Name: Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Lernen Sie die Herstellung stabiler Riesen-Liposomen für Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Imaging. Diese Methode bewahrt die funktionelle Integrität von Membranproteinen und ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Ionenkanäle.

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Wir danken Bryan Venema und Eric Martinson für den Bau des Elektroformation Gerät. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of General Medical Sciences der National Institutes of Health (R01GM100718 zu SEG) und der National Eye Institute der National Institutes of Health (R01EY017564 zu SEG) finanziert.

1. Ablagerung von Lipiden aus organischen Lösungsmitteln: Klassische Protocol <ol><li> Entfernen von Lipiden aus der Lagerung bei -20 ° C oder -80 ° C, auf RT erwärmt. Achtung: Lipide sind extrem hygroskopisch, und viele sind empfindlich gegenüber Sauerstoff. Titelbild Lipide in trockenem Argon oder Stickstoff und in allen Schritten Minimierung der Exposition gegenüber Luft. </li><li> Wenn erforderlich, zur Aussetzung der Lipide in Chloroform oder Cyclohexan bei 1-10 mg / ml; beachten Sie, dass vom Hersteller angegebenen Konzentrationen in der Regel sind nur nominal ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Handschuhe und andere persönliche Schutzausrüstung bei der Verwendung von organischen Lösungsmitteln.. Entfernen Sie die PPE schnell, wenn Lösungsmittel auf sie verschüttet wird, da die meisten Materialien noch durchlässig für diesen Lösungsmitteln und sie nur vorübergehenden Schutz. </li><li> Reinigen Sie beide Seiten von zwei 25 x 37,5 mm ITO beschichteten Glasplatten mit Ethanol </li><li> Mischen Sie die Lipide, um die gewünschten molaren Verhältnisse zu erreichen. Für jede 1 cm 2 der Fläche der ITO gleitet, um mit der Lippe beschichtet werdenid, mix ~ 15-20 ug Lipiden. Zum Beispiel, wenn beide 25 x 37,5 mm-Dias waren sein komplett beschichtet, würden wir verwenden in der Regel 30 ul 10 mg / ml Lipid-Mischung. Hinweis: mit 0,1 mol% Texas Red-Fluoreszenz-Bildgebung für DPPE, und siehe unten warnt vor Fluoreszenzfarbstoffe. </li><li> Überprüfen Sie, dass die ITO-beschichtete Seite der Glasscheiben nach oben durch die Messung der Oberfläche Widerstand mit einem Ohmmeter oder Multimeter. </li><li> Saugen Sie die Lipide in einem Lösungsmittel-resistent Spritze. Vorsicht: Keine Leime oder Kunststoff versehen, andere als PTFE, wenden sich bitte an das organische Lösungsmittel. </li><li> Mit der Spritze Nadel nicht ganz berühren die ITO-Oberfläche, langsam gelten die Lipid-Bewegen der Nadel hin und her über die Folie. Bedecken Sie die Oberfläche so gleichmäßig, auf der Suche nach einem &quot;Regenbogen Glanz&quot; auf der Glasoberfläche. </li><li> Legen Sie die Folien schnell unter &lt;1 Torr (1 mmHg) Vakuum für 0,5-1 Stunden zu entfernen jede Spur Lösungsmittel. Lassen Vakuum mit Edelgas. </li><li> Tragen Sie eine Silikon-Dichtung, mit einemdünne Schicht aus Silikon Vakuumfett auf beiden Seiten. Lassen Sie mindestens 5 mm von ungedeckten Rutsche an einem Ende des Schlittens ausgesetzt. </li><li> Fahren Sie direkt mit Abschnitt 4. </li></ol> 2. Kleine Liposomen-Herstellung für Controlled Dehydration <ol><li> Bereiten Sie die Lipid-Mischung wie in den Schritten 1.1 bis 1.4. </li><li> Trocknen Sie die Lipide mit einem Strom von Argon oder Stickstoff in einem 10-15 mm Durchmesser Kultur Rohr. Für kleine Mengen Lipide, ≤ 0,5 mg, kann die resultierende Folie unmittelbar, nachdem man sie unter Vakuum für 0,5-1 Stunden, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen hydratisiert ist, weiter mit Schritt 2.5. Größere Mengen an Lipid neigen dazu, organische Lösungsmittel in einer dicken Gel abzufangen, auch unter Vakuum und sind besser durch Gefriertrocknung hergestellt; siehe Schritte 2.3-4. </li><li> Hängen Sie das getrocknete Lipid-Film in Cyclohexan, Deckel mit Argon und Dichtung mit einem Anschlag, den Schlauch in einem kalten Block und frieren bei -80 ° C für 1 Stunde Minimum. </li><li> Setzen Sie den kalten Block-und Lipid-Probe in einem Vakuumsystemder Lage zu erreichen 100mTorr. Gib Vakuum, es wird &quot;Stall&quot; bei etwa 1 Torr sublimiert als Lösungsmittel aus. Sobald Lösungsmittel wird vollständig entfernt (ca. 1 Stunde) Vakuum wird unter dieses Niveau fallen. Lösen Vakuum mit Inertgas und das Rohr abzudichten oder Hydrat sofort. </li><li> Während die Lipide unter Vakuum sind, mit Degas Flüssigkeitszufuhr Puffer Vakuum und Begasung 15-17. </li><li> Hydrate die Lipide mit entgastem Puffer bei Endkonzentration 1-10 mg / ml. Erlauben die Lipide zu Hydrat langsam. Nach 30 min-1 Std., Vortex aufzubrechen verbleibenden Klumpen. Warten Sie eine zusätzliche 0,5-1 h bis zur vollständigen Hydratation ermöglichen. Verwenden eines osmoticant, wie Sorbit oder Saccharose bis zu 200 mM, die vollständige Austrocknung in Schritten zu verhindern. </li><li> Bereiten 100-200 nm Durchmesser Liposomen durch Extrusion. Siehe Herstellerangaben Extrusion Protokoll für Details. Beachten Sie, dass der Puffer muss weniger als ~ 25 mM Ionenstärke oder spezielle Elektroformation Spannung Protokolle in Abschnitt 4 benötigt werden. </li></ol> 3.Ablagerung von Lipiden durch geregelte Dehydratisierung von Kleine Liposomen <ol><li> Achtung: Unser Protokoll erfordert Lipide in Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen für viele Stunden abgegeben werden. Wir empfehlen dringend, die Durchführung des Protokolls in einer Inertgas-Atmosphäre, mit einem Handschuhfach oder ähnliche Gehäuse. </li><li> Achtung: Bei der Herstellung von Proben, die Proteine, die vollständige Austrocknung zu vermeiden. Hydrate die Atmosphäre in einem geschlossenen Raum mit einem Becher mit warmem Wasser oder ein Ultraschallgerät basierte Luftbefeuchter. Verwenden Sie ein Hygrometer, um sicherzustellen, dass es mindestens 30% relativer Luftfeuchtigkeit. Verwenden Sorbit oder Saccharose in dem kleinen Liposomen-Puffer als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um insgesamt Austrocknung zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie eine gesättigte Salzlösung geeigneter relativer Luftfeuchtigkeit. Soll-Luftfeuchtigkeit abhängig von der Osmolarität der Vesikelherstellung. Für Zubereitungen, die mit physiologischen Osmolarität, verwenden 30-45% RH, während niedrige Osmolarität Vesikelpräparationen kann ausreichend entwässertGleichgewicht mit 75-90% RH (siehe auch Tabelle 1). </li><li> Legen Sie die gesättigte Salzlösung und überschüssige Salz in einem dicht verschließbaren Behälter mit einer inneren Regal. Gewerbe Lebensmittel Behälter für Joghurt und Müsli Arbeit sehr gut. Ersetzen Sie das Regal nach dem Befüllen, und stellen Sie sicher Fluid 5-10 mm unter dem Regal. </li><li> Saubere ITO beschichtete Objektträger, wie in Abschnitt 1. Verwenden Sie das Multimeter, um zu bestimmen, welche Seite leitend ist, und beschriften Sie die nicht-leitenden Seite mit dem Sample-Namen. </li><li> Fetten Sie beide Seiten des Silikons (USP Klasse VI) Dichtung (en) mit einem oder mehreren Löchern. </li><li> Legen Sie die Folien leitfähigen Seite nach oben auf der Bank, und wenden Sie die Silikon-Dichtung (en) zu jeder Folie, auf die Lipid angewendet werden, um sicherzustellen, gibt es mindestens 5 mm der Schieber an einem Ende mit dem Gerät verbinden Elektroformation. Glätten Sie die Dichtung, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Verdünnen Sie die Vesikelherstellung in eine salzarme isosmotischen Puffer auf ~ 1-2 mg / ml. Wir finden, dass eine höhere konzentrtionen zu schlechten Ergebnissen. </li><li> Bewerben Lipid mit dem Schlitten in 1-10 ul Tropfen. Kleinere Tropfen erzeugen im Allgemeinen bessere Ergebnisse. </li><li> Legen Sie die Folie auf der Innenseite Regal über der gesättigten Salzlösung und verschließen Sie den Behälter fest. Lassen Sie bei RT für 3 h auf O / N. Der Behälter kann bei 4 ° C gebracht werden, aber beachten Sie, dass für einige Salze, die RH hängt stark von der Temperatur und dem kalten wird Gleichgewichtszeit erhöhen. </li><li> Der resultierende Film kann eine leichte Regenbogen Glanz, aber in jedem Fall sollte erscheinen fast ausgetrocknet. Sehr osmotischen Eduktlösungen kann unmöglich vollständig trocknen zu einer Lipid-Film, das keinen nachteiligen Einfluss auf die Ergebnisse. </li></ol> 4. Elektroformation von Riesenliposomen <ol><li> Lipidfilme, insbesondere solche aus dehydratisierten Liposomen gebildet werden, lösen sich leicht. Vorsichtig Hydrat jeder Vertiefung, indem eine 27 G Nadel Spritze am Rand der Dichtung und langsam Aufbringen Puffer. Puffer könnensind Wasser, ≤ 200 mM Saccharose, ≤ 1 M Sorbit und ≤ 5 mM HEPES. Mehr als 10 mM Salzlösung kann verlangen alternate Elektroformation Spannung Protokolle. Überfüllsicherung jede Dichtung gut ~ 10%. </li><li> Hinweis: Sobald die Lipide sind hydratisiert, gehen schnell durch die verbleibenden Schritte, da Lipidfilmen sofort ablösen beginnen. Ertrag und Größe werden maximiert, wenn Elektroformation beginnt umgehend. </li><li> In einer fließenden Bewegung, anwenden eine zweite ITO Rutsche, leitende Gesicht, an die Spitze der Dichtung. Achten Sie darauf, mindestens 5 mm Überhang außerhalb der Dichtung an und gegenüber dem ersten Überhang haben. Drücken Sie vorsichtig, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> Reinigen Sie die zwei Überhänge mit Ethanol und sicherstellen, dass die Dichtung zugewandten Seiten mit Ihrem leitenden Multimeter sind. </li><li> Die Kammer kann weiter mit Parafilm oder Licht Zugfeder Clips gesichert werden, falls gewünscht. </li><li> Schließen Sie das Elektroformation Kammer mit einer Spannungsquelle durch die Sicherung Aluminium oder Kupfer Bars, &quot;EMI gasket Schaum &quot;oder leitenden Klebeband an den leitenden Oberflächen der beiden Rutschen. Wir verwenden EMI-Dichtung Schaum. Pläne für eine Spannvorrichtung und Klemme sind in Abbildung 5 dargestellt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es keinen elektrischen Kurzschluss zwischen den Kontakten, und dass die Kontakte verbinden richtig auf die ITO Oberflächen, mit dem Multimeter. </li><li> Erhitzen der Kammer 10 ° C oberhalb der höchsten Schmelztemperatur des einen der Lipide, z. B. für DPPC, Wärme auf 52 ° C mindestens 10 ° C über der Kette Schmelztemperatur von 42 ° C. </li><li> Für salzarme Puffer, gelten eine 10 Hz Sinus, ~ 0,7 V rms für jeden Millimeter Abstand zwischen den beiden ITO beschichteten Oberflächen, für 60-90 min. Für Hochsalzpuffern sollten andere Spannung Protokolle verwendet (siehe Referenzen) werden. </li></ol> 5. Imaging und Fehlerbehebung <ol><li> Bild der Liposomen mit einem inversen Mikroskop mit einem Filter Cube für Rhodamin oder Texas Red Farbstoffe ausgestattet. Das Liposom muss kugelförmig,überwiegend unilamellar von Auge und frei von Defekten wie &quot;strings&quot; hängen von der Liposomen. </li><li> Wenn die Liposomen zu klein sind, verbrauchen weniger Lipid. </li><li> Wenn es viele Mängel oder einige Liposomen sind, kann dies darauf zurückzuführen sein, Gelphase Lipiden. Betrachten wir die Erhöhung der Temperatur Elektroformation. </li><li> Wenn wenige oder keine riesigen Liposomen überhaupt aus dehydriert kleine Liposomen, reduzieren den osmotischen Stärke der Liposomen-Puffer, oder erhöhen Sie die Stärke des osmotischen Elektroformation Puffer. Ein Einbruch von Puffer in die konzentrierte interstitielle Pufferlösung kann Ablösung des abgeschiedenen Lipid-Film. </li><li> Wenn Vesikel Ertrag, Qualität oder Größe ist schlecht, und Sie enthalten Salze oder pH-Puffer in den Elektroformation oder Liposomen Puffer, sollten alternative Elektroformation Spannung Protokolle. Zum Beispiel, Pott, et al. 11, empfehlen eine dreistufige Protokoll mit einem 500 Hz Sinus, die Erhöhung der Spannung von 50-1,300 Vpp / m in 30 min, halten für 90 min, dien Verringerung der Frequenz 50 Hz über 30-60 min. Platin oder Titan-Elektroden kann in diesem Fall nicht benötigt werden, aber dies wird nicht wesentlich verändert das Protokoll. </li></ol>

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<li>Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+electroformation+of+supergiant+unilamellar+vesicles+containing+cationic+lipids+on+ITO-coated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes.</a> Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Elektroformation riesiger Liposomen wurde in eine flexible Technik kompatibel mit verschiedenen Lipiden, Zubereitungen und Puffer entwickelt. Eine sorgfältige Steuerung der Lipidablagerung-Verfahren ist sehr entscheidend für den Erfolg. Wir haben einfache Werkzeuge vorgestellt, um eine kontrollierte Abscheidung von Lipiden aus kleinen Liposomenzubereitungen ein einfacher Prozess zu machen. Die relative Feuchtigkeit ist für die einwandfreie Entwässerung der ersten Liposomen, und der optimale Wert wird mit der anfängliche...

Riesen-Liposomen (oft als Riese einschichtigen Vesikeln oder GUVs) wurden in erster Linie verwendet, um die Physik und der physikalischen Chemie von Lipid-Doppelschichten, einschließlich Studien der Doppelschicht Verformung, seitliche Phase Koexistenz (&quot;Rafts&quot;), Membran-Fusion, etc 1-4 studieren. Sie haben einen grob Zell-Struktur: Kugelschale Membran umgibt einen wässrigen Innenraum, die leicht gemacht werden, anders als die umgebenden wässrigen Puffer werden. Sie sind per definitionem ≈ 1-100 &amp;mgr; m im Durchmesser, so dass sie abgebildet mit einer Vielzahl von Lichtmikroskopie Ansätze werden. Sie können gestrafft durch osmotischen Gradienten oder mechanisch angelegte Spannung ist, so daß, während in der Regel weich, deren Eigenschaften für die einfache Handhabung kann manipuliert werden. Insbesondere die Steuerung der &quot;Steifigkeit&quot; der Liposomen macht es einfach, &quot;Liposomen-attached&quot; oder ausgeschnitten Patches für die Elektrophysiologie zu bilden. In der Vergangenheit wurde Ionenkanal Rekonstitution weitgehend planaren Lipid b durchgeführtilayers. Jetzt macht die Fähigkeit, Patches von riesigen Liposomen zu bilden und nutzen die erheblichen Köcher von Werkzeugen für herkömmliche Elektrophysiologie entwickelt (Fluoreszenzmikroskopie Mikropipette Aspiration, schnelle Perfusion und Temperaturregelung, etc.) Riesenliposomen immer attraktiver für die Rekonstitution Studien 5,6. Riesen-Liposomen wurden von vielen Strategien vorgenommen. In der Tat bilden Riesenliposomen spontan durch eine Schwellung Prozess, wenn eine getrocknete Lipid-Film 4,7,8 rehydriert wird. Der Wunsch, schneller vorzubereiten größeren führte gleichmäßigere Liposomen Forscher zu anderen Ansätzen, Leiter unter ihnen Elektroformation 1,9. Elektroformation stützt sich auch bei der Hydratisierung eines getrockneten Lipidfilm, sondern beschleunigt das Verfahren durch die Anwendung eines oszillierenden elektrischen Feldes an die Lipid-Film. Das Feld wird durch zwei Elektroden, entweder Platindrähte oder Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glasträger aufgebracht, getrennt durch Wasser oderPuffer und auf die die Lipide werden abgeschieden. Durch die Beschleunigung der Schwellung von Liposomen erreicht man eine höhere Ausbeute an größeren Liposomen. So hat Elektroformation werden die Standardmethode zur Erzeugung Riesenliposomen 4. Der Mechanismus der Elektroformation ist nicht vollständig geklärt, und die meisten Protokolle werden empirisch (zB 10,11) entwickelt. Dennoch können wir lernen, ein wenig über das, was unter Berücksichtigung der Theorie und einige empirische Ergebnisse zu erwarten. Es wird allgemein angenommen, dass Elektroformation indem elektro-osmotischen Fluss des Puffers zwischen einzelnen Lipid-Doppelschichten in der abgeschiedenen Lipidfilm 10,11 gestapelt auftritt. Elektrostatische Kupplung Wärmewechselbeständigkeit der Lipid-Doppelschichten ist wahrscheinlich auch beteiligt 12. Diese Hypothesen qualitativ vorherzusagen Obergrenzen für das elektrische Feld der Häufigkeit und Stärke, die 10,12 verwendet werden kann. Insbesondere ist es, dass eine hohe Leitfähigkeit Lösungen vorhergesagt ( <em&gt; dh physiologischen Salzlösungen) reduzieren die elektrohydrodynamische Kräfte, initiieren das Liposom Elektroformation 12. Mai. Elektroosmotischer Strömungsgeschwindigkeiten in der Regel mit steigender Salzkonzentration zu verringern und werden häufig zu einem bestimmten elektrischen Feldes Schwingungsfrequenz (zB wenn auch in einer anderen Geometrie, Green et al. 13) ihren Höhepunkt. Somit sind höhere Feldstärken und höhere Frequenzen für hohe Leitfähigkeit Lösungen vernünftig, innerhalb der Grenzen 10. Allerdings sind Membranproteine ​​wahrscheinlich mit dem üblichen Verfahren zum Abscheiden Lipide auf Elektroden für die Electroswelling Verfahren, nämlich in organischen Lösungsmitteln, die anschließend an einen dünnen Lipidfilm zu hinterlassen eingedampft unvereinbar. Es gibt zwei grundsätzliche Wege um diese Schwierigkeit: an Proteine ​​nach giant Liposombildung enthalten oder anzupassen, wie die Lipide abgeschieden werden. Unser Ansatz baut auf andere 5,11 die Lipide und Rekonstitution hinterlegentuierten Membranprotein zusammen aus einer Suspension von kleinen oder großen &quot;Proteoliposomen&quot;. Wir beschreiben die langwierige und schwieriger Prozess der Herstellung von Proteoliposomen gereinigtes Protein und Lipiden an anderer Stelle (Collins und Gordon, in review). Hier beschreiben wir das Protokoll in Ermangelung einer Protein, aber es ist das gleiche, wenn Protein eingebaut wird, wir zählen die Ergebnisse zeigen, dass Proteoliposomen mit dem Ionenkanal TRPV1 in GUVs umgewandelt werden kann und für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie. In jedem Elektroformation Ansatz, ist die visuelle Inspektion der Lipid-Probe während der Lipidablagerung Prozess entscheidend für den Erfolg. Unser Ansatz relevant sein können über die spezielle Anwendung zu Ionenkanal Rekonstitution. In der Zeit, da wir zuerst dieses Protokoll entwickelt und jetzt, es hat sich auch gezeigt, wie die Art und Weise, in der Lipide auf Elektroden für Elektroformation abgelagert werden die kompositorische Heterogenität der resultierenden GUVs betrifft. Baykal-Caglar et al. zeigten, dass 14 GUVs aus sorgfältig entwässert gebildeten Liposomen eine 2,5 mal kleiner Variation hatte in der Mischungslücke Sprungtemperatur von GUVs aus Mischungen verschiedener Phospholipide und Cholesterin gebildet. Die Arbeit zeigt, dass Lipide und insbesondere Cholesterin, ausfallen kann aus dem Lipidgemisch wenn aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht, was zu großen räumlichen Abweichung in der Zusammensetzung der abgeschiedenen Lipidfilm. Dies ist besonders wichtig für die Untersuchung der Lipid-Membran Phasenverhalten, kann aber auch kritisch für quantitative Experimente Ionenkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. &#39;S Protokoll ist ähnlich, aber nicht identisch mit unserer eigenen, und die Leser werden ermutigt, es so gut zu studieren. Dieses Protokoll (siehe Übersicht, Abbildung 1) ist eine von vielen, die genutzt werden könnten. Im Prinzip Elektroformation Erfolg hängt von der Lipid-Mischung, Flüssigkeitszufuhr, Temperatur, andere gelöste Stoffe (vor allem Ionen), und derNatürlich ist die Spannung und Frequenz in Bildung eingesetzt. Wie Elektroformation wird besser verstanden, erwarten wir unser Protokoll mehr zu suchen. Schließlich gibt es oft eine steile Lernkurve in Galvanotechnik Riese Liposomen. Wir schlagen vor, die Beherrschung der herkömmlichen Protokoll (§ § 1 und 4, und, falls erforderlich, Abschnitt 5) vor dem Lernen zu Lipiden aus liposomalen Suspensionen (§ § 2-5) zu hinterlegen.

<table><tbody><tr><td>Digitales Multimeter</td><td>Agilent Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>U1232A oder ähnlich</td><td>Jedes Multimeter ist geeignet, aber vermeiden Sie analoge Ohmmeter im alten Stil, die viel mehr Strom an den zu prüfenden Widerstand anlegen.</td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>117 oder 177</td><td>Jedes Multimeter ist geeignet, aber vermeiden Sie analoge Ohmmeter alter Bauart, die viel mehr Strom auf den zu prüfenden Widerstand anlegen.</td></tr><tr><td>Funktionsgenerator Agilent</td><td>Technologies, <a href="http://www.agilent.com" target="_blank">www.agilent.com</a></td><td>33210A oder ähnlich</td> Die <td>meisten Funktionsgeneratoren arbeiten für einfache Protokolle. Dieses programmierbare Modell ist nützlich für fortgeschrittene Elektroformationsprotokolle. Stellen Sie sicher, dass der Generator 10 V Spitze-Spitze in einen 50 &#937 treiben kann; Laden Sie</td></tr><tr><td>ITO beschichtete Glasobjektträger</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO <a href="http://www.delta-technologies.com" target="_blank">www.delta-technologies.com</a></td><td>CB-90IN-S107 oder ähnlich</td><td>Brechen Sie diese in zwei Hälften, um zwei Objektträger herzustellen, 25 mm x 37 mm</td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Omega Engineering Stamford, CT <a href="http://www.omega.com" target="_blank">www.omega.com</a> </td><td>CNi3233 oder ähnlich</td><td></td></tr><tr><td>Hygrometer</td><td>Extech, Nashua, NH, <a href="http://www.extech.com" target="_blank">www.extech.com</a></td><td>445815</td><td></td></tr><tr><td>Silikonkautschukplatte</td><td>McMaster-Carr Elmhurst, IL <a href="http://www.mcmaster.com" target="_blank">www.mcmaster.com</a></td><td><a href="http://www.mcmaster.com/#87315K64" target="_blank">87315K64</a></td><td>Verwendung von USP Grade VI Silikon für seine hochreine</td></tr><tr><td>EMI-Dichtung</td><td>Laird Technologies <a href="http://www.lairdtech.com" target="_blank">www.lairdtech.com</a></td><td>4202-PA-51H-01800 oder ähnlich</td><td>Vertrieb durch Mouser <a href="http:// www.mouser.com" target="_blank">www.mouser.com</a></td></tr><tr><td>TxR-DHPE</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA <a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank">www.lifetechnologies.com</a></td><td>T1395MP</td><td>Andere fluoreszenzmarkierte Lipide sind verfügbar, aber TxR-DHPE ist eines der hellsten und photostabilsten.</td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipide, Alabaster, AL <a href="http://www.avantilipids.com" target="_blank">www.avantilipids.com</a></td><td>850457P oder 850457C</td><td>Lipide können als Pulver (P) oder in Chloroform (C)</td></tr><tr><td>POPS</td> bestellt <td>werden Avanti Polar Lipide</td><td>840034P/C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr></tbody></table>

riesen-liposomen-herstellung für imaging und patch-clamp-elektrophysiologie

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Die Rekonstitution von Ionenkanälen in chemisch definierten Lipidmembranen für elektrophysiologische Aufzeichnung wurde eine leistungsfähige Technik zu identifizieren und erkunden Sie die Funktion dieser wichtigen Proteinen. Jedoch begrenzen klassischen Zubereitungen, wie planare Doppelschichten, die Manipulationen und Experimente, die auf dem rekonstituierten Kanal und seine Membran Umgebung ausgeführt werden können. Je mehr Zellen Struktur von Riesenliposomen ermöglicht traditionelle Patch-Clamp-Experimente ohne Steuerung des Lipidumgebung. Elektroformation ist ein effizientes Mittel zur Erzeugung Riesenliposomen&gt; 10 um im Durchmesser, die auf der Anwendung von Wechselspannung in eine dünne, geordnete Lipid Film, der auf einer Elektrodenoberfläche beruht. Da jedoch die klassische Protokoll fordert der Lipide aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht werden, ist es nicht mit weniger robust Membranproteine ​​wie Ionenkanäle und modifiziert werden muss. Kürzlich protocols wurden entwickelt, um Riesenliposomen von partiell dehydratisierten kleinen Liposomen, die wir Protein-haltigen Liposomen in unserem Labor angepasst haben Elektroform. Wir stellen Ihnen hier den Hintergrund, Ausrüstung, Techniken und Fallstricke Elektroformation riesiger Liposomen aus kleinen Liposomendispersionen. Wir beginnen mit dem klassischen Protokoll, das erste sollte, bevor die größere Herausforderung Protokolle, die gemeistert werden folgen. Wir zeigen den Prozess der kontrollierten teilweisen Wasserentzug aus kleinen Liposomen mit Dampf-Gleichgewicht mit gesättigten Salzlösungen. Schließlich zeigen wir den Prozess der Elektroformation sich. Wir beschreiben einfache, kostengünstige Geräte, die in-house gemacht werden können, um qualitativ hochwertige Liposomen zu produzieren, und beschreiben Sichtprüfung der Vorbereitung auf jeder Stufe, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

In unseren Beispielen bereiten wir Liposomen aus einem Gemisch von etwa 55 Mol-% POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% erscheint (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserin , 30 mol% Cholesterin und 0,1 mol% Texas Red-markierten 1,2-dipalmitoyl-sn-Phosphoethanolamin (TxR-DPPE). Diese Zusammensetzung wie etwa Vertreter der Spinalganglien Lipide 18 gewählt wurde. Wir bemerken, dass 15 mol% geladen Lipid (hier POPS) ist in der Nähe der Grenze dessen, was in El...

Reconstituting funktionellen Membranproteinen in riesige Liposomen definierter Zusammensetzung ist ein leistungsfähiges Konzept, wenn es mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie kombiniert. Dagegen dürfen herkömmliche Riese Liposomen Produktion unvereinbar mit Proteinstabilität. Wir beschreiben Protokolle zur Herstellung Riese Liposomen aus reinem Lipide oder kleine Liposomen, die Ionenkanäle.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, riesige einlamellare Vesikel in einer Weise herzustellen, die mit der funktionalen Integrität von in die Vesikelmembran eingebauten Membranproteinen vereinbar ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Lipide oder kleine Liposomen auf eine leitfähige Oberfläche, beispielsweise einen mit ITO beschichteten Glasobjektträger, aufgetragen werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Lösungsmittel kontrolliert zu verdampfen, um einen gleichmäßigen Lipidfilm auf der leitfähigen Oberfläche zu erhalten.Als Nächstes hydratisieren Sie den Lipidfilm vorsichtig in einem geeigneten Puffer und bereiten die Elektroformationskammer vor. Im letzten Schritt wird eine oszillierende Spannung über den Lipidfilm angelegt, um riesige unilamelläre Vesikel zu erzeugen. Schließlich werden die Vesikel abgebildet, um ihre Größe und Qualität zu bestimmen und mit Vesikeln zu vergleichen, die mithilfe einer klassischen Technik hergestellt wurden.Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist hilfreich, da die Ablagerung von Lipiden schwierig zu beherrschen ist, von vielen Variablen abhängt und am besten durch visuelle Inspektion beurteilt werden kann. Vor Be

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Visualisierung der Bildung der immunologischen Synapse in natürlichen Killerzellen (NK) auf einer gestützten Lipiddoppelschicht (SLB). Der SLB wird zunächst mit einem Fluorophor-markierten NK-Zell-aktivierenden Rezeptorliganden markiert, gefolgt von der Inkubation mit NK-Zellen. Anschließend werden die Zellen mit polymerisiertem Aktin und Perforin-positiven lytischen Granulaten angefärbt. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Synapsenbildung...

Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

Die Verwendung von Fluorophoren für die In-vivo-Bildgebung kann durch Opsonisierung, schnelle Clearance, geringe Nachweisempfindlichkeit und zytotoxische Effekte auf den Wirt stark eingeschränkt werden. Die Verkapselung von Fluorophoren in Liposomen durch Filmhydratation und Extrusion führt zu einer Fluoreszenzlöschung und einem Schutz, der eine in vivo-Bildgebung mit hoher Nachweisempfindlichkeit ermöglicht.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur In-vivo- Optical Imaging

Elektroformation, und Gel-unterstützte Schwellung - Die Wiederherstellung der Transmembranprotein, KvAP, in riesige unilamellare Vesikel (GUVs) ist für zwei Dehydration-Rehydrierung Methoden nachgewiesen. In beiden Verfahren werden kleine unilamellare Vesikel, die das Protein enthält, zusammengeschmolzen, um GUVs die dann durch Fluoreszenzmikroskopie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht werden können zu bilden.

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur ortsgerichteten Spinmarkierung und Rekonstitution von pentameren ligandengesteuerten Kanälen für Elektronen-Paramagnetische Resonanzstudien. Dieses Protokoll kann für jedes Membranprotein angepasst werden. Die hier beschriebene Rekonstitutionsmethode kann auch für Patch-Clamp-Messungen von makroskopischen und einkanaligen Strömen in einem definierten Lipidsystem verwendet werden.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Liposomen mit Single-Kette amphiphilen, weisen insbesondere Fettsäuren unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu den enthaltenden Diacylphospholipids aufgrund der einzigartigen chemischen Eigenschaften der einzelne Kette amphiphilen. Hier beschreiben wir Techniken für die Vorbereitung, die Reinigung und die Verwendung von Liposomen bestehen teilweise oder ganz von diesen amphiphilen.

Vorbereitung, Reinigung und Anwendung von Fettsäure-haltigen Liposomen

Wir präsentieren eine Technik zur kontaktlosen Mikromanipulation von Vesikeln, mit lokalisierten Kalzium Ionen Steigungen. Mikroinjektion einer Kalzium-Ionen-Lösung, in der Nähe einer riesigen Lipid-Bläschen, wird genutzt, um die Lipidmembran, wodurch die Produktion der Membran röhrenförmige Ausstülpungen umzugestalten.

Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Das Ziel dieses Protokolls ist es, fluoreszenzmarkierte Liposomen zu synthetisieren und die Durchflusszytometrie zu verwenden, um die In-vivo-Lokalisation von Liposomen auf zellulärer Ebene zu identifizieren.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur direkten Messung der Ionenkanalaktivität auf intrazellulären Vesikeln unter Verwendung eines manuellen endolysosomalen Patch-Clamp-Systems. Wir veranschaulichen die Methode, bei der Endolysosomen vergrößert und diese Vesikel manuell isoliert werden. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die Forscher das Verfahren genau replizieren und anwenden können.

Patch-Clamp-Techniken für die Analyse einzelner endolysosomaler Vesikel

Lernen Sie die Herstellung stabiler Riesen-Liposomen für Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Imaging. Diese Methode bewahrt die funktionelle Integrität von Membranproteinen und ermöglicht präzise Untersuchungen neuronaler Ionenkanäle.

Riesen-Liposomen-Herstellung für Imaging und Patch-Clamp-Elektrophysiologie

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