das Mikroskop richtig einzurichten. Wenn die Filme unter- oder überbelichtet sind oder wenn sie unscharf sind, sind sie unbrauchbar und das Experiment muss wiederholt werden. Dieses repräsentative Video zeigt die Aufnahme von Candida albicans durch die murine Makrophagen-Zelllinie J 7 74 0.1.Während eines sechsstündigen Videomikroskopie-Experiments wurden die Candida albicans in Grün mit dem pH-empfindlichen Farbstoff Fitsi gefärbt, der während der Ansäuerung des Makrophagen-Phagosoms abgeschreckt wurde. Um zu bestätigen, dass die Candida internalisiert wurden, wurden die sauren Kompartimente der Makrophagen mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt. Beachten Sie die Variation in der Anzahl der Candida albicans, die von einzelnen J 7 74 0,1 Makrophagen aufgenommen wurden. In diesem Experiment verschlangen 82 % der J 7 74 0,1 Makrophagen innerhalb der sechs Stunden mindestens eine Candida albican Zelle.Die durchschnittliche Anzahl der pro Makrophagen aufgenommenen Candida albicans betrug 3,4, aber interessanterweise konnten Makrophagen bis zu 16 Pilzzellen aufnehmen. Die Daten ermöglichen die Beobachtung von Makrophagen und Candida albicans vor und während der Erkennung und Aufnahme. Candida albicans hyer kann innerhalb der Makrophagen weiter wachsen, was zu einer Makrophagenlyse führen kann.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Live-Zell-Videomikroskopie-Experimente mit Candida albicans an der J 7 7 4 0,1 Mikrophagen-ähnlichen Zelllinie durchführt. Sie sollten in der Lage sein, über Nacht Kulturen beider Zelltypen einzurichten und einen Phagozytose-Assay durchzuführen, der eine stadienspezifische Analyse der Migrationserkennung und des Engulfments sowie der Phagosomenreifung ermöglicht.

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose Cryptococcus neoformans Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Hier beschreiben wir eine mikroskopbasierte Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der frühen Kaskaden von Ereignissen während der Phagozytose von Krankheitserregern wie den Pilzen Candida albicans und Partikeln, die größer als 0,5 μm sind, einschließlich Zymosan und IgG-beschichteten Kügelchen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.

Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

Erfahren Sie Live-Cell-Video-Mikroskopie zur Untersuchung der Phagozytose von Candida albicans durch Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Analyse einzelner Stadien wie Migration, Erkennung und Phagosomenreifung.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

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