Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, festzustellen, ob genetische Läsionen, die für Brustkrebs prädisponiert sind, das Verhalten von Zirbeldrüsen-Plastikgedächtniszellen in Primärkulturen verändern. Dies wird durch die Isolierung primärer Brustepithelzellen von gentechnisch veränderten Mäusen erreicht. In einem zweiten Schritt wird über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen eine Zeitrafferbildgebung von lebenden Zellen durchgeführt, bei der ein Film zur Analyse des Zellverhaltens erstellt wird.

Dann wird ein Softwareprogramm, das einzelne Zellen verfolgt, verwendet, um das Verhalten von Zellen zu quantifizieren und zu vergleichen, die aus verschiedenen gentechnisch veränderten Mausmodellen von Brustkrebs isoliert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass spezifische genetische Läsionen unterschiedliche Verhaltensweisen im präneoplastischen Gedächtnis induzieren. Epithelzellen basierend auf quantitativen Verhaltensanalysen, die mittels Einzelzellverfolgung durchgeführt werden.

Diese Methode kann jedoch Aufschluss darüber geben, wie verschiedene genetische Läsionen das Verhalten präneoplastischer Brustepithelzellen von Müttern verändern. Es kann auch auf andere Systeme wie präneoplastische, Zellen aus anderen Organen, Krebszellen aus beliebigen Organen angewendet werden, einschließlich der Untersuchung möglicher therapieinduzierter Verhaltensänderungen sowie Vergleiche des Verhaltens von Stromazellen aus normalem und krebsartigem Gewebe, die das Verfahren demonstrieren. Heute sind Dr. Priscilla Firth, leitende Autorin dieser Publikation, und Pete Johnson, Manager des Mikroskopie und Bildgebung am Lombardi Cancer Research Center an der Georgetown University, anwesend.

Euthanasiere eine Maus und fahre sofort mit der Autopsie fort. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine Styropor-Nekropsie-Plattform und befestigen Sie alle vier Gliedmaßen, so dass die Bauchhaut gespannt ist. Tränken Sie die Bauchhaut und das Haar, einschließlich der Haut an den Gliedmaßen, mit 70% Ethanol.

Legen Sie die Brustdrüsen Nummer zwei und drei sowie die Drüsen Nummer vier und fünf mit einem Mittellinienschnitt durch die Haut frei. Verlängern Sie den Schnitt mit zwei y-Schnitten durch die mediale Haut der vier Gliedmaßen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mit einer stumpfen Dissektion in das Peritoneum gelangen.

Trennen Sie die Haut vom darunter liegenden Bauchfell. Ziehe die Haut auf beiden Seiten nach hinten, bis sie straff ist, und stecke sie an der Außenseite beginnend an die Plattform. Verwenden Sie die Schere, um eine stumpfe Dissektion durchzuführen, bei der die intakten Inal- und/oder Brustdrüsen vom darunter liegenden Bindegewebe und Muskel isoliert werden.

Legen Sie eine oder zwei Brustdrüsen in eine 10 Zentimeter große Petrischale und geben Sie sie in eine Gewebekulturhaube. Untersuchen Sie nun die Drüsen auf Brustlymphknoten. Kleine, gut umschriebene Knötchen mit gelblicher Farbe.

Entferne sie mit einem Skalpell und einer Pinzette von der umgebenden Drüse. Zerkleinern Sie das Brustgewebe mit zwei Skalpellen in millimetergroße Würfel. Legen Sie das zerkleinerte Brustgewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Dissoziationsmedium.

Mischen Sie es mit sanfter Tation und inkubieren Sie es über Nacht. Halten Sie die Kappe am nächsten Tag locker. Isolierung und Kultivierung der primären Epithelzellen.

Unmittelbar nach dem Plattieren der Zellen. Positionieren Sie die Sechs-Well-Platte sicher auf einem Mikroskoptisch in einer Inkubationskammer. Lassen Sie die Platte mindestens 15 Minuten lang im Gleichgewicht ruhen.

Stellen Sie den Kondensor auf die Kohler-Beleuchtung ein und zentrieren Sie die Phasenringe. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware wie Velocity und erstellen und benennen Sie eine Bibliothek für die Zeitrafferbilder und speichern Sie sie an einem Ort mit ausreichend Platz für große Dateien. Senken Sie die Objektive ab, um Interferenzen mit dem Tischobjektiv zu vermeiden.

Wählen Sie unter der Überschrift "Tisch" die Option "Tisch kalibrieren" aus, um die Fokusebene "Z gleich Null" auf der Registerkarte "X", "Y, Z" neu zu erfassen. Und markieren Sie Bildpunkte, indem Sie unter dem Tisch Punkt hinzufügen auswählen. Kurs Platzieren Sie Bildgebungspunkte in der Mitte jedes Wells.

Die Phasenkontrastbildgebung kann in der Nähe der Peripherie von Kunststoffvertiefungen verzerrt sein. Ordnen Sie Punkte in einem Quadrat in vier mal vier Feldern mit einer Überlappung von jeweils ca. 5 % an. Speichern Sie die ausgewählten Punkte unter der Bühne.

Wählen Sie unter Phase die Option Fokuskarte erstellen aus, und folgen Sie der Anweisung, um den Fokus der einzelnen Punkte festzulegen. Stellen Sie dann den Zeitpunkt der Bildaufnahme so ein, dass die richtige Anzahl von Bildern pro Stunde aufgenommen wird. Speichern Sie nun die Fokuskarte unter der Bühne.

Fahren Sie fort, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Bildaufnahme in der rechten Symbolleiste klicken. Speichern Sie dann die Imaging-Einstellungen. Drücken Sie die Aufnahmetaste, um den Bildgebungsprozess nach einer Stunde zu starten, überprüfen Sie den Fokus der Bilder, um festzustellen, ob eine Anpassung erforderlich ist.

Überwachen Sie die Live-Bildgebung und setzen Sie sie fünf Tage lang fort, wenn die Zellen zusammenfließen. Es ist wichtig, die aufgenommenen digitalen Bilder zu überwachen und die Fokuskarte während der ersten 24 Stunden häufig anzupassen, da die Zellen danach mindestens zweimal täglich an der Platte haften. Vergewissern Sie sich, dass sich die Zellen im Fokus befinden und die Kulturen nicht kontaminiert sind.

Um den Mechanismus der anfänglichen Koloniebildung zu bestimmen, beginnen Sie mit einem einzelnen Bildstapel, der eine Bildgebungsstelle auf der Platte darstellt. In den ersten Frames werden die Zellen schweben, Epithel- und Fibroblastenzellen können anhand der Zellmorphologie unterschieden werden. Epithelzellen haben eine quaderförmige Form und bilden Zellkolonien.

Fibroblasten, eine Art von Stromazellen, haben eine längliche Morphologie. Befolgen Sie die seriellen Bilder, um festzustellen, wann die erste Epithelzelle an der Platte haftet. In diesem Schritt können Epithelzellen identifiziert und von Fibroblasten anhand ihrer quaderförmigen Morphologie unterschieden werden.

Verfolgen Sie diese einzelne Epithelzelle durch serielle Bilder und verfolgen Sie ihr Schicksal in den folgenden 24 Stunden. Es ist zu beachten, ob die Zelle von zusätzlichen Epithelzellen umgeben ist, sich teilt oder Apoptose durchläuft. Wenn sie von Epithelzellen umgeben ist, kann der Mechanismus der Koloniebildung aus der Aggregation der umgebenden Zellen oder aus der Zellteilung bestimmt werden. Erfassen Sie die Anzahl der Kolonien, die während der ersten 24 Stunden durch Zellaggregation im Vergleich zur Zellteilung gebildet werden, um die Anzahl der anfänglich adhärenten Zellen zu bestimmen, die über einen bestimmten Zeitraum Apoptose durchlaufen.

Verfolgen Sie die seriellen Bilder, um das Erscheinungsbild klassischer Merkmale der Apoptose zu sehen, die sich in einer Zelle entwickeln, die im Laufe der Zeit adhärent war. Epithelzellen in Kultur verändern ihre Morphologie von einer anfänglichen quaderförmigen Form zu einem länglicheren Aussehen. Im Einklang mit EMT.

Befolgen Sie die Serienbilder, um den Tag und die Stunde nach dem Plattieren zu bestimmen. Wenn dies der Fall ist, beginnen Sie mit dem Starten des TTT-Programms. Wählen Sie die Initialen des Benutzers aus und klicken Sie auf Weiter. Drücken Sie auf Set NAS, wählen Sie den vom Benutzer erstellten TTT-Exportordner aus und klicken Sie auf OK.

Wählen Sie im Browser einen Experimentordner aus. Wählen Sie einen Positionsordner aus, und drücken Sie dann die Schaltfläche Ladeposition. Senden Sie den Augenfaktor auf 10 mal.

Laden Sie die Anzahl der erforderlichen Bilder, d. h. in der Regel alle Bilder. Bei der Verwendung dieser Analyse. Wählen Sie zum ersten Mal im Zelleneditor-Fenster im Menü "Datei" im Filmfenster die Option "Neue Kolonie" aus.

Drücken Sie die Taste für die Spurzelle oder drücken Sie F zwei. Um mit der Verfolgung einer Zelle zu beginnen. Identifizieren Sie eine Zelle im Filmfenster und platzieren Sie den Cursor über der Zelle.

Ein Kreis mit der Nummer der Zelle sollte erscheinen, nachdem auf F zwei geklickt wurde. Verwenden Sie die Nulltaste auf dem Ziffernblock, um die Position der Zelle zu verfolgen und zum nächsten Bild zu gelangen. Bewegen Sie den Cursor, um die Position der einzelnen Zellen in den einzelnen Frames zu verfolgen.

Um eine Spur zu löschen und zum vorherigen Bild zurückzukehren, drücken Sie die Entf-Taste auf dem Ziffernblock, um Frames vorwärts zu bewegen, ohne die Zelle zu verfolgen, drücken Sie drei. Und um sich ohne Verfolgung rückwärts zu bewegen, drücken Sie die Eins-Taste. Um eine Zellteilung im Filmfenster zu markieren, klicken Sie auf die Schaltfläche "Teilung", um den Zelltod im Filmfenster zu markieren, klicken Sie auf "Zelltod".

Sobald eine Teilung stattgefunden hat, können die Tochterzellen in derselben Zellschicksalskarte verfolgt werden. Gehen Sie dazu in das Fenster des Zelleneditors und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Kreissymbol der angegebenen Dotterzelle. Dadurch wird der Tracking-Modus automatisch gestartet, drücken Sie nun F 10, um den Baum zu speichern.

Jeder Baum wird im angegebenen Ausgabeordner gespeichert. Um eine neue Sulfat-Map im Fenster des Zelleneditors zu starten, wählen Sie das Menü "Öffnen" aus, klicken Sie auf "Datei" und dann auf "Datei". Neue Koloniezellen waren zu Beginn der Bildgebung abgerundet und schwimmend.

Die Größe der Stäbe entspricht 200 Mikrometern Nach dem Anbringen an der Platte wurden sie flach und zeigten ein quaderförmiges Aussehen. Nach vier Tagen der Kultivierung verlängerte sich die Mehrheit der Epithelzellen zu einer EMT-ähnlichen Morphologie. Diese Veränderung trat bei gleicher Chronologie auf: In allen untersuchten Genotypen entwickelten sich die schwimmenden Zellen zu definierten individuellen Epithelzellkolonien.

24 Stunden nach der Beschichtung zeigte die serielle Bildanalyse, dass diese Kolonien eher durch Zellaggregation als durch Zellteilung entstanden waren. Die Störung von BRCA allein veränderte zwar nichts an der Anzahl der gebildeten Kolonien. Die Zugabe der TP 53 Haplo-Insuffizienz reduzierte die Anzahl der gebildeten Kolonien signifikant.

Ebenso erhöhte die Zugabe von ER alpha über die Expression die Anzahl der nach diesem Verfahren gebildeten Kolonien signifikant. Andere Methoden, die die Verwendung von Zeitraffer-Bildgebung in Kombination mit Einzelzellverfolgung verwenden, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie bestimmte therapeutische Ansätze oder zusätzliche genetische Läsionen das Zellverhalten verändern und entweder das therapeutische Ansprechen oder das Fortschreiten der Krebserkrankung beeinflussen können.