Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, riesige uni-lamelläre Vesikel in einer Weise zu präparieren, die mit der funktionellen Integrität der in die Vesikelmembran eingebauten Membranproteine kompatibel ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Lipide oder kleine Liposomen auf eine leitfähige Oberfläche wie einen ITO-beschichteten Objektträger abgeschieden werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Lösungsmittel kontrolliert zu verdampfen, um einen gleichmäßigen Lipidfilm auf der leitfähigen Oberfläche zu erreichen.

Anschließend wird der Lipidfilm vorsichtig in einem geeigneten Puffer rehydriert und die Elektrobildungskammer vorbereitet. Der letzte Schritt besteht darin, eine oszillierende Spannung über den Lipidfilm anzulegen, um riesige unale Miller-Vesikel zu erzeugen. Abschließend werden die Vesikel abgebildet, um ihre Größe und Qualität zu bestimmen und mit Vesikeln zu vergleichen, die mit einer klassischen Technik gebildet wurden.

visuelle Demonstration dieses Protokolls ist nützlich, da die Lipidablagerung schwer zu beherrschen sein kann, von vielen Variablen abhängt und am besten durch visuelle Inspektion getestet werden kann. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, nehmen Sie die Lipide bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius aus der Lagerung und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur. Wenn möglich, führen Sie das Experiment in einer Inertgasatmosphäre durch, z. B. in einem Handschuhfach.

Bedecken Sie anschließend die Lipide mit trockenem Argonnen- oder Stickstoffgas und minimieren Sie in allen Schritten die Exposition gegenüber der Luft. Wenn die Lipide nicht in organischen Lösungsmitteln geliefert werden, suspendieren Sie 0,3 Milligramm Lipide in Chloroform oder Cycloheane bei 10 Milligramm pro Milliliter. Beachten Sie, dass die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen in der Regel nur nominal sind.

Verwenden Sie Ethanol, um beide Seiten von 2 25 Millimeter x 37,5 Millimeter ITO-beschichteten Glasobjektträgern zu reinigen. Fügen Sie dann 0,1 weitere Prozent Texas Red DPPE zu den Lipiden für die Fluoreszenzbildgebung hinzu. Messen Sie den Oberflächenwiderstand mit einem Multimeter, um zu überprüfen, ob die ITO-beschichtete Seite der Objektträger nach oben zeigt, was durch einen Widerstand von einigen hundert Ohm angezeigt wird.

Aspirieren Sie die Lipide in eine lösungsmittelbeständige Spritze, wobei die Spritzennadel die ITO-Oberfläche nicht vollständig berührt. Tragen Sie das Lipid langsam auf, indem Sie die Nadel über den Objektträger hin und her bewegen. Decken Sie die Oberfläche gleichmäßig ab und achten Sie auf einen Regenbogenglanz auf der Glasoberfläche.

Anschließend werden die Objektträger schnell in ein Vakuum gebracht, getrocknet und die Kammer 0,5 bis eine Stunde lang auf weniger als ein Tor Vakuum gepumpt. Um alle Spuren von Lösungsmitteln zu entfernen. Lassen Sie das Vakuum mit Inertgas ab.

Tragen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf beide Seiten einer Silikondichtung auf und legen Sie dann die Dichtung auf den Schieber. Lassen Sie mindestens fünf Millimeter des unbedeckten Objektträgers an einem Ende des Objektträgers frei. Hydratisieren Sie anschließend jede Vertiefung sorgfältig, indem Sie eine 27-Gauge-Spritzennadel an den Rand der Dichtung legen und langsam einen Puffer auftragen, der jede Dichtungsvertiefung um ca. 10 % mit drei Millimolaren Häufchen überfüllt.

Sobald die Lipide hydratisiert sind, fahren Sie schnell mit den verbleibenden Schritten fort. Da Lipidfilme zu delaminieren beginnen, überprüfen Sie sofort die leitfähige Seite des Objektträgers mit dem Multimeter. Bringen Sie dann die zweite leitfähige ITO-Gleitfläche auf die Oberseite der Dichtung an.

Achten Sie darauf, dass mindestens fünf Millimeter Überstand außerhalb des Dichtungsbereichs und gegenüber dem ersten Überhang vorhanden sind, und drücken Sie vorsichtig, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. Reinigen Sie die beiden Überhänge mit Ethanol. Befestigen Sie nun das ITO-Schiebesandwich an elektrischen Kontakten wie Kupferstangen oder Dichtungsschaum.

Diese Grafik zeigt eine Explosionszeichnung der Kammer und der Kontaktbaugruppe als Referenz. Detaillierte Pläne finden Sie im Textprotokoll mit Hilfe eines Multimeters. Stellen Sie sicher, dass zwischen den Kontakten kein elektrischer Kurzschluss vorhanden ist und dass die Kontakte ordnungsgemäß mit den ITO-Oberflächen verbunden sind.

Stellen Sie anschließend die Elektrobildungskammer in einen Ofen und erhitzen Sie die Kammer um 10 Grad Celsius über der höchsten Schmelztemperatur aller vorhandenen Lipide. Messen Sie den Spalt zwischen den beiden ITO-beschichteten Oberflächen, um die Amplitude der Sinuswelle zu bestimmen. Die Amplitude der Sinuswelle sollte ungefähr 0,7 Volt RMS betragen. Für jeden Millimeterspalt zwischen den ITO-Oberflächen wird eine Sinuswelle von 10 Hertz für 60 bis 90 Minuten angelegt.

Schließen Sie den Generator an die Elektroformierkammer an und bestätigen Sie die Spannung mit einem Multimeter. Nach 60 bis 90 Minuten Elektrobildung sollten sich riesige unale Vesikel gebildet haben. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem Filterwürfel für texanischen roten Farbstoff ausgestattet ist, um die Liposomen abzubilden.

Das Liposom sollte kugelförmig sein, überwiegend Ella mit dem Auge und frei von Defekten wie Fäden, die vom Liposom hängen. In den vorangegangenen Schritten ging es um die klassische Herstellung von Riesenliposomen aus reinen Lipiden. Es wird eine anspruchsvollere Zubereitung mit kleinen Liposomen gezeigt.

Bereiten Sie zunächst eine gesättigte Kaliumcarbonatlösung mit 44% relativer Luftfeuchtigkeit bei 20 Grad Celsius vor. Verwende einen Joghurt- und Müslibehälter aus Plastik mit einem verschachtelten oberen Becher, der mit Löchern im oberen Becher modifiziert wurde. Geben Sie die gesättigte Salzlösung und das überschüssige Salz in einen dicht verschließbaren Behälter mit einem Innenregal.

Setzen Sie die Ablage nach dem Befüllen wieder auf und stellen Sie sicher, dass sich die Flüssigkeit fünf bis 10 Millimeter unter der Ablage befindet. Platzieren Sie einen Feuchtigkeitssensor in einer Kerbe an der Seite des Behälters. Reinigen Sie beide Seiten von ITO-beschichteten Objektträgern mit Ethanol.

Verwenden Sie das Multimeter, um zu bestimmen, welche Seite leitfähig ist, und beschriften Sie die nicht leitende Seite mit dem Namen der Probe. Fetten Sie anschließend beide Seiten einer Silikondichtung mit einem oder mehreren Griffen leicht ein. Legen Sie das leitfähige Objektträger nach oben auf die Bank und bringen Sie die Silikondichtungen auf jedem Objektträger an, auf den das Lipid aufgetragen wird.

Stellen Sie sicher, dass an einem Ende mindestens fünf Millimeter Schlitten vorhanden sind, um ihn an die Elektroformungsvorrichtung anzuschließen. Glätten Sie die Dichtung, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten, und verdünnen Sie die Vesikelvorbereitung in dem salzarmen isomodischen Puffer auf etwa ein bis zwei Milligramm pro Milliliter. Tragen Sie das Lipid in einem bis 10 Mikroliter Tropfen auf den Objektträger auf.

Platzieren Sie den Objektträger auf dem Innenregal über der gesättigten Salzlösung und verschließen Sie den Behälter fest. Drei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur ruhen lassen. Der Objektträger kann nun für die Elektrobildung von Riesenliposomen verwendet werden, wie zuvor im klassischen Protokoll gezeigt

Beachten Sie das Regenbogen-Aussehen der einzelnen Einzahlungen. Dieses Bild zeigt Liposomen, die aus Lipiden gebildet werden, die aus Chloroform abgeschieden werden, die Pfeile zeigen auf riesige Liposomen. Dieses Bild hat nur sehr wenige unscharfe Bereiche und deutet somit auf eine gute Vorbereitung hin.

Das nächste Bild hat viele unscharfe Bereiche und deutet daher auf eine allgemein schlechte Vorbereitung hin. Beachten Sie, dass Pfeil zwei eine Region mit schlecht unterscheidbaren Liposomen anzeigt und dass in dem durch Pfeil drei angezeigten Bereich keine Liposomen in den Fokus gebracht werden können. Hier ist eine 10-fache Vergrößerung von Liposomen zu sehen, die erfolgreich aus Lipiden elektrogebildet wurden, die durch Dehydratisierung kleiner Liposomen abgelagert wurden.

Die Pfeile zeigen drei hochwertige Liposomen mit einer Größe von etwa fünf bis 20 Mikrometern bei 40-facher Vergrößerung. Am Rand des Liposoms ist ein klarer Ring zu sehen, der auf ein uni- oder fast lumales Liposom hinweist. Die Capsaicin-aktivierten TR PV one Ionenströme, die in Lipidmembran-Patches aufgezeichnet wurden, die aus den gebildeten Riesenliposomen herausgeschnitten wurden, sind hier abgebildet.

Der Leckstrom zeigte eine Dichtheitsbeständigkeit von 500 Mega an, bevor Capsaicin zugesetzt wurde. Sättigendes Capsaicin aktivierte einen großen T RRP V einen Strom. Die aktuelle Rückkehr in die Nähe des Ausgangswerts, da Capsaicin während des Versuchs dieses Verfahrens aus dem Pflaster ausgewaschen wird.

Es ist wichtig, flexibel zu bleiben, da viele Faktoren beeinflussen, wie die Lipide austrocknen und einen gleichmäßigen Film auf dem Glassubstrat bilden. Konsultieren Sie unseren Online-Abschnitt zur Fehlerbehebung und variieren Sie Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Lipidkonzentration und Tröpfchengröße, um die besten Ergebnisse zu erzielen.