Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie Drosophila Larven

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das angeborene und zirkadiane Photoverhalten von Drosophila-Lava mittels eines Hell-Dunkel-Präferenztests zu testen. Dies wird erreicht, indem die Versuchslarven zunächst unter definierten Hell-Dunkel-Bedingungen aufgezogen werden, um eine anfängliche zirkadiane Uhr in den Larven zu etablieren. Als nächstes werden die Larven auf ständige Dunkelheit umgestellt, wodurch die zirkadiane Uhr der Larve frei laufen kann.

In der L-3-Fütterungsphase wird die Lava in Gruppen eingeteilt, um ihre Lichtpräferenz zu verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten zu testen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die angeborene und zirkadiane Lichtpräferenz auf der Grundlage der Berechnung eines Präferenzindex und des Vergleichs zwischen Zeitpunkten und experimentellen Gruppen zeigen. Obwohl diese Methode Einblicke in die angeborene und zirkadiane Regulation der Lichtwahrnehmung und die Verarbeitung des Photoverhaltens geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Geruchssinn, Kassation, Chemotherapie und Thermotaxis angewendet werden.

Ebenso kann es für Lern- und Gedächtnistests modifiziert werden. Alina und BMA werden das Verfahren demonstrieren. Um Eier zu sammeln, lassen Sie sich paarende erwachsene Fliegen 12 Stunden lang auf frische Feilen legen und übertragen Sie sie in neue Fläschchen. Übertragen Sie die Erwachsenen alle 12 Stunden für einen 12-stündigen Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus.

Bewahren Sie die 12-Stunden-Eiersammlungen im Brutkasten auf. Für das Experiment ziehen Sie die Tiere im frühen L-Drei-Larvenstadium auf. Diese füttern Lae 84 bis 108 Stunden aus dem Ei.

Legen Das korrekte Staging von LAE ist entscheidend für den Erfolg des Experiments. Seit Ende L 3 hat LAE das Photoverhalten verändert, um die zirkadianen Komponenten des visuellen Verhaltens zu testen. 48 Stunden vor dem Test und kurz bevor die Larven subjektiv im Morgengrauen geboren wurden, legten sie die gesammelten Larven in einen Karton.

Bringen Sie die Box dann für 48 Stunden bis zum Experiment in einen Inkubator mit konstanter Dunkelheit, diese Larven müssen ungestört in ihrem dafür vorgesehenen Raum bleiben. Bereiten Sie den Deckel einer neun Zentimeter großen Petrischale mit einem 20 Zentimeter großen Quadrat vor, das in vier Quadranten unterteilt ist. Als Orientierungshilfe.

Kleben Sie 10 Zentimeter große Quadrate aus Aluminiumfolie auf gegenüberliegende Quadranten und bedecken Sie sie mit schwarzem Klebeband. Achten Sie darauf, den Rand des Deckels abzudecken. Nächster Kleber, ein 20 Zentimeter großes Quadrat, das in vier Quadranten unterteilt ist, unter der Lichtquelle auf dem Tisch.

Markieren Sie den Umfang einer Testschale auf dem Blech, um als Richtwert für eine gleichmäßige Verschiebung zu dienen. Installieren Sie eine LED-Lampe über der Petrischale mit einem eisernen Stützständer. Stellen Sie die Höhe so ein, dass die gesamte Prüfplatte gleichmäßig ausgeleuchtet wird.

Stellen Sie die Lichtintensität an einem Teststandort auf 350 bis 760 Luxe ein, indem Sie entweder die Lampenhöhe weiter anpassen oder ein einstellbares Netzteil verwenden. Der Versuchsraum benötigt eine Rotlichtbeleuchtung und muss die gleiche Temperatur haben wie dort, wo die Tiere aufgezogen werden. Die Fläschchen bäumten sich zwei Tage lang in ständiger Dunkelheit.

Sammeln Sie die Lava in ihrem Futter mit einem Spatel von den oberen fünf Millimetern des Futters. Verteilen Sie das Essen auf der Außenseite eines Petrischalendeckels. Geben Sie etwas Wasser zum Essen und mischen Sie es vorsichtig mit dem Spatel.

Gib mit einem Pinsel einen Tropfen Leitungswasser in ein neues Gericht. Setzen Sie die Larven in den Wassertropfen um, um sie zu waschen. Verwenden Sie dann einen feuchten Pinsel, um die Larven mit dem nassen Pinsel zu sammeln.

Wählen Sie nur die früh fressenden L drei Larven aus und vermeiden Sie spät wandernde L drei Larven. Übertragen Sie die ausgewählten Larven in die Mitte einer Testplatte. Bei der Fütterung von L haben drei Larven vordere Kugeln, die offen sind und nach außen ragen.

In fingerähnlicher Form. Die hinteren Kugeln haben je drei Öffnungen und vier Gruppen von großen, verzweigten Haaren. Die Speicheldrüsen erstrecken sich bis zum zweiten Bauchsegment.

Sobald 30 Larven in die Mitte der Testplatte gelegt wurden, decken Sie sie mit dem vorbereiteten Deckel ab. Schalten Sie die LED-Lampe ein. Starten Sie einen Timer und lassen Sie die Larven fünf Minuten lang frei auf dem Teller laufen.

Nehmen Sie dann schnell den Deckel ab und zählen Sie die Anzahl der Larven im dunklen und im hellen Quadranten. Das Markieren der Position jeder Lava kann das Zählen erleichtern. Ein schnelles Foto kann auch hilfreich sein: Larven, die eine unklare Lichtpräferenz zeigen, wie z. B. Larven, die an den Wänden kriechen oder sich in Agar ausleihen, sollten als neutrale Präferenz gezählt und zur Gesamtzahl der Larven addiert werden, wenn der Lichtpräferenzindex berechnet wird.

Nachdem Sie die Larven gezählt haben, entsorgen Sie die Platte und verwenden Sie eine neue Testplatte für das nächste Experiment. Nachdem Sie 10 bis 15 Versuche pro Genotyp durchgeführt haben, fahren Sie mit der Analyse gemäß dem Protokoll fort. Die Hell-Dunkel-Präferenz der ES-Lava des Kantons wurde zu zwei verschiedenen zirkadianen Zeiten verglichen.

CT zero und CT 12 zeigen subjektiv die Larven in der Morgen- und Abenddämmerung oder ächzen 48 Stunden lang unter Standardbedingungen und schalten dann für drei Tage auf konstante Dunkelheit um. Hell-Dunkel-Tests unter 350 Lux zeigten, dass die Lichtempfindlichkeit bei Larven, die bei CT Null getestet wurden, höher war als bei Larven, die bei CT 12 getestet wurden. Mit dieser Formel betrug die Dunkelheitspräferenz von CT-Null-Lava 0,52 im Vergleich zu 0,36.

Die CT 12-Larven, die die Indizes mit einem Wilcoxon-Test vergleichen, ergeben einen signifikanten P-Wert von 0,023. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Lichtpräferenz von Trophlarven in verschiedenen Kreisen und zu verschiedenen Zeitpunkten testen können, um dieses Ziel zu erreichen. Sie sollten in der Lage sein, auf Stufe F drei oph Larven zu fangen, ihr photophobes Verhalten zu testen und den Lichtpräferenzindex für den statistischen Vergleich zu berechnen.