Name: Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Lernen Sie den Licht-Dunkel-Präferenztest zur Untersuchung angeborener und circadianer Photoverhaltensweisen bei Drosophila-Larven. Diese Methode ermöglicht die Analyse von sensorischer Verarbeitung und circadianen Rhythmen.

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Wir danken unseren Kollegen am Institut für Biologie der Universität Freiburg für fruchtbare Diskussionen. Wir danken der Bloomington Stock Center für die Bereitstellung von fly Aktien. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Swiss National Science Foundation (PP00P3_123339) und der Velux Stiftung unterstützt SGS

Ein. Larvenaufzucht <ol><li> Halten Sie fliegen Stämmen oder genetische Kreuze in der Massenkultur bei 25 ° C auf Maismehl-Medium unter einer 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus in eine Fliege Inkubator mit Licht und Timer ausgestattet. </li><li> Verdünnen backer Hefe in Wasser zu einer Flüssigkeit Paste (10 g Hefe Backer mit 3-4 ml destilliertem H 2 O verdünnt) zu bilden. Fügen Sie einen kleinen Tropfen auf die Maismehl Lebensmittel und decken die Fläschchen. Lassen Sie für mindestens eine Stunde trocken erwachsenen Fliegen kleben an den Hefepaste. Putting einen kleinen Tropfen von Hefe in Wasser verdünnt auf der Oberfläche des Nahrungsmittels verbessern können Eiablage. Alternativ Bäckerhefe Paste, 20% Essigsäure (AcOH) (Sigma Aldrich, Schweiz A6283-100ml) können verwendet werden. Dafür tauchen die Spitze eines Q-Tip auf die Lösung und die Ausbreitung auf der Oberfläche der Lebensmittel Maismehl. </li><li> Setzen erwachsenen Fliegen (mindestens vier Tage alt, aber nicht älter als 10 Tage) in Maismehl Lebensmittel Fläschchen. Legen Sie genügend Erwachsene in jedem Fläschchen, um genügend Larven erhalten den Vorzug wiederholenmehrmals testen und ermöglichen statistische Vergleich. Für genetische Kreuze, wir verwenden in der Regel ein Minimum von 20 Weibchen und Männchen 5-10 pro Fläschchen, aber einige Linien erfordern mehr Frauen, um eine ausreichende Larven Nachkommen zu erhalten. </li><li> Erlauben Erwachsenen Eier für 12 Stunden lag und sie auf neue Flaschen. Erwachsene können in der Früh und am Abend übertragen werden. Wir in der Regel übertragen Erwachsene für sieben bis zehn Tage und bei Bedarf nehmen neue Erwachsenen. </li><li> Halten Sie die Ei Sammlungen genommen alle 12 Stunden in den Inkubator und wachsen lassen die Larven bei 25 ° C, 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus und 60% Luftfeuchtigkeit. Um zirkadianen Komponenten der visuellen Verhalten bewegen Larven ständigen Dunkelheit (DD) 48 Stunden nach der Ei-Sammlung (entsprechend zwei-Hell-Dunkel-Zyklen) zu testen. Verwenden Sie hierzu einen separaten Brutschrank ohne Licht aber halten alle anderen Bedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit identisch. Achten Sie darauf, die Fläschchen der DD Inkubator übertragen kurz vor der Umstellung auf die dunkle Phase. Bevor die Fläschchen zu another Inkubator gestellt Fläschchen in einem Karton oder wickeln Sie die Fläschchen mit Aluminiumfolie Belichtung während der Übertragung (Verpackung im Karton oder in der Verpackung zu tun ist während der &quot;lights-on-Phase&quot; vor der Verschiebung zwischen Inkubatoren) zu verhindern. Verhindere, dass die Tiere vor der Belichtung nach diesem Zeitpunkt und bis Anfang Experimente. </li><li> Nach 4 Tagen (84-108 h von der Eiablage) sammeln früh L3 (Fütterung Larven) zu den Zeitpunkten getestet werden (siehe 4. Leichte Vorlieben Test, Punkt. 4.4.). </li></ol> 2. Test Setup <ol><li> Führen Sie Experimente in einem dunklen Raum mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit. </li><li> Um zwei Quadranten der Petrischale im Dunkeln zu halten, decken Sie den Deckel mit schwarzem Klebeband und Alufolie. Um dies zu tun, die Mittelpunkte des Deckels Umfang. Auch markieren vier Punkte an der Grenze des Deckels um 90 ° der Trennung zwischen ihnen. Um es einfacher, ziehen Sie eine 20 cm im Quadrat in vier Quadranten von 10 cm Länge auf ein geteiltesBlatt Papier oder mit Hilfe eines Computers. Cut 10 cm große Quadrate aus Aluminiumfolie und schwarzem Klebeband (Abbildung 1A). Abdeckung zwei gegenüberliegenden Quadranten durch Kleben ein Quadrat aus Aluminiumfolie, als erste Schicht und schwarzem Klebeband abgedeckt wird, vorsichtig sein, um auch auf den Rand des Deckels. In den vergangenen zwei leicht unterschiedliche Formen dieser Assays wurden verwendet. Wir hier die &quot;Viertel-Platte&quot;-Assay, in dem der Petrischale in vier gleiche Viertel 10 geteilt wird. Bei der Alternative &quot;half-Platte&quot;-Assay wird die Petrischale unterteilt Hälfte (Hälfte ans Licht, halb in der Dunkelheit ausgesetzt) ​​1,7,8. Bis heute keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Tests wurde veröffentlicht. </li><li> Kleben Sie einen Quadranten Blatt wie die für die Kennzeichnung der Deckel direkt unter der Lichtquelle auf dem Tisch eingesetzt. Markieren Sie den Umfang einer Petrischale auf dem Quadranten Kreuzung zentriert. Verwenden Sie die Markierungen als Referenz, um den Test zu platzieren Platte immer in der gleichen Position unter der Lichtquelle. </li><li> Installieren Sie einLampe, entweder eine einfache weiße Glühlampe (Phillips, Softtone 5W) oder eine LED-Lampe (LED-Lampe, 80012 Weiß, Osram) oberhalb der Petrischale mit Hilfe eines eisernen Stativ (Fisher Scientific, S47808). Stellen Sie die Höhe in einer Weise, dass die gesamte Prüfung Platte homogen ausgeleuchtet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von LED-Lampen, da sie mehr spezifischen Wellenlängen als herkömmliche Glühbirnen emittieren. Außerdem LEDs emittieren weniger Wärme. </li><li> Passen Sie die Lichtintensität mit Hilfe eines Photometers (Umwelt Meter PCE EM882). Um die erforderliche Lichtintensität von 350 bis 760 Lux erreichen, bewegen Sie die Lampe nach oben oder unten erforderlich. Stecken Sie die Lampe auf eine einstellbare Spannungsversorgung bietet mehr Flexibilität, um Intensitäten ohne Verschieben der Lampe (Abbildung 1B) ändern. </li></ol> 3. Platten Vorbereitung <ol><li> Stellen Sie 200 ml von 2,5% Agar (Sigma-Aldrich, Schweiz A5093-500G) mit doppelt destilliertem Wasser (Millipore). </li><li> Zeigen Petrischalen auf einem Tisch (90 mm Durchmesser;Greiner Bio-One GmbH, bis 4550 Kremsmeinster, Österreich) in Reihen erlauben Gießen heißen Agarose. </li><li> Kochen Sie die Agarose in der Mikrowelle, bis die Lösung ist vollständig transparent und flüssig. Stellen Sie sicher, dass flüssige Lösung enthält keine Blasen. ACHTUNG: Transport sorgfältig auf den Tisch, da die Lösung kann sehr heiß sein! </li><li> Gießen Sie heißes Agarose in die Petrischalen, bis die gesamte Oberfläche ist homogen mit einer dünnen Schicht von der Lösung bedeckt sind etwa zwei bis drei Millimeter reichen. Seien Sie schnell an Agarose erstarrt vor der Beschichtung alle Platten zu verhindern. Lassen Sie die Platten abkühlen. Bewahren Platten bei Raumtemperatur und verwenden Sie sie am selben Tag der Vorbereitung. </li></ol> 4. Licht-Test Preference <ol><li> Arbeiten unter Rotlicht Bedingungen im Experiment Raum Lichteinfluss zu verhindern, bevor der Test seit Drosophila ist nicht in der Lage, roten Wellenlängen des Lichts zu erfassen. Verwenden Sie eine rote Glühbirne (Phillips, PFE712E * 8) in einer Lampe angebracht t beleuchtener Ort, um zu arbeiten. </li><li> Pflegen Temperatur durch alle Experimente bei 25 ° C. Regeln der Raumtemperatur durch eine Heiz-oder Kühleinrichtung, falls erforderlich. </li><li> Nehmen Sie sich etwas Nahrung von den Fläschchen aufgezogen für Zwei-Tage-Zyklen unter konstanter Dunkelheit (aus dem Abschnitt 1). Da Larven Regel Graben an der Oberfläche des Lebensmittels zu der obersten Schicht (ca. 5 mm tief) mit Hilfe eines Spatels (Fisher Scientific, 14-373-25A). Verbreiten Sie das Essen auf der Außenseite einer Petrischale Deckel, etwas Wasser zugeben und vorsichtig mischen mit dem Spatel. </li><li> Sammle Fütterung L3 Larven aus der Nahrung. Als Licht bevorzugt getestet werden, die Wahl nur früh / Fütterung L3 Larven ist entscheidend, da die negative Phototaxis gewährleistet ist. Verspätete / wandernde Larven L3 oder große Larve kriecht auf das Essen vermutlich bereits eingeschaltet ihre photobehavior. Füttern L3-Larven (negative phototaktischen) erkannt, weil ihre vorderen Luftlöcher offen sind und ragte nach außen in einem Finger-ähnliche Form werden. Die hintere spiracles haben jeweils drei Öffnungen, und vier Gruppen von großen verzweigten Haaren. Die Speicheldrüsen erweitern, um dem zweiten Abdominalsegment 11. Staging Larve unter dem Mikroskop ist bequem während kein weißes Licht verwendet werden. Ein rotes Licht Lampe ist notwendig, um die Larven zu beleuchten, wenn die Inszenierung unter Stereomikroskop vor Experimenten erforderlich. </li><li> Waschen Larven kurz in Leitungswasser und sammeln frühen Fütterung dritten Larvenstadium (noch in rotes Licht). Vor der Übertragung der Larven auf den Prüfstand Platte nehmen die Larven mit einem nassen Pinsel und sorgfältig absorbieren überschüssiges Wasser mit einem Papiertuch oder einem Filterpapier. Nicht trocken Larven zu übermäßig, da sie das Tier schaden könnte und sein Verhalten beeinflussen. </li><li> Mit dem nassen Pinsel sorgfältig übertragen die Larven zu den Platten. Legen Sie eine Gruppe von etwa 30 Larven in der Mitte der Platte. Die Platte mit der Deckel bereits mit den Quadranten vorbereitet und stellen Sie die Platte unter der Lichtquelle bereit für Experiment (siehe section 2). </li><li> Schalten Sie die Lampe des weißen Lichtes und den Timer zu starten. Lassen Sie sich die Larve frei bewegen auf der Platte für 5 min, dann schnell den Deckel abnehmen und die Anzahl der Larven in der Dunkelheit und im Licht Quadranten. Markieren Sie die Position der einzelnen Larve mit einem Marker erleichtern das Zählen. Alternativ nehmen Sie ein Bild von der Platte und zählen im Nachhinein. Larven, die eine leichte Präferenz unklar, wie Larven kriechen an den Wänden oder Wühlen in Agar sollte so neutral Vorlieben berücksichtigt werden und nur in der Gesamtzahl der Larven, wenn das Licht bevorzugt Index berechnet wird, einbezogen werden. </li><li> Nach dem Zählen, entsorgen Sie die Platte mit Larven und ersetzen mit einem neuen Test Platte für den nächsten Versuch. Sammeln Sie benutzten Teller in einem Autoklaven Plastiktüte für spätere Handhabung und Entsorgung. </li><li> Sobald Sie eine ausreichende Anzahl von Experimenten eine neue Genotyp getestet durchgeführt werden kann. 10-15 Versuchen pro Genotyp sind ausreichend für die Analyse. </li></ol> 5. Daten Analysis <ol><li> Der Einfachheit halber die Daten an einem Datenblatt als Excel (Microsoft) oder Herkunft (Origin Lab) auf einem Computer zur weiteren statistischen Analyse. Vereinbaren Sie in einer Spalte die Anzahl der Tiere in der Dunkelheit, in einer zweiten Spalte die Anzahl der Tiere in Licht Quadranten und in der dritten die Gesamtzahl der Tiere in der Platte (einschließlich &quot;neutral&quot; Larven). </li><li> Berechnen Sie die Präferenz-Index (Pref) ein für die Dunkelheit für jedes Experiment unter Verwendung der folgenden Formel: PREF (Dunkelheit) = (Anzahl der Larven in dark - Anzahl der Larven in Licht) / Gesamtzahl der Larven </li><li> Vergleichen statistisch eine Reihe von Daten mit einer geeigneten Analyse für Gruppen. Hier verwenden wir ein Wilcoxon-Test statistisch zwei Gruppen zu vergleichen. Ein Test mit einer ANOVA Tukey multiple Vergleiche post hoc Test kann getan werden, wenn die normale Verteilung Annahme in einem Verteiler-Group-Vergleich erfüllt ist. </li><li> Machen Sie Diagramme, die deutlich zeigen Vergleiche zwischen den Linien und Punkte entlang der Zeit-Tage-Zyklus. We Verwendung Origin Software (Origin Lab) zu testen, statistische Signifikanz und generieren entsprechende Graphen, aber jede andere Statistik-Software kann hilfreich sein. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das Licht bevorzugt beschriebenen Test nutzt die Larven angeborenen photobehavior. Der Test ist einfach zu schaffen, ermöglicht viele Wiederholungen bei niedrigen Kosten und liefert wertvolle Informationen über Licht sensing und Verarbeitung. Das experimentelle Paradigma ermöglicht relativ schnelle Quantifizierung, wie viele Menschen es vorziehen hell oder dunkel. Solche Vorlieben kann als Rohprodukt Prozentsätze oder alternativ als Preference Index (PREF) angezeigt werden. Die PREF wird als die Differenz von Tieren zum...

Hier beschreiben wir eine Verhaltens-Assay basiert auf der Larven Vorliebe für dunkle (oder Licht). Larven reagieren mit einem starken und stereotypes photonegative Antwort während Nahrungssuche Stufen (L1 bis L3 früh) 1. Der Test wird das Ziel, die photophobic Verhalten der Larve bewerten und vergleicht das helle oder dunkle bevorzugt aus einer Gruppe von Larven sich frei in einer Petrischale mit Agar aufgetragen. Dieser Verhaltens-Assay bietet nicht nur Informationen über die Empfindlichkeit, Integration und zeitliche Plastizität des visuellen Systems, es weiterhin Hinweise, wie Lichtempfindlichkeit und seine Prozess wird durch den circadianen System gesteuert. Die Drosophila Larven Auge (auch als Bowlig Orgel; BO), ist das wichtigste Organ für leichte Wahrnehmung. Jedes Auge von 12 Photorezeptoren (PR) zusammengesetzt ist, zum Ausdruck bringen acht PRs die grün-empfindlichen rhodopsin6 (rh6) und vier Fotorezeptoren Ausdruck der blau-empfindlichen rhodopsin5 (RH5) 2,3. Neben Fotorezeptoren, also Klasse IV multidendritic Neuronen, die die Larven Körper Wand bedecken, sind identifiziert worden, um schädliche Lichtintensitäten 4,5 reagieren. Es ist auch bekannt, dass der Schrittmacher Neuronen im zentralen Larven Gehirn liegt das lichtempfindliche Protein Cryptochrome (Cry), die als intrinsische Uhr blaues Licht Sensor wirkt im Gehirn 6,7 auszudrücken. Interessanterweise photophobicity von Wildtyp-Tieren zeigt eine zirkadiane Komponente zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe des Tages und der Nacht, wenn die Prüfung mit diesem Test. Responses to Licht der Nahrungssuche L3 Larve zeigte stärkere photophobicity im Morgengrauen und in der Abenddämmerung unteren photophobicity wenn für Hell-Dunkel-Präferenz 7 getestet. Interessanterweise nur Rh5-PRS für leichte Vermeidung erforderlich, während Rh6-PRS entbehrlich sind. Sowohl Rh5-PRS und Rh6-PRS in Zurücksetzen des molekularen Uhr durch Licht 8 beteiligt. Der Schrei Weg muss mit den anderen lichtempfindlichen Wege koordiniert werden, um eine entsprechende Verhaltens-Ausgang in die orchestrierenLaufe des Tages. Acetylcholin in PRs spielt eine wesentliche Rolle in Licht Vermeidungsverhalten sowie Mitnahme der molekularen Uhr. Blocking Acetylcholin Neurotransmission von PRS circadianen Schrittmacher Neuronen reduziert die photophobic Antwort in der Hell-Dunkel-Präferenz-Test 8. Unter Verwendung des gleichen Assay wurden zwei symmetrische Paare von Neuronen vor kurzem identifiziert, um das Licht Vorlieben des dritten Larvenstadium von Drosophila 9 wechseln. Diese beiden Paare von Neuronen während der späten Larvenstadien zu funktionieren, wenn die Tiere die Nahrung verlassen, um vermutlich finden einen geeigneten Ort Puparium-Bildung. Allerdings bleibt die Frage, wie die Sehbahn interagieren und steuern Larven visuelle Verhalten in einem zirkadianen Weise weitgehend unbeantwortet. Das Licht Vorlieben Assay ermöglicht Vergleiche zwischen circadianen Zeitpunkten fliegen Linien und circadianen Zustand unter verschiedenen Lichtverhältnissen Qualitäten. Der Test ist einfach und kostengünstig und vorbereitet hat sich als nützlich erwiesen zuvor in verschiedene Labors zu beschreiben und zu studieren Licht abgeleitet Verhalten in der Larve.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5093-500G</td><td>2,5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Schweiz </td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>90 mm Durchmesser; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Österreich</td></tr><tr><td>LED-Lampe</td><td>OSARAM</td><td>80012 Weiße</td><td>LED-Lampe, 80012 Weiß</td></tr><tr><td>Umweltmessgerät</td><td>PCE</td><td>PCE EM882</td><td>Lux, Temp, RH%Thermostatschrank</td></tr> <tr><td></td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>Lichttimer</td><td>Timer T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (Überprüfen Sie die Spezifikationen für Ihr Land)</td></tr><tr><td>Universal Thermostat</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>Luftbefeuchter</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balck Band</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 cm </td></tr><tr><td>Kleber</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Lampe</td><td>Phillips</td><td>Softtone</td><td>5W</td></tr><tr><td>Zeitschaltuhr</td><td>Ziliss</td><td></td><td>Ziliss, Schweiz</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer Hefe</td><td>Migros Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisenständer 17X28CM</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283-100ML</td><td>20% Essigsäure verdünnt in H2O</td></tr><tr><td>Rotlichtlampe</td><td>Phillips</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>Spatel </td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Prix Coop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizung</td><td>GOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Maismehl Fliegenfutter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

licht vorlieben assay zur angeborenen und circadian geregelten photobehavior in studie<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Licht wirkt als Signal an die Umwelt das Verhalten der Tiere auf verschiedenen Ebenen zu steuern. Die Drosophila Larven Nervensystem wird als einzigartiges Modell verwendet, um grundlegende Fragen auf, wie leicht Informationen verarbeitet und geteilt zwischen schnellen und zirkadiane Verhalten zu beantworten. Drosophila-Larven zeigen eine stereotype Vermeidungsverhalten, wenn sie dem Licht ausgesetzt. Um Licht abhängige Verhaltensweisen vergleichsweise einfachen Licht-Dunkel-Präferenz Tests angewendet werden können, zu untersuchen. Bei Wirbeltieren und Arthropoden die Nervenbahnen in der Sensorik und der Verarbeitung visueller Vorleistungen teilweise überschneiden sich mit denen Verarbeitung photic zirkadianen Informationen. Die faszinierende Frage, wie das Licht Sensing-System und der circadianen Systems interagieren zu halten Verhaltensstörungen Ausgänge koordiniert bleibt weitgehend unerforscht. Drosophila ist ein biologisches Modell auswirken, diese Fragen zu nähern, wegen einer kleinen Anzahl von Neuronen im Gehirn und die Verfügbarkeit von genetischen Werkzeuge für neuronale manipulation. Das vorgestellte Hell-Dunkel-Präferenz Assay ermöglicht die Untersuchung einer Reihe von visuellen Verhaltensweisen einschließlich circadianen Kontrolle phototaxis.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll haben wir getestet, Hell-Dunkel-Präferenz in frühen dritten Larvenstadium Stadion von Wildtyp Canton-S fliegt bei zwei unterschiedlichen circadianen Zeiten CT0 und CT12. Erwachsene wurden 12-Stunden-Licht-12-Stunden Dunkelheit gehalten und nach links, um Eier für 12 Stunden lag. Larven wachsen die ersten beiden Tage unter dem gleichen Licht-Dunkel-Regimes. Da wir zirkadiane Modulation unter konstanten Bedingungen (Lauf der circadianen Uhr) testen wollte, wurden Larven dann konstant ...

Hier beschreiben wir eine Hell-Dunkel-Präferenz-Test für Drosophila Larve. Dieser Test liefert Informationen zur angeborenen und zirkadiane Regulierung von Licht Abtasten und Verarbeiten photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das angeborene und circadiane Lichtverhalten von Drosophila-Larven mittels eines Licht-Dunkel-Präferenztests zu untersuchen. Dazu werden die experimentellen Larven zunächst unter definierten Licht-Dunkel-Bedingungen aufgezogen, um eine initiale circadiane Uhr in den Larven zu etablieren. Anschließend werden die Larven in konstante Dunkelheit überführt, wodurch die circadiane Uhr der Larven frei laufen kann.Einmal im L3-Fütterungsstadium werden die Larven in Gruppen sortiert, um ihre Lichtpräferenz zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Rhythmus zu testen. Die Ergebnisse zeigen eine angeborene und circadiane Lichtpräferenz, die durch Berechnung eines Präferenzindex und den Vergleich zwischen verschiedenen Zeitpunkten und experimentellen Gruppen ermittelt wird. Obwohl diese Methode Einblicke in die angeborene und circadiane Regulation der Lichtwahrnehmung sowie der Verarbeitung von Photoverhalten ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewandt werden, wie zum Beispiel auf Geruchswahrnehmung, Gustation, Chemotaxis und Thermotaxis.Ebenso kann es für Lern- und Gedächtnistests modifiziert werden. Die Durchführung der Methode wird von Alina und BMA gegenüber Doktoranden aus meinem Labor demonstriert. Um Eier zu sammeln, lassen Sie kopulierende adulte Fliegen 12 Stunden lang auf frischen Agarplatten ablegen und überführen Sie sie anschließend in neue Röhrchen. Überführen Sie die erwachsenen Fliegen im Wechsel alle 12 Stunden bei einem 12-Stunden-Licht-, 12-Stunden-Dunkel-Zyklus.Die 12-Stunden-Ei-Sammlungen im Inkubator belassen. Für das Experiment die Tiere bis zum frühen L3-Larvenstadium heranziehen. Diese fressenden Larven sind 84 bis 108 Stunden nach der Eiablage verfügbar.Das korrekte Staging von LAE ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Da sich das visuelle Verhalten von späten L3-Larven ändert, um circadiane Komponenten des Sehverhaltens zu testen, müssen die gesammelten Larven 48 Stunden vor der Prüfung und kurz vor dem subjektiven Morgendämmern der Larven in eine Pappschachtel gestellt werden.Überführen Sie die Box danach für 48 Stunden bis zum Beginn des Experiments in einen Inkubator mit konstanter Dunkelheit; die Larven müssen währenddessen ungestört in ihrem zugewiesenen Bereich verbleiben. Bereiten Sie den Deckel einer 9 cm großen Petrischale vor, indem Sie ein 20 cm² großes Quadrat in vier Quadranten unterteilen, als Orientierungshilfe.Kleben Sie 10 cm große Quadrate aus Aluminiumfolie auf gegenüberliegende Quadranten und bedecken Sie diese mit schwarzen Klebeband. Achten Sie darauf, auch die Kante des Deckels abzudecken. Kleben Sie anschließend ein in vier Quadranten unterteiltes 20 cm großes Quadrat unter der Lichtquelle auf dem Tisch fest.Markieren Sie den Umfang einer Testplatte auf dem Blatt, um als Führung für eine gleichmäßige Verschiebung zu dienen. Befestigen Sie eine LED-Lampe mithilfe eines Eisenträgerstativs über der Petrischale. Stellen Sie die Höhe so ein, dass die gesamte Testplatte gleichmäßig beleuchtet wird.Stellen Sie die Lichtintensität an einer Teststelle durch weitere Anpassung der Lampenhöhe oder durch Verwendung einer regelbaren Stromversorgung auf 350 bis 760 Lux ein. Der Versuchsraum muss mit rotem Licht beleuchtet sein und dieselbe Temperatur aufweisen wie der Raum, in dem die Tiere aufgezogen werden. Die Gefäße wurden zwei Tage lang unter konstanter Dunkelheit aufgezogen.Sammeln Sie die Larven mithilfe eines Spatels aus den oberen fünf Millimetern der Nahrung. Verteilen Sie die Nahrung auf der Außenseite des Petrischalen-Deckels. Geben Sie etwas Wasser zur Nahrung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig mit dem Spatel. Ein Tropfen Leitungswasser mithilfe eines Pinsels einer neuen Schale hinzufügen. Die Larven in den Wassertropfen überführen, um sie zu waschen. Anschließend die Larven mit einem angefeuchteten Pinsel aufnehmen.Wählen Sie nur die früh fressenden L3-Larven aus und vermeiden Sie spät wandermüde L3-Larven. Überführen Sie die ausgewählten Larven in die Mitte einer Testplatte. Fressende L3-Larven weisen vordere Kugelorgane auf, die geöffnet und nach außen hervortreten. In fingerförmiger Gestalt. Die hinteren Kugeln weisen jeweils drei Öffnungen und vier Gruppen großer verzweigter Haare auf. Die Speicheldrüsen reichen bis zum zweiten Bauglied.Nachdem 30 Larven in die Mitte der Testplatte gelegt wurden, bedecken Sie diese mit dem vorbereiteten Deckel. Schalten Sie die LED-Lampe ein. Starten Sie eine Stoppuhr und lassen Sie die Larven fünf Minuten lang frei auf der Platte bewegen.Entfernen Sie dann schnell den Deckel und zählen Sie die Anzahl der Larven im dunklen und im hellen Quadranten. Die Markierung der Position jeder Larve kann die Zählung erleichtern. Ein schnelles Foto kann ebenfalls helfen. Larven, die eine unklare Lichtpräferenz zeigen, wie zum Beispiel Larven, die an den Wänden kriechen oder sich in den Agar hineinbohren, sollten als neutrale Präferenz gewertet und zur Gesamtanzahl der Larven hinzugerechnet werden, wenn der Lichtpräferenzindex berechnet wird.Nachdem die Larven gezählt wurden, entsorgen Sie die Platte und verwenden Sie eine neue Testplatte für den nächsten Versuch. Führen Sie nach 10 bis 15 Versuchen pro Genotyp die Analyse gemäß dem Protokoll durch. Die Licht-Dunkel-Präferenz von Canton ES-Larven wurde zu zwei unterschiedlichen zirkadianen Zeitpunkten verglichen.CT Null und CT 12, subjektiv, Morgendämmerung und Abenddämmerung Larven oder brüten 48 Stunden unter Standardbedingungen und wechseln dann für drei Tage in Dauerfinsternis. Licht-Dunkel-Tests bei 350 Lux zeigten, dass die Lichtempfindlichkeit bei Larven, die zu CT Null getestet wurden, höher war als bei Larven, die zu CT 12 getestet wurden. Mit dieser Formel betrug die Dunkelheitspräferenz der Larven zu CT Null 0,52 im Vergleich zu 0,36.Die CT-12-Larven, bei denen die Indizes mit einem Wilcoxon-Test verglichen werden, ergeben einen signifikanten P-Wert von 0,023. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Lichtpräferenz von Troph-Larven an verschiedenen Zeit- und Schaltkreiszeitpunkten testet. Sie sollten in der Lage sein, Stufe F drei Oph-Larven zu synchronisieren, ihr photophobes Verhalten zu testen und den Lichtpräferenzindex für den statistischen Vergleich zu berechnen.

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