Einführung in die Benutzung des Mikroplatten-Photometers
Das Mikroplatten-Photometer ist ein multimodales Instrument, das einem erlaubt verschiedene Experimente zur gleichen Zeit auszuführen und zu messen. M…
Ein Mikroplatten-Photometer ist ein häufig genutztes Laborinstrument, mit dem viele Proben gleichzeitig gemessen werden können, so als würden viele Experimente zur gleichen Zeit parallel ausgeführt werden.
Dieses Gerät wird häufig zusammen mit Multiwell Platten (zum Beispiel 96-Well Platten) genutzt.
Unabhängig von der Art des Experimentes werden Standardkurven, Positiv- und Negativkontrollen genutzt, um den Messwert der Proben zu ermitteln.
Mikroplatten-Photometer existieren in vielen verschiedenen Formen, Größen und Ausführungen. Viele Mikroplatten-Photometer haben multimodale Ausführungen, damit verschiedene Arten von Versuchen und Messungen durchgeführt werden können. Diese Modalitäten beinhalten zum Beispiel die Messungen von Absorption, Fluoreszenz und Lumineszenz.
Multiwellplatten sind wichtige Bestandteile des Mikroplatten-Photometers. Sie dienen als Reservoirs, die Proben für Messungen fassen. Multiwellplatten können verschiedene Gößen, aber auch verschiedene Welltypen und Wellanzahlen haben. Welche Platte benutzt wird, hängt häufig vom Experiment ab.
Das Ladetablett ist dazu da, um die 96-Well Platte in die Maschine einzuführen.
Eine Computerschnittstelle wird typischerweise verwendet, um das Mikroplatten-Photometer zu programmieren und verschiedene Parameter, wie zum Beispiel die Wellenlänge oder den Modus, auszusuchen. Die Software hat eine Benutzeroberfläche, auf der die jeweilige Platte repräsentiert ist und mit der man aussuchen kann welche Wells zu messen sind.
Mehrkanalpipetten werden oft verwendet um Multiwellplatten zu füllen. Die Reservoirs fassen die Lösungen der Mehrkanalpipette. Einzelne Wells können manchmal jedoch auch mit einer einfachen Pipette gefüllt werden.
Proben und Standards können als Duplikat oder Triplikat gefüllt werden, um eventuellen Pipettierfehlern vorzubeugen. Hier zeigen wir eine Multiwellplatte, die in Triplikaten gefüllt wird.
Die Standardkurve wird mit bekannten Stoffkonzentrationen, die zu verschiedenen Absorptionswerten führen, ermittelt. Diese Daten werden dann genutzt, um eine Kurve zu bestimmen.
Der Blindwert wir verwendet, um zu messen welche probenunabhängigen Absorptionen, zum Beispiel durch Puffer oder Reagenzien, auftreten. Die Werte von diesen Messungen werden als Hintergrundwerte bezeichnet. Die Blindwertmessung wird dementsprechend ohne Probe durchgeführt.
Die Positivkontrolle gibt Aufschluss darüber, ob die Messung funktioniert hat, indem sie ein zu erwartendes Resultat anzeigt. Die Negativkontrolle ist eine Messung in der kein experimenteller Effekt zu erwarten oder zu beobachten ist und sollte deshalb zu keinem Ergebnis führen.
Wenn die Platte fertig vorbereitet ist, wird es Zeit die Proben anzusetzen. Um zu verhindern das die falschen Proben oder Proben in falscher Reihenfolge angesetzt werden, ist es wichtig die Platte in korrekter Position auf der Ladefläche zu positionieren. Man sollte vorsichtig beim Einführen der Platte sein, und die Platte auf keinen Fall in das Instrument zwingen oder sich die Finger einklemmen.
Nach dem Einführen der Platte können verschiedene Parameter, wie zum Beispiel der Modus, die Wellenlänge oder die Reihenfolge der Wells, mit Hilfe der Software bestimmt werden.
Nachdem die Parameter eingegeben sind, wird die Platte gelesen und das Photometer generiert Werte und gibt diese an die Software weiter.
Nach dem Lesen der Platte, wird der Durchschnitt der Blindwertmessungen berechnet und von den Probenwerten, einschliesslich denen der Standardkurve, abgezogen.
Nach der Messwertbestimmung werden die bekannten Konzentrationen des Standards gegen die jeweiligen Messwerte, in unserem Fall Absorpitionen, graphisch dargestellt. Danach kann die Kurve durch lineare Regression berechnet werden. Diese Berechnung kann auch einfach in einem Excel spreadsheet ausgeführt werden.
Der Determinationskoeffizient ist ein statistisches Maß für wie gut die Kurve einen Datenpunkt vorhersagt. Er sollte zwischen 0,9-0,99 liegen. 0,99 ist der bestmöglichste Wert, was bedeutet das die Kurve perfekt mit den Daten übereinstimmt.
Die Kurve mit dem besten Determinationskoeffizienten wird dann genutzt, um die Konzentrationen der gemessen Werte zu bestimmen, indem man deren Absorptionswerte für Y einsetzt und die Gleichung nach X löst. Die Konzentrationswerte können auch einfach geschätzt werden, indem man eine Linie von den Absorptionswerten auf der Y-Achse zu der Kurve zieht, und dann den entsprechenden Wert auf der X-Achse abliest.
Die meisten Mikroplatten-Photometer messen Absorptionswerte. Diese sind definiert als das logrithmische Verhältnis des einfallenden zu austretenden Lichts.
Der Bradford Assay ist eine Mikroplatten-Photometermethode, die auf dem Messen von Absorptionswerten basiert. Die Proteinproben werden zu der Bradfordlösung hinzugefügt. Die Bradfordsubstanz bindet sich dann an das Protein, was zu einer Veränderung des Absorpotionsspektrums führt.
In Experimenten die auf Fluoreszenzmessungen basieren, wird ein Fluorochrom durch eine bestimmte Wellenlänge von Licht aktiviert, welches daraufhin Licht einer anderen Wellenlänge emittiert.
Lichtempfindliche Reagenzien sollte man möglichst dunkel lagern, um ein Ausbleichen zu verhindern, was zum Misslingen des Experimentes führen kann.
Exerpimente die auf Lumineszenz basieren, emittieren Licht durch eine chemische Reaktion, die oft auf Luziferase basiert. Luziferase kann durch verschiedene Quellen gewonnen werden, zum Beispiel aus Glühwürmern. In der Luziferasereaktion wird Licht emittiert wenn Sauerstoff, ATP und Magnesium in verschiedenen Schritten auf die Luziferase treffen.
Experimente mit Lumineszenz haben viele verschiedene Anwendungen. Ein Beispiel ist die Messung der Produktion von freien Sauerstoffradikalen in Krebszellen.
Andere Anwendungen des Mikroplatten-Photometers sind Hochdurchsatzmessungen mit 384 oder 1536-Well Platten. Hier werden Platten durch Roboterarme gefüllt. Ein programmierbarer Roboter kann die Probenfüllung mit hoher Präzesion automatisieren.
Das war die Einführung in die Benutzung von Mikroplatten-Photometern von JoVE. In diesem Video haben wir gelernt was ein Mikroplatten-Photometer ist, wie das Instrument genutzt und programmiert wird, wie man Mikoplatten-Photometerdaten analysiert und welche Anwendungen es gibt. Danke für eure Aufmerksamkeit!
Ein Mikroplatten-Photometer ist ein häufig genutztes Laborinstrument, mit dem viele Proben gleichzeitig gemessen werden können, so als würden viele Experimente zur gleichen Zeit parallel ausgeführt werden.
Dieses Gerät wird häufig zusammen mit Multiwell Platten (zum Beispiel 96-Well Platten) genutzt.
Unabhängig von der Art des Experimentes werden Standardkurven, Positiv- und Negativkontrollen genutzt, um den Messwert der Proben zu ermitteln.
Mikroplatten-Photometer existieren in vielen verschiedenen Formen, Größen und Ausführungen. Viele Mikroplatten-Photometer haben multimodale Ausführungen, damit verschiedene Arten von Versuchen und Messungen durchgeführt werden können. Diese Modalitäten beinhalten zum Beispiel die Messungen von Absorption, Fluoreszenz und Lumineszenz.
Multiwellplatten sind wichtige Bestandteile des Mikroplatten-Photometers. Sie dienen als Reservoirs, die Proben für Messungen fassen. Multiwellplatten können verschiedene Gößen, aber auch verschiedene Welltypen und Wellanzahlen haben. Welche Platte benutzt wird, hängt häufig vom Experiment ab.
Das Ladetablett ist dazu da, um die 96-Well Platte in die Maschine einzuführen.
Eine Computerschnittstelle wird typischerweise verwendet, um das Mikroplatten-Photometer zu programmieren und verschiedene Parameter, wie zum Beispiel die Wellenlänge oder den Modus, auszusuchen. Die Software hat eine Benutzeroberfläche, auf der die jeweilige Platte repräsentiert ist und mit der man aussuchen kann welche Wells zu messen sind.
Mehrkanalpipetten werden oft verwendet um Multiwellplatten zu füllen. Die Reservoirs fassen die Lösungen der Mehrkanalpipette. Einzelne Wells können manchmal jedoch auch mit einer einfachen Pipette gefüllt werden.
Proben und Standards können als Duplikat oder Triplikat gefüllt werden, um eventuellen Pipettierfehlern vorzubeugen. Hier zeigen wir eine Multiwellplatte, die in Triplikaten gefüllt wird.
Die Standardkurve wird mit bekannten Stoffkonzentrationen, die zu verschiedenen Absorptionswerten führen, ermittelt. Diese Daten werden dann genutzt, um eine Kurve zu bestimmen.
Der Blindwert wir verwendet, um zu messen welche probenunabhängigen Absorptionen, zum Beispiel durch Puffer oder Reagenzien, auftreten. Die Werte von diesen Messungen werden als Hintergrundwerte bezeichnet. Die Blindwertmessung wird dementsprechend ohne Probe durchgeführt.
Die Positivkontrolle gibt Aufschluss darüber, ob die Messung funktioniert hat, indem sie ein zu erwartendes Resultat anzeigt. Die Negativkontrolle ist eine Messung in der kein experimenteller Effekt zu erwarten oder zu beobachten ist und sollte deshalb zu keinem Ergebnis führen.
Wenn die Platte fertig vorbereitet ist, wird es Zeit die Proben anzusetzen. Um zu verhindern das die falschen Proben oder Proben in falscher Reihenfolge angesetzt werden, ist es wichtig die Platte in korrekter Position auf der Ladefläche zu positionieren. Man sollte vorsichtig beim Einführen der Platte sein, und die Platte auf keinen Fall in das Instrument zwingen oder sich die Finger einklemmen.
Nach dem Einführen der Platte können verschiedene Parameter, wie zum Beispiel der Modus, die Wellenlänge oder die Reihenfolge der Wells, mit Hilfe der Software bestimmt werden.
Nachdem die Parameter eingegeben sind, wird die Platte gelesen und das Photometer generiert Werte und gibt diese an die Software weiter.
Nach dem Lesen der Platte, wird der Durchschnitt der Blindwertmessungen berechnet und von den Probenwerten, einschliesslich denen der Standardkurve, abgezogen.
Nach der Messwertbestimmung werden die bekannten Konzentrationen des Standards gegen die jeweiligen Messwerte, in unserem Fall Absorpitionen, graphisch dargestellt. Danach kann die Kurve durch lineare Regression berechnet werden. Diese Berechnung kann auch einfach in einem Excel spreadsheet ausgeführt werden.
Der Determinationskoeffizient ist ein statistisches Maß für wie gut die Kurve einen Datenpunkt vorhersagt. Er sollte zwischen 0,9-0,99 liegen. 0,99 ist der bestmöglichste Wert, was bedeutet das die Kurve perfekt mit den Daten übereinstimmt.
Die Kurve mit dem besten Determinationskoeffizienten wird dann genutzt, um die Konzentrationen der gemessen Werte zu bestimmen, indem man deren Absorptionswerte für Y einsetzt und die Gleichung nach X löst. Die Konzentrationswerte können auch einfach geschätzt werden, indem man eine Linie von den Absorptionswerten auf der Y-Achse zu der Kurve zieht, und dann den entsprechenden Wert auf der X-Achse abliest.
Die meisten Mikroplatten-Photometer messen Absorptionswerte. Diese sind definiert als das logrithmische Verhältnis des einfallenden zu austretenden Lichts.
Der Bradford Assay ist eine Mikroplatten-Photometermethode, die auf dem Messen von Absorptionswerten basiert. Die Proteinproben werden zu der Bradfordlösung hinzugefügt. Die Bradfordsubstanz bindet sich dann an das Protein, was zu einer Veränderung des Absorpotionsspektrums führt.
In Experimenten die auf Fluoreszenzmessungen basieren, wird ein Fluorochrom durch eine bestimmte Wellenlänge von Licht aktiviert, welches daraufhin Licht einer anderen Wellenlänge emittiert.
Lichtempfindliche Reagenzien sollte man möglichst dunkel lagern, um ein Ausbleichen zu verhindern, was zum Misslingen des Experimentes führen kann.
Exerpimente die auf Lumineszenz basieren, emittieren Licht durch eine chemische Reaktion, die oft auf Luziferase basiert. Luziferase kann durch verschiedene Quellen gewonnen werden, zum Beispiel aus Glühwürmern. In der Luziferasereaktion wird Licht emittiert wenn Sauerstoff, ATP und Magnesium in verschiedenen Schritten auf die Luziferase treffen.
Experimente mit Lumineszenz haben viele verschiedene Anwendungen. Ein Beispiel ist die Messung der Produktion von freien Sauerstoffradikalen in Krebszellen.
Andere Anwendungen des Mikroplatten-Photometers sind Hochdurchsatzmessungen mit 384 oder 1536-Well Platten. Hier werden Platten durch Roboterarme gefüllt. Ein programmierbarer Roboter kann die Probenfüllung mit hoher Präzesion automatisieren.
Das war die Einführung in die Benutzung von Mikroplatten-Photometern von JoVE. In diesem Video haben wir gelernt was ein Mikroplatten-Photometer ist, wie das Instrument genutzt und programmiert wird, wie man Mikoplatten-Photometerdaten analysiert und welche Anwendungen es gibt. Danke für eure Aufmerksamkeit!
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Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.