Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das angeborene und circadiane Lichtverhalten von Drosophila-Larven mittels eines Licht-Dunkel-Präferenztests zu untersuchen. Dazu werden die experimentellen Larven zunächst unter definierten Licht-Dunkel-Bedingungen aufgezogen, um eine initiale circadiane Uhr in den Larven zu etablieren. Anschließend werden die Larven in konstante Dunkelheit überführt, wodurch die circadiane Uhr der Larven frei laufen kann.

Einmal im L3-Fütterungsstadium werden die Larven in Gruppen sortiert, um ihre Lichtpräferenz zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Rhythmus zu testen. Die Ergebnisse zeigen eine angeborene und circadiane Lichtpräferenz, die durch Berechnung eines Präferenzindex und den Vergleich zwischen verschiedenen Zeitpunkten und experimentellen Gruppen ermittelt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die angeborene und circadiane Regulation der Lichtwahrnehmung sowie der Verarbeitung von Photoverhalten ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewandt werden, wie zum Beispiel auf Geruchswahrnehmung, Gustation, Chemotaxis und Thermotaxis.

Ebenso kann es für Lern- und Gedächtnistests modifiziert werden. Die Durchführung der Methode wird von Alina und BMA gegenüber Doktoranden aus meinem Labor demonstriert. Um Eier zu sammeln, lassen Sie kopulierende adulte Fliegen 12 Stunden lang auf frischen Agarplatten ablegen und überführen Sie sie anschließend in neue Röhrchen. Überführen Sie die erwachsenen Fliegen im Wechsel alle 12 Stunden bei einem 12-Stunden-Licht-, 12-Stunden-Dunkel-Zyklus.

Die 12-Stunden-Ei-Sammlungen im Inkubator belassen. Für das Experiment die Tiere bis zum frühen L3-Larvenstadium heranziehen. Diese fressenden Larven sind 84 bis 108 Stunden nach der Eiablage verfügbar.

Das korrekte Staging von LAE ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Da sich das visuelle Verhalten von späten L3-Larven ändert, um circadiane Komponenten des Sehverhaltens zu testen, müssen die gesammelten Larven 48 Stunden vor der Prüfung und kurz vor dem subjektiven Morgendämmern der Larven in eine Pappschachtel gestellt werden.

Überführen Sie die Box danach für 48 Stunden bis zum Beginn des Experiments in einen Inkubator mit konstanter Dunkelheit; die Larven müssen währenddessen ungestört in ihrem zugewiesenen Bereich verbleiben. Bereiten Sie den Deckel einer 9 cm großen Petrischale vor, indem Sie ein 20 cm² großes Quadrat in vier Quadranten unterteilen, als Orientierungshilfe.

Kleben Sie 10 cm große Quadrate aus Aluminiumfolie auf gegenüberliegende Quadranten und bedecken Sie diese mit schwarzen Klebeband. Achten Sie darauf, auch die Kante des Deckels abzudecken. Kleben Sie anschließend ein in vier Quadranten unterteiltes 20 cm großes Quadrat unter der Lichtquelle auf dem Tisch fest.

Markieren Sie den Umfang einer Testplatte auf dem Blatt, um als Führung für eine gleichmäßige Verschiebung zu dienen. Befestigen Sie eine LED-Lampe mithilfe eines Eisenträgerstativs über der Petrischale. Stellen Sie die Höhe so ein, dass die gesamte Testplatte gleichmäßig beleuchtet wird.

Stellen Sie die Lichtintensität an einer Teststelle durch weitere Anpassung der Lampenhöhe oder durch Verwendung einer regelbaren Stromversorgung auf 350 bis 760 Lux ein. Der Versuchsraum muss mit rotem Licht beleuchtet sein und dieselbe Temperatur aufweisen wie der Raum, in dem die Tiere aufgezogen werden. Die Gefäße wurden zwei Tage lang unter konstanter Dunkelheit aufgezogen.

Sammeln Sie die Larven mithilfe eines Spatels aus den oberen fünf Millimetern der Nahrung. Verteilen Sie die Nahrung auf der Außenseite des Petrischalen-Deckels. Geben Sie etwas Wasser zur Nahrung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig mit dem Spatel.

Ein Tropfen Leitungswasser mithilfe eines Pinsels einer neuen Schale hinzufügen. Die Larven in den Wassertropfen überführen, um sie zu waschen. Anschließend die Larven mit einem angefeuchteten Pinsel aufnehmen.

Wählen Sie nur die früh fressenden L3-Larven aus und vermeiden Sie spät wandermüde L3-Larven. Überführen Sie die ausgewählten Larven in die Mitte einer Testplatte. Fressende L3-Larven weisen vordere Kugelorgane auf, die geöffnet und nach außen hervortreten.

In fingerförmiger Gestalt. Die hinteren Kugeln weisen jeweils drei Öffnungen und vier Gruppen großer verzweigter Haare auf. Die Speicheldrüsen reichen bis zum zweiten Bauglied.

Nachdem 30 Larven in die Mitte der Testplatte gelegt wurden, bedecken Sie diese mit dem vorbereiteten Deckel. Schalten Sie die LED-Lampe ein. Starten Sie eine Stoppuhr und lassen Sie die Larven fünf Minuten lang frei auf der Platte bewegen.

Entfernen Sie dann schnell den Deckel und zählen Sie die Anzahl der Larven im dunklen und im hellen Quadranten. Die Markierung der Position jeder Larve kann die Zählung erleichtern. Ein schnelles Foto kann ebenfalls helfen. Larven, die eine unklare Lichtpräferenz zeigen, wie zum Beispiel Larven, die an den Wänden kriechen oder sich in den Agar hineinbohren, sollten als neutrale Präferenz gewertet und zur Gesamtanzahl der Larven hinzugerechnet werden, wenn der Lichtpräferenzindex berechnet wird.

Nachdem die Larven gezählt wurden, entsorgen Sie die Platte und verwenden Sie eine neue Testplatte für den nächsten Versuch. Führen Sie nach 10 bis 15 Versuchen pro Genotyp die Analyse gemäß dem Protokoll durch. Die Licht-Dunkel-Präferenz von Canton ES-Larven wurde zu zwei unterschiedlichen zirkadianen Zeitpunkten verglichen.

CT Null und CT 12, subjektiv, Morgendämmerung und Abenddämmerung Larven oder brüten 48 Stunden unter Standardbedingungen und wechseln dann für drei Tage in Dauerfinsternis. Licht-Dunkel-Tests bei 350 Lux zeigten, dass die Lichtempfindlichkeit bei Larven, die zu CT Null getestet wurden, höher war als bei Larven, die zu CT 12 getestet wurden. Mit dieser Formel betrug die Dunkelheitspräferenz der Larven zu CT Null 0,52 im Vergleich zu 0,36.

Die CT-12-Larven, bei denen die Indizes mit einem Wilcoxon-Test verglichen werden, ergeben einen signifikanten P-Wert von 0,023. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Lichtpräferenz von Troph-Larven an verschiedenen Zeit- und Schaltkreiszeitpunkten testet. Sie sollten in der Lage sein, Stufe F drei Oph-Larven zu synchronisieren, ihr photophobes Verhalten zu testen und den Lichtpräferenzindex für den statistischen Vergleich zu berechnen.