Name: Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Bestimmung der Telomerlänge und Telomerase-Aktivität mittels quantitativer Echtzeit-PCR. Diese Technik ermöglicht Forschern, Zellalterungsprozesse und altersassoziierte Erkrankungen besser zu verstehen.

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1. Telomere Länge Protokoll 19 <ol><li> DNA-Isolierung </li></ol> Die meisten DNA Isolierungsverfahren verwendet werden. Unsere Lab zieht Qiagen DNeasy Kit (# 69506) für Blut Quellen. Je nach Quelle der DNA, wie zB bukkal oder anderen Quellen kann eine andere Isolierungsverfahren verwendet werden. <ol start="2"><li> Primer: </li></ol> Alle Primer werden an einer Börse Konzentration 100pmoles/μl in PCR-Wasser verdünnt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Arbeiten Bestände Primer werden frisch zubereitet und sind bei 20 ° C gelagert für einen kurzen Zeitraum (ein paar Monate.) Standard-Primer für Telomere und β-Globin, die SCG verwendet wurden, wie in O&#39;Callaghan et al. 20 . Primer-Sequenzen: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Hinweis: Primer werden auf eine Arbeitskonzentration von 10pmoles/μl verdünnt, vor der Zugabe zur Reaktionsmischung. <ol start="3"><li> Verdünnungsreihe von genomischer DNA: </li></ol> Serielle Verdünnungen von genomischer DNA für Telo und Single Copy Gen (SCG) werden erstellt, um eine Standard-CT-Kurve für den Test zu generieren. Die genomische DNA verwendet wurde aus Lymphozyten aus Blutproben extrahiert. Diese Verdünnungen werden durch Verdünnen DNA mit PCR Klasse H 2 0 zu jeder Konzentration um den Faktor 1,68, um die zwei Sätze von Verdünnungsreihen mit der gleichen genomischen DNA-Ausbeute hergestellt. Die Ausgangskonzentrationen wurden basierend auf Versuch und Irrtum optimiert und müssen angepasst werden, wenn mit verschiedenen Reagenzien, Instrumente, DNA von anderen Spezies, Zelltypen und SCG verwendet. Hinweis: Die serielle Verdünnung unter Verwendung genomischer DNA werden durch vorsichtiges Mischen und einer Wartezeit von mindestens 15 Minuten bis zu einer Stunde befo gemachtre Entnahme von DNA für die nächste Verdünnung. Jede Verdünnung erfordert Zeit für die genomische DNA zu distanzieren. Für die langfristige Lagerung Aliquot serielle Verdünnungen in PCR-Streifen für die Lagerung bei -80 ° C. Jede PCR Streifen wird aufgetaut und einmal, um Frost-Tau-Zyklen, die DNA schädigen können, zu vermeiden verwendet. <ol start="4"><li> Reaktionsansatz für RT-PCR </li></ol> Instrument verwendet: Roche480 Light Cycler Reagenz: Roche Light Cycler sybr-grün Verdünnen Test-DNA-Proben auf eine Endkonzentration von 10 ng / ul. Wir testen mit Konzentration Nanodrop oder Qubit. Wir verdünnen die DNA aus 10ng/μl zur endgültigen 5ng/μl. Wir wissen nicht testen Konzentration wieder. Reaction Komponenten: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 ul </td><td> H20 </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 ul </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 ul </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 ul </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 ul </td></tr><tr><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> DNA oder serielle Verdünnung </td><td> 2 ul </td><td> DNA oder serielle Verdünnung </td><td> 2 ul </td></tr></tbody></table> Hinweis: Master Mix ohne DNA und mit einem Überschuß von 5% bis 10% hergestellt. Sowohl Telo und SCG sind zusammen auf der gleichen Platte mit dem folgenden Programm auszuführen. Um präzise zu testen, mindestens drei Wiederholungen für jede Probe und Kontrolle ausgeführt werden soll. Variationen in der verwendeten Primer kann die Ergebnisse beeinflussen. Unser Protokoll wurde optimiert, um wie folgt auf der Roche480 Light Cycler und unsere Primer arbeiten. Initial denaturieren 10 min Denaturierung 95 ° C Radfahren 95 ° C 10 sec halten 60 ° C 5 sec halten 72 ° C 11 sec halten und einzelne Akquisition Wiederholen 45 bis 55 mal je nach Bedarf 2. Quantitative Telomerase Detection (QTD) Protokoll (Basierend auf QTD Kit von Allied Biotech, Inc. Cat. Nr. MT3012) Auszug Vorbereitung <ol><li> Pellet-Zellen oder Gewebe. </li><li> Waschen Sie einmal mit 1x PBS. </li><li> Repellet und entfernen 1x PBS. * </li><li> Zellpellet in 200 ul 1 x Lysis Buffer für alle 10 5 -10 6 Zellen oder 40-100 mg Gewebe. </li><li> Inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> Spin down die Probe bei 12.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie 160 ul der Überstand in ein frisches Röhrchen und Protein-Konzentration bestimmen. </li><li> Aliquotieren und schnell zu gefrieren die verbleibende Extrakt auf Trockeneis / Ethanol, bei -80 ° C. </li></ol> * In tsein Zustand ist Telomerase in gefrorenen Zellen oder Gewebe für mindestens ein Jahr stabil. Wenn für die Verwendung aufgetaut werden die Zellen sofort in 1 x Lysis Buffer. 2.1. Testkontrollen Hitzeinaktivierung Kontrolle: Für jede Probe Wärmebehandlung eine zusätzliche Kontrolle Extrakt durch Inkubation bei 85 ° C für 10 min vor der Telomerase-Aktivitätstest. Standard-Kurve für TSR Kontrolle Vorlage: Führen Quantitative Real-Time PCR mit Verdünnungen von TSR, ein Oligonukleotid mit einer ähnlichen Sequenz Telomer-Primer mit dem Kit enthalten, um eine Standardkurve zu erzeugen. <ol><li> Bereiten 01.05 serielle Verdünnungen der stock TSR Konzentration (0,5 Amoles / ul) mit Lysepuffer </li><li> Führen Sie die Telomerase Erkennung Standard-Assay unter Verwendung von 1 &amp;mgr; l jeder Verdünnung TSR, einschließlich der Lager-Konzentration. Diese Verdünnungen können bei 4 ° C für mindestens 2 Wochen gelagert werden. </li></ol> 2.2. Telomerase-Aktivität AssayVerwendung QTD Real-Time PCR <ol><li> Für jede Probe, fügen Sie Folgendes in einer PCR-Röhrchen oder dünnwandigen PCR-Platte (Gesamtvolumen 25,0 ul): <ul><li> 12,5 ul 2 x QTD Premix </li><li> 1,0 ul Zelle oder eines Gewebes Extract </li><li> 11,5 ul PCR Qualified Wasser </li></ul></li><li> Nach gründlichem Mischen </li><li> Programm Real-Time PCR Detection Systems entsprechend der unten Programm: - 25 ° C für 20 min (Telomerasereaktion) - 95 ° C für 10 min (PCR anfänglichen Aktivierungsschritt) 35-40 Zyklen von: - 95 ° C für 30 Sekunden (Denaturierung) - 60 ° C für 30 sec (Annealing) - 72 ° C für 30 sec (Erweiterung) </li><li> Zeigen PCR-Röhrchen in den Thermocycler und starten Sie das Programm. </li><li> Sammeln Sie die Schwelle Zyklus oder C T-Wert nach Zyklen Abgang. Der Schwellenwert-Zyklus ist der Zyklus, in dem eine statistisch signifikante Erhöhung der ΔRn zuerst erkannt wird. </li></ol> 2.3. Data Analysis <ol><li> Generatea Standardkurve unter Verwendung der C T-Werte und vergleichen Sie die Telomerase-Aktivität. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Telomere Länge bietet eine einzigartige zelluläre Marker, um die gestressten und alternden Zelle zu studieren und bietet Einblicke in die Mechanismen des Alterns. Seit seiner Rolle in alternden hatte zunächst vorgeschlagen worden, eine Vielzahl von Studien wurden durchgeführt, über die Länge der Telomere zu altern, Langlebigkeit, altersbedingte Krankheiten, Krebs und Stress. Jahrzehntelang war der Goldstandard der Länge der Telomere Messungen Terminal Restriktionsfragmentanalyse mit Southern-Hybridisierung. Doch vor kur...

Telomere sind wiederholenden DNA Hexamer (TTAGGG) Sequenzen an den Enden der Chromosomen gefunden. In jeder Zelle Replikation werden diese Chromosomen-Enden verkürzt. Wenn sie zu kurz werden, können Chromosomen unterziehen Telomerende Fusionen, anomale Rekombination und Abbau. So reicht die Länge der Telomere Wartung spielt eine wichtige Rolle in Chromosom Stabilität und Zellschutz 38. Telomere Länge Wartung ist auch entscheidend für die Gene in der Nähe der Enden der Chromosomen gefunden, da die DNA-Replikation kann nicht bis zum Ende der Chromosomen 1-2 fortzusetzen. Folglich kann Prävention von Telomerverkürzung verbessern Zelle Stabilität. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass die Länge der Telomere mit einem Organismus die Langlebigkeit und krankem Zustand, wie bei Krebs 3-4, Diabetes 5, und Herz-Kreislauferkrankungen 6,7 korreliert ist. Darüber hinaus haben verkürzte Telomere mit übermäßiger Stress oder in Verbindung gebrachtungesunde Lebensweise 8, vielleicht durch die Förderung vorzeitige Zellalterung und Tod 9. Auf der anderen Seite haben einige Studien festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen Telomere und Langlebigkeit und altersbedingte Krankheiten 39, 40, 41. Einer der Zelle angeborenen Mechanismen zum Schutz von Telomerverkürzung ist durch die Aktivierung seiner eigenen Enzym Telomerase Reverse Transkriptase (tert). Dieses Enzym und seine Untereinheit Telomerase RNA (TERC), eine nicht-kodierende RNA, verwenden Sie die Telomere als Vorlage für Telomerwiederholungen auf Chromosom 10 endet hinzufügen. Obwohl Telomerase-Aktivität fehlt aus verschiedenen Arten von Zellen und andere Mechanismen in Telomerelänge Instandhaltungsarbeiten, erhöht Telomeraseaktivität mit erhöhter Telomerelänge korreliert. Telomerase-Aktivierung wurde als einer der Mechanismen, mit denen Zellen auf Schäden reagieren und betonen und vermeiden vorzeitige Alterung und Tod festgestellt. Beispielsweise länger telomeres in einer Population von aschkenasischen Juden mit außergewöhnlicher Lebensdauer 11 wurden nachgewiesen wurden Mutationen in TERC oder tert wurde gezeigt, dass zur tödlichen Krankheit 12 und epigenetische Regulation der Telomerase beitragen hat sich gezeigt, um eine Wirkung auf altersbedingte Krankheiten 13 haben. Seit seiner Entdeckung hat die Länge der Telomere als Biomarker für den Gesundheitszustand in verschiedenen Tiermodellen sowie in Menschen vorgeschlagen worden, aber diese frühen Studien waren schwer zu weit replizieren, da die verwendete Methode war mühsam, langwierig und teuer. Im Jahr 2002 und im Jahr 2009 weiter abgestimmt, vorgeschlagen Cawthon und zeigte eine neue, präzise, ​​schnelle und einfache PCR-basiertes Protokoll, um die Länge der Telomere zu bewerten und weiter zu untersuchen, ihre Rolle in der verschiedene Aspekte der Zellbiologie, Altern und Krankheit 19. Die Wahl der richtigen Telomer Messverfahren für eine Studie ist unerlässlich. Derzeit gibt es verschiedene Verfahren verwendet werden, um die Länge der Telomere zu messen, jedes mit seinem eigenenVor-und Nachteile. Traditionell wird die Länge der Telomere gemessen unter Verwendung der Southern-Blot-Analyse von Terminal Restriktionsfragmente (TRFs), die beinhaltet: a. Verdauen der DNA mit Restriktionsenzymen, die in Telomerwiederholungen nicht geschnitten, um TRFs zu erhalten, b. Southern Blot dieser TRFs wird durch Bestimmung der mittleren TRF Länge mit einem Telomer-Sonden 14, 37 erfolgen. Dieses Verfahren ist zwar sehr genau mit kleinem Variationskoeffizient ist ein direktes Maß und kann vorteilhaft sein, zur Längenmessung Verteilung ist TRF Analyse teuer, arbeitsintensiv und erfordert mindestens 3 ug DNA. Auch dieses Verfahren ist unempfindlich gegenüber kurzen Telomeren und Längenbestimmung durch subtelomeren DNA, die von der Sonde durch das (TTAGGG) n-Sequenzen, wie sie in den 15, 42 detektiert werden kann verwechselt werden. Eine weitere sehr genaue Methode zur Messung Telomerelänge ist Single Telomere Dehnung Länge Analysis (STELA), ein single Molekül PCR basierende Methode, die benötigt nur eine geringe DNA-Menge. Bei diesem Verfahren werden Primer hergestellt, um den G-reichen Überhang am Ende der Chromosomen zu erkennen und zu einer einzigartigen subtelomeren Sequenz auf einem Chromosom, die das Telomer eines Chromosoms spezifisch verstärkt binden. Die resultierende Verstärkung ist dann visualisiert Southern Blot. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie sehr genau und ist in der Lage zu erkennen, kurze Telomere 16 Ausreißer. Leider, denn nicht alle Chromosomen G-reichen Enden haben und eine brauchbare subtelomerischen Sequenz können die Länge der Telomere nur auf bestimmten Chromosomen gemessen werden und diese Messungen können nicht die Länge aller Telomere in der Zelle 15. Eine weitere Methode, die durchgeführt worden ist, ist die Verwendung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonden Telomerelänge erkennen. Quantitative Florescence in situ Hybridisierung (Q-FISH) ermöglicht es uns, Telomere während der Metaphase, wo die st visualisierenaining der Telomere mit einer PNA-Sonde im Verhältnis zu ihrer Größe ermöglicht den Vergleich von Telomeren zwischen spezifischen Chromosomen. Obwohl dieses Verfahren auch für die Zellen in der Interphase verwendet werden, dabei die Telomere für verschiedene Chromosomen können nicht erkannt werden, was stellt eine Beschränkung bei der Messung Telomere in seneszenten oder selten teilenden Zellen 17. Flow-FISH verwendet stattdessen Durchflusszytometrie und ist derzeit die empfindlichste Methode zur Messung der Länge der Telomere von Blutzellen im klinischen Umfeld, aber erfordert hoch qualifizierte Techniker 18. Derzeit nimmt die Standard-Methode zur Messung durchschnittliche Länge der Telomere in unserem Labor Vorteil der Präzision, Empfindlichkeit und einfache quantitative real-time PCR. Dieses Verfahren ermöglicht wurde zur Messung Telomere durch die Entwicklung neuer Primer, die die Synthese von Primer-Dimer-abgeleiteten Produkten, die ansonsten wie es hergestellt worden sind, zu vermeiden,tandard Assay aufgrund der sich wiederholenden Natur der Telomere. Für diesen Test wird die Messung der Telomer-Länge durch die T / S-Verhältnis, die Telomer-repeat Kopienzahl zu single-copy-Gen Zahl dargestellt. Da eine direkte proportionale Beziehung zwischen der Länge der Telomere und die Anzahl der markierten Telomere Primer an die DNA während der Anfangsphase der PCR ist die T / S-Verhältnis direkt proportional zur Länge der Telomere. Die T / S-Verhältnis, indem die Differenz in Ct gemessen wird, kreuzt die fraktionierte Taktzahl bei der die Probe florescence angesammelt ist eine Schwelle, die mehrere Standardabweichungen über der Grundlinie Blüte ist, zwischen den Proben mit Telomer-Primer und Primer SCG 19. Diese Methode hat für seine indirekte Messung der Länge der Telomere, die zu ungenauen Messungen führen können, zum Beispiel kritisiert worden, im Falle von Chromosom Vervielfältigungen oder Kopienzahl Variationen 15. Auch ist der Vergleich zwischen den Studien oft difficult, aber Standard-Oligomere wurden entwickelt, um absolute Länge der Telomere 20 messen. Diese Methode wurde gefördert durch auf Cawthon verbessert, mit einem Monochrom-Multiplex-qPCR-Assay. In diesem Test wurde die PCR bei niedrigeren Temperaturen in den ersten Zyklen ausführen, um Primer-Dimer-Bindung zu vermeiden und die Telomer-und Kontroll-Gen wurden in der gleichen PCR-Röhrchen analysiert werden, um weitere Fehler zu vermeiden. Die resultierenden Telomere Messungen stark mit Telomere durch Southern-Blot-Analyse gemessen TRFs korreliert und höhere Genauigkeit 15, 19, 36. Im Moment ist qRT-PCR die einzige praktische Methode für die Prüfung großer Stichprobenumfang und benötigt nur eine geringe Menge an DNA durchzuführen. Ein wesentlicher Teil dieser Methode ist eine umfassende Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, so dass, wenn es richtig gemacht wird, kann diese Methode wertvolle vergleichende Informationen über die Länge der Telomere zu stellen. Darüber hinaus hatte diese Methode für den Einsatz jenseits Leukozyten zur Messung angepasstTelomere in einer Vielzahl von verschiedenen Geweben 42. Zusätzlich zur weiteren Verständnis der Biologie hinter Telomerelänge Wartung und Interaktionen zwischen den zwei gegenläufige Effekte (dh Telomerverkürzung während der Replikation und Dehnung der Telomerase), begleitet wir die Telomere Verfahren mit einem zusätzlichen Test, der Telomerase-Aktivität misst. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine Telomer-Repeat Amplification Protocol, ein in vitro-Assay. Kurz gesagt, lysiert erhalten, enzymatisch aktive Zellen Telomere auf ein Substrat unter Verwendung von Oligonukleotid-Telomerase synthetisiert, und die Produkte wurden unter Verwendung von PCR in Gegenwart von SYBR Green. Die Ergebnisse wurden dann durch den Vergleich der Proben, Kontrollen Ct Schwellenwerte analysiert. Da Telomerase ist ein wärmeempfindliches Enzym wird eine zusätzliche Wärme behandelten Kontrollgruppe nebeneinander Probe 21 ausgeführt. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Während der Messung die Länge der Telomere können wertvolle Einblicke in die mögliche Rolle der Telomer-Länge in der Pathophysiologie der Alterung und Krankheit zu schaffen, ist die Länge der Telomere nicht eine statische Eigenschaft und weitere Informationen benötigt wird, um Telomer-Funktion zu verstehen. Telomerase-Aktivität Studien hinzufügen können Informationen über die Länge der Telomere Regulationsmechanismen. Zum Beispiel kann die gesteuerte Aktivierung der Telomerase halten Telomere und Zellproliferation, aber die unkontrollierte Aktivierung von Telomerase in Krebs führen. Diese beiden kostengünstige und unkomplizierte Methoden kombiniert hat uns nicht nur mit stärkeren Beweise zu einer Beziehung zwischen Länge der Telomere und Zelle Stabilität, sondern auch einen tieferen Einblick in die möglichen Mechanismen der Verkürzung der Telomere und Erholung. Mit diesen Methoden, die wir hoffen, weiter aufzuklären die Antwort der Zelle auf Alterung und verschiedene Zustände der Zellproliferation mit dem Ziel eines besseren Verständnisses der zentralen mechanistischms der Zellbiologie.

<table><tbody><tr><td>Quantitativer Telomerase-Nachweis </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, gebrauchsfertiger Heißstart-Reaktionsmix für die SYBR Green I-basierte Echtzeit-PCR mit dem LightCycler 480 Instrument</td><td>Roche Diagnostics 4707516</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

telomere und telomerase-aktivität länge; ein yin und yang der zellalterung

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomere sind wiederholenden DNA-Sequenzen an den vorderen Enden der Chromosomen, die unterschiedlich sind in der Länge und im Menschen eine Länge von 15.000 Basenpaaren zu erreichen. Die Telomere dient als bio-Mechanismus des Chromosoms Abrieb bei jeder Zellteilung. Bei einer bestimmten Länge, werden die Telomere zu kurz, um die Replikation, ein Prozess, der auf Chromosom Instabilität oder Zelltod führen können zulassen. Abrieb und Dehnung: Telomere Länge wird durch zwei gegenläufige Mechanismen reguliert. Attrition tritt als jeder Zelle teilt. Im Gegensatz dazu ist Dehnung teilweise moduliert durch die Telomerase, die sich wiederholenden Sequenzen fügt an den Enden der Chromosomen. Auf diese Weise könnte möglicherweise Telomerase Reverse Mechanismus eine alternde und verjüngt die Lebensfähigkeit der Zellen. Dies sind entscheidende Elemente bei der Aufrechterhaltung der Lebensdauer der Zelle und werden verwendet, um die Zellalterung zu beurteilen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode, um die Länge der Telomere in mehrere Gewebe beurteilens und Arten. Dieses Verfahren nutzt zwei zentrale Elemente, die Tandem-Repeat des Telomer-Sequenz und die Empfindlichkeit der qRT-PCR an Differential Kopienzahl der getesteten Proben zu erkennen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Ein Beispiel eines Telomerelänge qRT-PCR-Assay wird in Abbildung 1 gezeigt. Auf der oberen linken Seite, stellen Proben in rot und grün markiert den Standort der getesteten Probanden auf der 96-Well-Platte. Auf der oberen rechten Fensterbereich wird die Verstärkung Kurve demonstriert. Jedes Thema wird durch zwei Tests (Telomere und Single Copy Gen), die dreifach gemacht wird getestet. Aufgrund unterschiedlicher DNA-Kopien in den beiden Assays ausgewählter Individuen erzeugt, erreicht die Anzahl der Zykl...

Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine kurze, genaue und kostengünstige Methode zur Beurteilung der Telomerlänge und Telomeraktivität in mehreren Geweben und Arten bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst genomische DNA für die Bestimmung der Telomerlänge mittels quantitativer Echtzeit-PCR isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Zellen des gleichen Gewebes in einem Puffer zu isolieren und aufzulysen, der die Telomerasefunktion erhält, und die Telomerase anschließend mittels Echtzeit-PCR quantitativ zu messen. Schließlich werden sowohl die Bestimmung der Telomerlänge als auch der Nachweis der Telomeraseaktivität verwendet, um die Beziehungen zwischen Telomerlänge und zellulärer Seneszenz, möglichen Mechanismen der Telomerverkürzung sowie Erholungsreaktionen auf Alterung und Zustände der Zellproliferation zu untersuchen. Ich wurde erstmals mit diesen Methoden vertraut, als ich nach einer schnellen und einfachen Möglichkeit suchte, Ome-Längen und Omera-Aktivität zu messen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Diagnose altersassoziiierter Erkrankungen und vorzeitigen Todes, da sie über den Zellstatus berichtet, der sich auf den Zustand der Organe und die allgemeine körperliche Verfassung widerspiegelt.Der Ablauf dieses Verfahrens wird von Herrn Ur Bogo, einem Techniker meines Labors, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, isolieren Sie DNA aus dem Blut der Versuchsperson mithilfe des Qiagen DNE-Kits, das speziell für Blutproben im letzten Schritt formuliert ist. Eluieren Sie die DNA in PCR-Reinstwasser und bestimmen Sie die Konzentration mittels eines Spektrophotometers.Bereiten Sie anschließend Stammlösungen der PCR-Primer gemäß der Beschreibung von OC Callahan et al für das Einzelkopie-Gen oder SCG-Kontrolle sowie für die Telomere vor, indem Sie diese auf 100 Pikomol pro Mikroliter verdünnen. Unter Verwendung von PCR-Reinstwasser, während die Primer sich hydratisieren, stellen Sie serielle Verdünnungen der isolierten DNA her. Beginnen Sie damit, die DNA-Stammlösung mit PCR-Reinstwasser auf eine Startkonzentration von 6,1 Nanogramm pro Mikroliter für die Telomer-Reaktionen und 1,8 Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen.Bei SCG-Reaktionen die Verdünnung mindestens 15 Minuten ruhen lassen, bevor mit der nächsten fortgefahren wird. Nach 15 Minuten die nächste Verdünnung gemäß der hier gezeigten Tabelle vorbereiten. Dies für jede aufgeführte Verdünnung wiederholen.Als Nächstes richten Sie die PCR-Ansätze in einer Standard-PCR-Platte ein. Jede Probe zusammen mit den SCG-Kontrollen wird im Triplikat durchgeführt. Geben Sie zunächst sechs µL PCR-graduiertes Wasser in jedes Reaktionsgefäß und fügen Sie dann 10 µL der Cyber-Green-Reaktionsmischung hinzu.Fügen Sie dann die Primer in den hier angegebenen Mengen den entsprechenden Vertiefungen hinzu. Verdünnen Sie anschließend ein Aliquot jedes Stammlösungs-Primers zehnfach mit PCR-Reinstwasser, sodass die Endkonzentration 10 Pikomol pro Mikroliter beträgt. Geben Sie abschließend zwei Mikroliter der seriell verdünnten DNA in die entsprechenden Vertiefungen und verschließen Sie die Platte mit einem klebenden Kunststofffolienüberzug, um den Inhalt abzudichten.Platzieren Sie dann die Platte in die Echtzeit-PCR-Maschine. Bereiten Sie anschließend ein Programm auf dem Roche four 80 light cycler vor, das mit einer 10-minütigen Denaturierung bei 95 Grad Celsius beginnt. Danach folgen Zyklen mit 95 Grad Celsius für 10 Sekunden, 60 Grad Celsius für fünf Sekunden und 72 Grad Celsius für 11 Sekunden.Führen Sie insgesamt 50 Zyklen lang nach jedem Zyklus Messungen mit Cyber Green durch. Starten Sie anschließend das Programm, sobald der Thermocycler abgeschlossen hat. Stellen Sie die CT-Linie am Beginn der exponentiellen Kurve ein und notieren Sie die Zyklenwerte, bei denen jede Probe die Schwellenlinie überschreitet.Berechnen Sie anschließend das Verhältnis der Zyklenzahlen zwischen den Telomer- und den Einzelkopie-Gen-Proben. Da das Telomer mehrere Bereiche aufweist, die in jedem Zyklus amplifiziert werden, sind die CT-Werte des Telomers kleiner als die des Einzelkopie-Gens, was zu einem Verhältnis von weniger als eins führt. Schließlich berechnen Sie die Telomerlänge basierend auf den Arbeiten von Terry Etal, wobei ein Telomer pro Einheit des Einzelkopie-Gen-Verhältnisses einer mittleren Telomerlänge von 4.270 entspricht.Basispaare in Leukozyten führen Telomeraseaktivitätsmessungen mithilfe des quantitativen Telomerase-Nachweises von Allied Biotech durch. Um die Messungen zu beginnen, sammeln Sie 10 hoch 5 bis 10 hoch 6 periphere Blutzellen und waschen Sie diese in PBS. Anschließend pelletieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 500 × g. Danach resuspendieren Sie das Pellet in 200 µL eines 1 x Lysepuffers aus dem Assay-Kit und inkubieren es 30 Minuten auf Eis.Nach der Inkubation die Proben bei 12.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Um das Zelltrümmersediment zu erhalten, 160 Mikroliter des resultierenden Überstandes in ein frisches Gefäß überführen und den verbleibenden Überstand in einem Ethanol-Trockeneis-Bad schnell einfrieren, bevor er zur erneuten Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert wird. Anschließend die Proteinkonzentration des Überstandes mittels Standard-BCA-Assay bestimmen.Für jede entnommene Probe berechnen Sie die für den Assay erforderliche Proteinmenge basierend auf dem Arbeitsbereich des Telomerase-Kits. Da Telomerase ein hitzeempfindliches Enzym ist, inaktivieren Sie anschließend die Hälfte jeder Probe durch Erhitzen als negative Kontrolle, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 85 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie danach die quantitative Standardkurve durch serielle Verdünnung des Stammansatzes vor.TSR-Oligonukleotide werden durch Verdünnung der Stammlösung im Verhältnis eins zu fünf mit Lysepuffer fünfmal verdünnt. TSR-Oligonukleotide besitzen eine identische Sequenz zu Telomerprimern und liegen in bekannter Konzentration vor. Als Nächstes wird der Master-Mix vorbereitet, der pro Probe aus 12,5 Mikrolitern zweifach konzentriertem quantitativen Telomerase-Detektions-Premix und 11,5 Mikrolitern PCR-Grad-Wasser besteht, und anschließend gemischt.Danach pipettieren Sie 24 Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jedes verwendete Reaktionsgefäß. Sobald die Master-Mix-Lösung verteilt ist, geben Sie je einen Mikroliter der jeweiligen Vorlage – entweder der Standardprobe, einer erhitzten und aktivierten Probe oder einer normalen Probe – in die Vertiefungen. Versiegeln Sie anschließend die Platte mit einem klebenden Kunststofffolienstück und mischen Sie die Proben durch Vortexen.Danach in das Echtzeit-PCR-Erkennungssystem geben. Das PCR-Programm so einrichten, dass es bei 25 Grad Celsius für 20 Minuten beginnt. Während dieser Zeit findet die Telomerase-Reaktion statt.Danach 95 Grad Celsius für 10 Minuten für den initialen PCR-Aktivierungsschritt. Führen Sie dann 40 Zyklen mit jeweils 95 Grad Celsius für 30 Sekunden, 60 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 30 Sekunden durch, um die Telomer-Vorlagen zu amplifizieren, die während der 20 Minuten bei 25 Grad Celsius hinzugefügt wurden.Führen Sie schließlich das Programm aus und sammeln Sie die Schwellenzykluswerte für jede Probe. Erstellen Sie dann eine Standardkurve unter Verwendung der CT-Werte und verwenden Sie diese, um die Telomeraseaktivität zu berechnen. Bei den gezeigten Proben.Hier sind Echtzeit-PCR-Ergebnisse eines 65-jährigen Probanden. Das Telomer-Gen, dargestellt durch die hellroten Linien, erreicht seine exponentielle Kurve nach etwa 27 Zyklen. Der zweite Satz von Linien repräsentiert die Amplifikation eines Einzelkopie-Gens, das nur eine Kopie im Genom besitzt und daher weniger Kopien aufweist als die durch die roten Linien dargestellten Telomerproben.Außerdem erreicht das Einzelkopie-Gen nach etwa 31 Zyklen seine exponentielle Kurve. Die braunen Linien stellen die 33 Standardkurve dar, die auf einer seriellen Verdünnung von bekannten Probenkonzentrationen basiert. Die Standardkurve für den Logarithmus der Konzentration im Vergleich zu Schwellenwerten ist hier dargestellt.Eine Gerade bestätigt, dass die serielle Verdünnung korrekt gemessen und aufgetragen wurde. Die Ergebnisse der Echtzeit-PCR-Analyse werden anschließend zur Abschätzung der Telomerlänge verwendet. Eine Telomer-zu-Einzelgen-Kopie-Ratio entspricht einer mittleren Telomerlänge von 4.270 Basenpaaren in Leukozyten; aus diesen Daten ergibt sich ein Verhältnis von 0,87, was einer durchschnittlichen Länge von 3.715 Basenpaaren entspricht und für eine Person dieses Alters als mittlere Telomerlänge gilt.Anhand der Ergebnisse aus den quantitativen Echtzeit-PCR-Assays kann ein Zusammenhang zwischen der Telomeraseaktivität und dem Verhältnis von Telomer- zu Einzelgenkopien aufgezeigt werden. Dieses Diagramm zeigt einen starken Zusammenhang zwischen den beiden Assays nach der Etablierung der Methode. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Alterungsforschung, um die zelluläre Seneszenz in Modellorganismen, bei Patientenkohorten und in verschiedenen Organsystemen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Telomerase wird im Gehirn von Neugeborenen und auch in verschiedenen Regionen des erwachsenen Gehirns exprimiert. Wir präsentieren einen ungiftigen, zeitsparenden TRAP-Assay zur Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen Regionen des Mäusegehirns und zum Nachweis von Unterschieden in der Telomeraseaktivität zwischen männlichen und weiblichen Mäusegehirnen.

Telomerase-Aktivität in den verschiedenen Regionen der Maus Gehirn: Nicht-radioaktive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP)-Assay

Telomer und Telomerase spielen eine wesentliche Rolle beim Altern und bei der Tumorentstehung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie zwei murine induzierbare Telomerase-Knock-in-Allele erzeugt und wie sie in den Studien zur Gewebedegeneration/-regeneration und Krebs verwendet werden können.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge unter Verwendung einer modifizierten terminalen Restriktionsfragmentanalyse diskutiert, die eine schnelle und effiziente direkte Messung der Telomerlänge ermöglicht. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zellquellen von DNA zur Quantifizierung der Telomerlänge angewendet werden.

Modifizierte terminale Restriktionsfragmentanalyse zur Quantifizierung der Telomerenlänge mittels In-Gel-Hybridisierung

Hier beschreiben wir detailliert das Protokoll zur Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion, wobei der Schwerpunkt auf der Optimierung verschiedener Leistungsparameter des TAGGG-Telomerlängen-Assay-Kits liegt, wie z.B. Puffermengen und Sondenkonzentrationen.

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der relativen Telomerlänge (TL) mit dem monochromen Multiplex-Assay der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (MMqPCR) vor. Der MMqPCR-Assay ist eine wiederholbare, effiziente und kostengünstige Methode zur Messung von TL aus menschlicher DNA in populationsbasierten Studien.

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung 

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT...

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

DNA-Methylierung ist in der Lage, ein stabiles Niveau der Genexpression aufrechtzuerhalten und dynamische Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen zu ermöglichen. Wir beschreiben Techniken, die es ermöglichen, genspezifische Veränderungen der DNA-Methylierung und die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Genexpression zu untersuchen.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Bestimmung der Telomerlänge und Telomerase-Aktivität mittels quantitativer Echtzeit-PCR. Diese Technik ermöglicht Forschern, Zellalterungsprozesse und altersassoziierte Erkrankungen besser zu verstehen.

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

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