Überwachung dendritische Zellen mit Migration ¹⁹ F / ¹ H Magnetic Resonance Imaging

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Migration dendritischer Zellen in den drainierenden Lymphknoten mittels nicht-invasiver Fluor-Magnetresonanztomographie oder MRT in Kombination mit konventioneller Protonen-MRT sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst aus dem Knochenmark gewonnene dendritische Zellen der Maus präpariert und die vollständig differenzierten Zellen mit fluorreichen Partikeln markiert werden. Im zweiten Schritt werden die fluormarkierten Zellen intrakutan in die Hintergliedmaßen einer Maus verabreicht, um eine effiziente Transmigration der verabreichten Zellen zu gewährleisten.

Als nächstes wird die anatomische Region von Interesse durch Fluor- und Protonen-MRT abgebildet, um die Wanderung der dendritischen Zellen von der Haut zu den drainierenden Lymphknoten zu überwachen. Letztlich kann die Migration der dendritischen Zellen aus dem Anwendungsgebiet in den drainierenden Lymphknoten mittels Fluor-MRT sichtbar gemacht werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Zellverfolgungstechniken, wie z. B. solchen, die Eisenoxid-Nanopartikel erfordern, besteht darin, dass kohlenstoffgebundene Bodenbeläge in allen lebenden Organismen praktisch nicht vorhanden sind.

Dies führt zu vollständigen, hintergrundfreien Bildern und einer vollständigen Zellselektivität nach der Anwendung von fluormarkierten Zellen in vivo. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z.B. welchen Einfluss molekulare Kandidaten auf die Migration dendritischer Zellen in vivo haben. Die Methode wird von Yulia Kovski, Technikerin, und Helma VIIs, einer leitenden Wissenschaftlerin aus meinem Labor, demonstriert. Am Tag 10 der dendritischen Zellkultur im Knochenmark

Aktivieren Sie die dendritischen Zellen mit LPS für 24 Stunden. Markieren Sie die dendritischen Zellen auch während dieser Zeit mit einem Millimolar Fluor reich pro Fluor 15 Krone fünf Etherpartikel, um zu bestätigen, dass die dendritischen Zellen erfolgreich markiert wurden, überprüfen Sie die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die mit Fluor markierten Zellen werden hier als rote Ereignisse im Vorwärts- und Seitwärts-Streudiagramm dargestellt, und die unmarkierten Zellen werden als blaue Ereignisse dargestellt.

Nächste Position, eine C 57 black sechs Maus in einer Halterung und dann eine 0,5 Milliliter Tuberkulinspritze mit einer 26 1/2 Gauge Nadel mit fluoreszenzmarkierten dendritischen Zellen in einem Volumen von 50 bis 100 Mikrolitern beladen. Führen Sie nun die Nadel vorsichtig in die oberen Hautschichten in den Hintergliedmaßen des Tieres ein, um die Zellen zu verabreichen. Nach der Betäubung der Mausposition liegt das Tier bliegend auf dem Mausbett des Kleintier-MRT-Scanners.

Nachdem Sie das Tier auf der bildgebenden Halterung und den Verbindungen zum Überwachungssystem befestigt haben, bewegen Sie die Halterung in die Mitte der Protonen-Fluor-HF-Spule, um die korrekte Positionierung des Tieres und des Scanners zu bestätigen. Und später die Planung der Bildscheibengeometrie. Erfassen Sie Scout-Bilder in drei Standardausrichtungen mit schnellen und niedrig aufgelösten Bildaufnahmemethoden in der MR-Scanner-Software.

Stimmen Sie die HF-Spule auf die Protonenresonanzfrequenz und auf die Fluorresonanzfrequenz ab. Verwenden Sie den Abstimmmonitor des Tier-MR-Scanners, um die charakteristische Impedanz der Spule auf 50 Ohm einzustellen. Legen Sie als Nächstes die erforderlichen automatischen Systemeinstellungen fest, einschließlich Shimming zur Feinabstimmung der Homogenität der Frequenzanpassung des Magnetfeldsystems, um die HF auf die spezifische LA-Frequenz des MRT-Systems für Protonen und Referenzverstärkung abzustimmen.

Um die HF-Amplitude anzupassen, richten Sie ein turbo rare 3D-Protokoll für den Protonenscan ein, das eine TR von 1500 Millisekunden und eine TE von 53 Millisekunden, eine Matrix von 400 x 200 x 200 und einen seltenen Faktor von 16 verwendet. Passen Sie das Sichtfeld mit Hilfe der Scout-Bilder an. Starten Sie dann den Scan.

Laden Sie eine einzelne Impuls-FID-Sequenz mit einem TR von mindestens 1000 Millisekunden, öffnen Sie dann den Editierscan und stellen Sie den Zellkern in der Editiermethode der Toolbox auf Fluor ein. Deaktivieren Sie die automatische Referenzverstärkung mit dem Go-Setup. Starten Sie die Messung, ohne die Daten aufzuzeichnen, um ein MRT-Signal in Echtzeit anzuzeigen.

Stellen Sie die Grundfrequenz so ein, dass der spektrale Fluorpeak im Erfassungsfenster bei null Hertz zentriert wird. Wählen Sie dann aus, wenden Sie die Grundfrequenz an und drücken Sie jetzt Stopp. Klonen Sie das turbo rare 3D-Protokoll aus dem vorherigen Protonenscan.

Gehen Sie zur Editiermethode und deaktivieren Sie dann die automatische Referenzverstärkung, wie gerade im Edit-Scan gezeigt. Stellen Sie den Fluorkern ein und ändern Sie dann die Matrix auf 1 28 x 64 x 64 und den seltenen Faktor auf mindestens 40. Wenn die Scans abgeschlossen sind, ziehen Sie den Maushalter vom MRT-Scanner zurück und verwenden Sie das Ansichtsmenü, um die Fluorbilder mit Protonenbildern zu überlagern.

Nachdem Sie die Maus geopfert haben, entfernen Sie den beliebten Lymphknoten von Interesse und legen Sie ihn in ein fünf Millimeter langes NMR-Röhrchen, das 100 Mikroliter 2 % PFA enthält. Platzieren Sie dann die Röhre in einer Fluorspektroskopiespule und bewegen Sie die Spule in die ISO-Mitte des Magneten. Stimmen Sie die HF-Spule auf die Fluorresonanzfrequenz ab und passen Sie dann auf dem Abstimmmonitor des Tier-MRT-Scanners die charakteristische Impedanz der Spule auf 50 Ohm in der Shimming-Toolbox an.

Setzen Sie alle Shim-Parameter auf Null und drücken Sie Anwenden. Laden Sie dann eine einzelne Impuls-FID-Sequenz mit einem TR von mindestens 1000 Millisekunden. Öffnen Sie den Edit-Scan, und stellen Sie den Zellkern auf Fluor ein.

Starten Sie nun mit go setup die Sequenz, stellen Sie die Grundfrequenz so ein, dass der Fluorspektralpeak in der Mitte des Erfassungsfensters bei null Hertz liegt, und wenden Sie die Grundfrequenz an. Stellen Sie dann den Impulsabschwächer erneut ein, um das Signal zu maximieren und eine 90-Grad-Anregung zu erreichen. Wenn das Signal maximal ist, drücken Sie Stopp.

Legen Sie schließlich in der Bearbeitungsmethode die Durchschnittswerte je nach Signal zwischen 64 und 256 fest und verwenden Sie dann die Go-Pipeline. Beginnen Sie mit der Einnahme 18 bis 21 Stunden nach der intrakutanen Anwendung. Fluormarkierte dendritische Zellen wandern in den drainierenden popalen Lymphknoten.

Die Bewegung der dendritischen Zellen über die Lymphgänge in den drainierenden öffentlichen Lymphknoten kann durch Überlagerung der protonenanatomischen Bilder mit den fluorierten dendritischen Zellen nachvollzogen werden. Auf den Bildern sind die dendritischen Zellen als Fluor-MRT dargestellt. Signal in rot, während die Lymphknoten und Lymphgänge auf dem protonanatomischen MRT-Bild in Graustufen dargestellt sind. Um das Ausmaß der Migration dendritischer Zellen in die drainierenden Lymphknoten zu quantifizieren, werden die Lymphknoten extrahiert und eine Fluor-MRS durchgeführt, wie gerade gezeigt, wenn das von jedem Lymphknoten erhaltene Fluorsignal mit dem Fluorsignal verglichen wird, das von einer unterschiedlichen Anzahl dendritischer Zellen erhalten wird, die mit fünf Ätherteilchen pro Fluor 15 Krone markiert sind, wie in dieser Kalibrierkurve dargestellt. Für dieses repräsentative Experiment kann die Anzahl der fluormarkierten dendritischen Zellen abgeleitet werden, die den drainierenden Lymphknoten erreichen.

Es kann geschätzt werden, dass 7,5 mal 10 bis zum vierten dendritischen Zellen, die nicht mit Antigen beladen waren, den linken Lymphknoten erreichten, während 3,6 mal 10 bis zum fünften Antigen beladene dendritische Zellen den rechten Lymphknoten erreichten. Diese Frage kann zwar Aufschluss über die molekularen Mechanismen der Migration von Immunzellen unter normalen Bedingungen geben, aber auch in Tiermodellen, wie z. B. bei Autoimmunerkrankungen, eingesetzt werden. Darüber hinaus erstrecken sich die Implikationen dieser Technik auf den Bereich der Krebstherapie.

Alle identifizierten molekularen Ziele können verwendet werden, um dendritische Zellen für die Tumortherapie zu manipulieren.