Name: Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Skelettmuskelfasern aus Zebrafisch-Embryonen für detaillierte Morphologie- und Proteinlokalisationsanalysen. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelfaserstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.

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Die Autoren möchten sich die Mitglieder des Dowling Labor (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta und William Telfer), die zur Entwicklung der Technik und der Herstellung des Manuskripts beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von der Taubman-Institut, der Abteilung für Pädiatrie an der University of Michigan, und zum Teil aus Zuschüssen von der Gesellschaft für Muskeldystrophie (JJD MDA186999) und den National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835) finanziert.

1. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser (Dauer: 1 h) Deckbeschichtung ermöglicht eine schnelle Einschwingzeit myofiber und Haftung. Dies kann während der Dissoziationsstufe der myofiber Trennung (Schritt 2 unten) durchgeführt werden. <ol><li> Schneiden und Parafilm auf dem Boden einer 60 mm Petrischale (alle Marken). </li><li> Zeigen Mikroskop Deckglas rutscht (12 mm Durchmesser) auf Parafilm in einer 60-mm-Gewebekulturschale oder sie einzeln in einzelnen Wells der 24-Well-Platten. </li></ol> Anmerkung 1: Diese kleine, runde Deckgläser helfen, myofiber Zahlen konzentrieren und reduzieren überschüssige Antikörper Nutzung. Hinweis 2: Andere Größe Deck funktionieren wird, jedoch werden die Volumina der Reagenzien und Embryonen verwendet werden, müssen entsprechend angepasst werden. <ol start="3"><li> Pipette 50-200 ul Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%) auf jedem Deckglas in der Petrischale. </li><li> Lassen Sie die Deckgläser zu sitzen mindestens eine hour bei 37 ° C. Längere Inkubationen nicht negativ beeinflussen Ergebnisse. </li><li> Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Deckglas und zweimal waschen mit einem Minimum von 100 ul 1x PBS. </li><li> Deck ermöglichen zu trocknen. </li><li> Die Deckgläser sind nun bereit für Muskelfasern. </li></ol> Hinweis 3: Um die Sterilität zu gewährleisten, kann die Beschichtung in einer Haube und autoklaviert Deckgläschen durchgeführt werden. Anmerkung 4: Halten Sie die 60 mm Petrischale mit Parafilm auf der Unterseite. Dieses Setup wird während myofiber Beschichtungs-und Immunmarkierung (später Stufen) verwendet werden. Alternative 1: Statt der Deckbeschichtung unmittelbar vor der Anwendung kann eine beschichtete Deck Lager verwendet werden. Eine 60 mm-Petrischale, die ein Minimum von 2 ml Poly-L-Lysin kann bei 4 ° C mit zahlreichen Deck gespeichert werden. Bei dieser Alternative beginnen Sie mit Schritt 1,5 bis die Deckgläser für Muskelfasern zu verarbeiten. Alternative 2: Wir haben auch Decklack in Poly-L-Ornithin. Tseiner ist arbeitsintensiv, aber ist nützlich für längerfristige Kultivierung da Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern können UV behandelt sein. Mit UV-Behandlung und sorgfältige steriler Technik Live Muskelfasern können in der Regel in der Kultur 4-7 Tage aufrecht erhalten werden. 2. Die Dissoziation von Zebrafischembryonen und Oberflächen von Muskelfasern (Dauer: 1 bis 3 Std.) Hinweis: Die Standard-Protokoll gilt besten bis 3 dpf (Tage nach der Befruchtung) Embryonen. <ol><li> Übertragen Zebrafischembryonen in ein Standard 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel überschüssige Wasser Fische wie möglich. Typischerweise können 10-20 Embryos pro Rohr, wenn auch weniger eingesetzt werden. Verwendung von mehr als 20-25 Embryonen führt oft zu einer Herstellung von übermäßiger Dichte. <ol><li> Chorion vor der Dissoziation entfernen, manuell mit Nr. 5 Pinzette. Alternativ wird chemische Chorion Entfernung mit 10-15 min Pronase Behandlung erreicht. Typischerweise wird die vorherige Entfernung der Chorion nur notwendig, wenn vor der Bestätigung des MUTant Phänotyp oder Morphologie erforderlich ist, oder bei der Verwendung Bühnen, auf denen Embryonen werden natürlich von ihren Chorion geschlüpft. </li></ol></li><li> In 900 ul der CO 2-unabhängigen Medien an der Röhre, die die Embryonen. </li><li> 100 l Collagenase Typ II, Endkonzentration 3,125 mg / ml (Auf Collagenase-Lösung mit 31,25 mg / ml in 1x PBS), um die Dissoziation zu beginnen. Collagenase IV auch zur Spaltung verwendet werden. </li><li> Drehen Embryonen auf einem Orbitalschüttler und verreiben alle 30 min bei RT mit einem Pipetman P1000 für das Verreiben. </li></ol> Hinweis 2: Embryo Dissoziation sorgfältig zu überwachen; über oder unter Dissoziation (vor allem über) sind die häufigsten Gründe für die Protokoll-Fehler. Zeiten für die Verdauung wird je nach Intensität der Verreibung, die Anzahl der Embryonen pro Röhrchen und Alter des Embryos variieren. Es ist auch oft weniger (im Vergleich zu Wildtypen) für Embryonen aus der Skelettmuskulatur Mutanten. Anmerkung3: Durchschnittlich Verdauungszeit pro Embryoalter: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h und 4 dpf = 2-2,5 Stunden. <ol start="5"><li> Stoppen Sie die Verdauung, wenn keine ganze Embryonen sind sichtbar, aber feste Stücke sind noch sichtbar - das ist wichtig, overdigestion verhindern. </li><li> Zentrifugenröhrchen mit dissoziierten Embryonen bei 0,8 bis 2,3 g für 3-5 min auf Pellet-Zellen. </li><li> Überstand entfernen von pelletierten Zellen und waschen 2x mit CO 2 unabhängige Medien. </li><li> Add frischen CO 2 unabhängige Medien, um Zellen zu resuspendieren. 1 ml wird typischerweise für Preps von 10-20 Embryonen verwendet. Die Lautstärke kann auf Basis Embryo Anzahl skaliert werden. </li><li> Mit einer Pipette P1000, vorbei Embryo Suspension durch ein 70-um-Filter. Dies hilft, entfernen Sie unerwünschte Ablagerungen aus dem prep. </li></ol> Anmerkung 4: Embryo Suspension kann ein zweites Mal durch ein 40-um-Filter gefiltert, um weiter zu entfernen unerwünschte Ablagerungen werden. Von einem Doppelfiltration, ist die Wiederherstellung approximLICH 800 ul von einem Ausgangsvolumen von 1 ml. <ol start="10"><li> Füllen Sie ungefähr 50-100 ul myofiber Suspension in jede Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas. </li></ol> Anmerkung 5: Führen Sie den Schritt 2.9 in die Petrischalen mit Parafilm auf dem Boden, die zuvor vorbereitet. Der Parafilm hält die Aussetzung myofiber Verlaufen die beschichtete Deckgläser. Halten Petrischalen abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern. <ol start="11"><li> Lassen Muskelfasern auf ca. 1 Stunde auf die beschichtete Deckgläser bei Raumtemperatur zu regeln. </li></ol> Anmerkung 6: Muskelfasern beginnen, innerhalb von 5-10 min zu begleichen. Doch für gute myofiber Anhang, mindestens 1 h (02.01 h) wird empfohlen. Zulassen von Muskelfasern, für längere begleichen werden nicht schaden, die prep. Für längere Inkubationen (inkl. Übernachtung), können Antibiotika zu den Medien geben. Mit Antibiotika und steriler Technik lebenden Kulturen typischerweise für 1-2 Tage gehalten. <ol start="12"><li> Live-myofibers kann an dieser Stelle beobachtet werden. Muskelfasern aus Embryonen 2 dpf und wird später als Rillen und längliche Zellen (Fig. 1) zu sehen. An diesem Punkt sind nun bereit für die Live-Muskelfasern Analyse oder zur Immunmarkierung. </li></ol> Anmerkung 7: Die Skelettmuskulatur von 1 dpf Embryonen nicht als Lang und deutlich quergestreiften Fasern plattieren. Stattdessen sind groß myoballs sichtbar. Zusätzlich wird während der Pelletierung Phase Post-Dissoziation (Schritt 2.6), 1 dpf myoballs müssen für ein Minimum von 8 min bei 5.000 g zentrifugiert, um ein Pellet zu erreichen. Für die Analyse von Embryonen in diesem Stadium, ist es empfehlenswert, den transgenen Linie EGFP speziell im Skelettmuskel 23 zu verwenden. Dies wird Identifikation von Zellen aus Muskel Herkunft im Vergleich zu anderen Quellen zu ermöglichen. 3. Fluoreszenz-Immunfärbung von Dissoziierte Zebrafisch Muskelfasern (Dauer: ca. 1 Tag) 3.1. Immunomarkierung <ol><li> Einen Teil entfernenMedien von Muskelfasern auf die beschichtete Deckglas geklebt </li><li> Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd oder Methanol. Für PFA, ½ Volumen der Medien entfernen und ersetzen mit der gleichen Menge an PFA. Fix für 10 min bei RT, dann entfernen Gesamtvolumen, ersetzen mit 50-100 ul PFA, und befestigen Sie für weitere 10 min. Alkoholfixierung, eiskaltem Methanol oder Aceton bei 4 ° C für 10 min oder 5 min aufgebracht werden, auf. </li><li> Muskelfasern mindestens 3-5x mit 1x PBS oder 1x PBS plus 0,1% Tween waschen. Durchschnittliche Waschvolumen beträgt 50-100 ul pro Deckglas. </li><li> In Blocklösung zu Muskelfasern (Arbeits Lager) und Inkubation von 20-60 min bei Raumtemperatur. Blockierungslösung wird je nach den primären und sekundären Antikörper variieren. Die beiden häufigsten im Labor verwendet werden, sind (1) 1 × PBS, 2 mg / ml BSA, 1% Schafserum, 0,25% Triton X-100 final und (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) und 5% Schaf / Ziegenserum. </li><li> Blockierlösung entfernen und hinzufügen primären Antikörper entweder b verdünntVerriegelungslösung oder PBS. Muskelfasern über Nacht Inkubation bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass Sie entweder Parafilm oder wickeln Sie sie in Frischhaltefolie die Petrischale mit den myofiber belasteten Deckgläser mit einem Antikörper beschichtet. Kleine Stücke von angefeuchteten Papiertuch kann hinzugefügt werden, um eine befeuchtete Kammer zu erzeugen. </li><li> Entfernen primären Antikörper aus Deckgläser Deckgläser und waschen 3-5x für 5 min mit PBS oder Blocking-Lösung. </li><li> In sekundären Antikörper in geeigneter Konzentration in 1x PBS oder Blockierungslösung für 1-2 h bei RT verdünnt. </li><li> Sekundärantikörper entfernen und waschen Muskelfasern 3-5x in PBS für jeweils 5 min bei RT. </li></ol> 3.2. Montagedeck <ol start="9"><li> 1-2 Tropfen Antifade Reagenz auf einen Objektträger. </li><li> Sorgfältig Abholung der beschichteten und immunolabled Deckglas mit einer Pinzette und Ort (Muskelfasern nach unten) das Deckglas auf der Antifade Reagenz auf dem Objektträger. </li></ol> Anmerkung 1: Die Beachtung der Ausrichtung der coated Deck ist kritisch. <ol start="11"><li> Legen 1-2 Kimwipes auf eine harte feste Oberfläche. Invertieren Sie schnell den Schlitten mit den beschichteten Deckgläser auf der Antifade Reagenz ruht und legen Sie es (Deckglas nach unten) auf der Kimwipes. </li><li> Wenden Sie leichten Druck auf die Ecken des Mikroskop-Objektträger, um überschüssige Antifade entfernen und eine gute Abdichtung zu bilden zwischen dem Schieber und Deckglas </li><li> Veröffentlichung der verbleibende, für 5-10 min bei RT trocknen Antifade, dann die Muskelfasern sind bereit, Bild (2A und B) oder bei 4 ° C </li></ol> 4. Live Cell Calcium Imaging Mit GCaMP3 Lebendzellexperimenten auf Muskelfasern vor der Fixierung (nach Schritt 2.10) durchgeführt werden. Das folgende Protokoll beschreibt die Live-Darstellung in Muskelfasern exprimieren GCaMP3 24, eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator, der Skelettmuskel-spezifischen Zebrafisch-α-Aktin-Promotor (PSKM) 23 ausgedrückt. AlternativDieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um Calcium-Indikator-Farbstoffe, wie Fura-2 verwendet werden. <ol><li> Inject Embryonen mit PSKM: GCaMP3 bauen an der 1-2 Zell-Stadium </li><li> Bei 3 dpf, sammeln und bereiten Larven Muskelfasern wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Muskelfasern zu ermöglichen für ein Minimum von 1 Stunde zu halten. Für diese Technik bereitet Deckgläschen in 24-Well-Platten erforderlich. </li><li> Überschüssiges Material vorsichtig entfernen, und 300 ml frisches CO 2 unabhängige Medien bei RT. </li><li> Beachten Zellen unter einem inversen Mikroskop. GCaMP3 positive Muskelfasern sollte unter grünen Fluoreszenz sichtbar sein. </li><li> Richten Sie die Kamera für die Aufnahme, wenn gewünscht. </li><li> Bereiten Sie eine 30 mM Koffein-Lösung in CO 2 unabhängige Medien. Um Zellen zu stimulieren, sanft Pipette 300 ul von Koffein-Lösung in die gut unter Vergrößerung. Innerhalb von 5-10 sec, soll GCaMP positiven Muskelfasern Koffein mit einem schnellen Anstieg der Fluoreszenz (Fig. 3) zu reagieren. Myofibten kann auch schrumpfen. Zu beachten ist, induziert Koffein Calcium-Freisetzung aus den Retikulum speichert 25. Andere Mittel, wie KCl 26 und Ryanodin-4, verwendet werden, um induzierbare Calciumfreisetzung zu untersuchen. </li></ol>

<ol><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).</li>
<li>Bannister, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+myoplasmic+gap%3A+recent+developments+in+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 275-283 (2007).</li>
<li>Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+and+disorders+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Nerve%22%5BJournal%5D)">Genetic defects and disorders at the neuromuscular junction.</a> Brain Nerve. 63, 669-678 (2011).</li>
<li>Lanner, J. T., Georgiou, D. K., Joshi, A. D., Hamilton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors%3A+structure%2C+expression%2C+molecular+details%2C+and+function+in+calcium+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors: structure, expression, molecular details, and function in calcium release.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity%3A+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+steps+of+myofibril+assembly%3A+integrins+pave+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 293-298 (2009).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ. Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Pharmacol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Barresi, R., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystroglycan%3A+from+biosynthesis+to+pathogenesis+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dystroglycan: from biosynthesis to pathogenesis of human disease.</a> J. Cell Sci. 119, 199-207 (2006).</li>
<li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+frequencies+of+inherited+neuromuscular+diseases-a+world+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world survey.</a> Neuromuscul. Disord. 1, 19-29 (1991).</li>
<li>Nance, J. R., Dowling, J. J., Gibbs, E. M., Bonnemann, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies: an update.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 12, 165-174 (2012).</li>
<li>Bassett, D. I., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+muscular+dystrophy+and+congenital+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for muscular dystrophy and congenital myopathy.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 265-270 (2003).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 252-256 (2000).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, M,, Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Zebrafish+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease%3B+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 1727-1743 (2005).</li>
<li>Schredelseker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+1a+subunit+is+essential+for+the+assembly+of+dihydropyridine-receptor+arrays+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The beta 1a subunit is essential for the assembly of dihydropyridine-receptor arrays in skeletal muscle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 17219-17224 (2005).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., Low, S. E., Busta, A. S., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+MTMR14+is+required+for+excitation-contraction+coupling%2C+developmental+motor+function+and+the+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling, developmental motor function and the regulation of autophagy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 2668-2681 (2010).</li>
<li>Schredelseker, J., Dayal, A., Schwerte, T., Franzini-Armstrong, C., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+restoration+of+excitation-contraction+coupling+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1-null+zebrafish+relaxed+is+an+exclusive+function+of+the+beta1a+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor beta1-null zebrafish relaxed is an exclusive function of the beta1a subunit.</a> J. Biol. Chem. 284, 1242-1251 (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Dev. Biol. 192, 289-299 (1997).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-sense+mutations+in+the+dihydropyridine+receptor+beta1+gene%2C+CACNB1%2C+paralyze+zebrafish+relaxed+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Non-sense mutations in the dihydropyridine receptor beta1 gene, CACNB1, paralyze zebrafish relaxed mutants.</a> Cell Calcium. 39, 227-236 (2006).</li>
<li>Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevation+of+intracellular+calcium+in+smooth+muscle+causes+endothelial+cell+generation+of+NO+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 6529-6534 (1997).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((accordion%2C+a+zebrafish+behavioral+mutant%2C+has+a+muscle+relaxation+defect+due+to+a+mutation+in+the+ATPase+Ca2%2B+pump+SERCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">accordion, a zebrafish behavioral mutant, has a muscle relaxation defect due to a mutation in the ATPase Ca2+ pump SERCA1.</a> Development. 131, 5457-5468 (2004).</li>
<li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
<li>Adams, B. A., Tanabe, T., Mikami, A., Numa, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+charge+movement+restored+in+dysgenic+skeletal+muscle+by+injection+of+dihydropyridine+receptor+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intramembrane charge movement restored in dysgenic skeletal muscle by injection of dihydropyridine receptor cDNAs.</a> Nature. 346, (1990).</li>
<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine widerstreitenden Interessen.

Zebrafische sind ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Muskelentwicklung und Funktion in vivo 25,27,28. Sie haben auch gezeigt, als ein wertvolles Gut für die Modellierung menschlichen Muskelerkrankungen 14,15,20,29. Während große Schritte unternommen wurden, um die Nutzung und Anwendung der Zebrafisch für die Untersuchung der Muskelfunktion und Muskelerkrankungen voranzubringen, gibt es eine ständige kritische Notwendigkeit, Werkzeuge, die mehr in die Tiefe...

Die Skelettmuskulatur ist ein hoch spezialisiertes Gewebe für die Erzeugung der für die Motilität notwendig Kontraktionskräfte verantwortlich. Die Kontraktion wird durch einen Prozess wie Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung, die elektrische Signale an Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern 1,2 wandelt bekannt initiiert. Intrazelluläre Calcium-Freisetzung aktiviert die Sarkomer zu verkürzen und zu erzeugen Kraft. Die vielen spezifischen Komponenten der molekularen Maschinen für die Vermittlung der neuromuskulären Synapse Getriebe 3 EG-Kupplung 4,5, und Aktin-Myosin-abhängigen Kontraktionen 6 verantwortlich weiterhin die anhaltende Gegenstand intensiver Forschung. Darüber hinaus Proteine, die die Muskelmembran während der Kontraktion 7,8 und dieser mittelbaren Signalisierung zwischen der myofiber und der extrazellulären Matrix 7,9 stabilisieren wurden identifiziert und untersucht im Detail. Mutationen in mehreren Genen, die für ein Muskelstrukturnd Funktion haben als Ursachen der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen identifiziert ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Diese Krankheiten, allgemein als Skelett Myopathien und Muskeldystrophien, basierend auf klinischen und histopathologischen Merkmalen klassifiziert, werden mit Muskelschwäche, lebenslange Behinderung und frühe Sterblichkeit 10,11 verbunden. Der Zebrafisch hat sich als ein hervorragendes System zur Modellierung und Untersuchung der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen 8,12,13 sein. Es wurde eingesetzt, um neue Gen-Mutationen 8 validieren, definieren neue Aspekte der Krankheit Pathophysiologie 14,15, zu erkennen und neue Therapieansätze 15,16. Die Leistung des Zebrafisches zur Untersuchung menschlicher Muskelerkrankung bezieht sich auf die große Anzahl von Nachkommen, die rasche Entwicklung der Muskelstruktur und-funktion, die optische Klarheit des Zebrafischembryos, und der Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation der EntwicklungszebraFisch 17. Wir und andere 12,18,19 haben vor kurzem eine einfache Technik für die schnelle und effiziente Isolierung von Muskelfasern aus dem Zebrafisch-Entwicklung entwickelt. Diese Methode wurde die Prüfung von Muskelfasern näher, als durch ganze Embryo Analyse zur Verfügung gestellt werden aktiviert. Die Technik hat sich für die Charakterisierung von Protein subzelluläre Lokalisation 20 als auch für die Identifizierung von wichtigen histopathologischen Merkmale als Teil der Validierungsstudien in neu entwickelten Krankheitsmodelle 21 genutzt. Darüber hinaus können isolierte Muskelfasern zusätzlich für Live-Bildgebung und für elektrophysiologische Studien 22, Techniken, die für die Abfrage der Schlüsselaspekte der Muskelfunktion ermöglichen verwendet werden. Das spezifische Protokoll für myofiber Isolierung sowie zwei Beispiele für nachfolgende analytische Experimente ist in den übrigen Teilen des Manuskripts detailliert.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Kulturplatte</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Unabhängiges Medium</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS004186</td><td>Los 41H12764</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>8% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Schafserum</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&Alpha;-Actinin Antikörper</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RYR Antikörper</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Koffein</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der embryonalen zebrafisch-larven-und skelett muskelfasern aus dissoziierte vorbereitungen

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Der Zebrafisch hat sich als ein wertvolles Modellsystem für die Erforschung der Skelettmuskelfunktion und für das Studium der menschlichen Muskelerkrankungen sein. Trotz der vielen Vorteile, die durch in vivo-Analyse von Skelettmuskel im Zebrafisch angeboten, die Visualisierung der komplexen und fein strukturierten Protein Milieu für die Muskelfunktion verantwortlich, insbesondere im gesamten Embryos, kann problematisch sein. Dieses Hindernis ergibt sich aus der geringen Größe des Zebrafisch-Skelettmuskel (60 um) und der noch geringeren Größe des Sarkomers. Hier beschreiben wir und zeigen, eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Skelett Muskelfasern von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Wir berücksichtigen auch Protokolle, die Postvorbereitungstechniken für die Analyse von Muskel-Aufbau und Funktion zu veranschaulichen. Insbesondere haben wir ausführlich die anschließende immunzytochemische Lokalisation von Skelettmuskelproteine ​​und die qualitative Analyse der Calcium-Freisetzung stimuliert via Live-Zelle Kalzium-Imaging. Insgesamt ist dieses VideoArtikel bietet eine unkomplizierte und effiziente Methode für die Isolierung und Charakterisierung von Zebrafisch-Skelett-Muskelfasern, eine Technik, die eine Leitung für unzählige nachfolgende Studien der Muskelstruktur und-Funktion bietet.

Fluoreszenz-Immunmarkierung von Muskelfasern (Fig. 2) Bilder, die erwarteten Fluoreszenzmarkierungsmuster von Muskelfasern immun nach erfolgreicher Isolierung und Beschichtung. Die Muskelfasern wurden mit entweder Anti-Ryanodin-Rezeptor (1:100) (2A) oder anti-α-Actinin (1:100) (2B) Antikörpern markiert worden sind, und zeigen die Immunfärbung der Triade und der Z-Bande auf. Sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor 555 (1:500). Bilder,...

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Skelettmuskelzellen aus embryonalen und larvalen Zebrafischen effizient zu isolieren. Dazu werden zunächst mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser vorbereitet. Ein bis vier Tage nach der Befruchtung werden die Zebrafischembryonen dissoziiert. Anschließend werden aus den dissoziierten Embryonen isolierte Myofasern auf die Poly-Lysin-beschichteten Deckgläser aufgebracht.Schließlich werden die Myofasern fixiert, gefärbt und zur Analyse von Muskelproteinen bildlich erfasst. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die subzelluläre Lokalisation von Muskelproteinen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Analyse ganzer Embryonen liegt darin, dass sie eine detailliertere Untersuchung der Morphologie und Physiologie einzelner Muskel­fasern ermöglicht.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Muskelbiologie zu beantworten, beispielsweise solche, die mit der subzellulären Proteinstofflokalisation zusammenhängen, und sie kann mit der Calcium-Bildgebung an lebenden Zellen kombiniert werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Validierung von Zebrafisch-Modellen für Muskelerkrankungen, da sie zur Visualisierung pathognomonischer struktureller Anomalien im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden kann. Außerdem kann sie dazu beitragen, neue Aspekte von Muskelerkrankungen zu identifizieren.Die Pathogenese mittels dieser Methode kann Einblicke in die Muskelstruktur und -funktion liefern. Sie kann außerdem auf andere Untersuchungen wie menschliche Skelettmuskelkrankheiten angewendet werden. Um die Dissoziation von Zebrafisch-Embryonen vorzubereiten, bereiten Sie Deckgläser vor, indem Sie Paraffin auf den Boden einer 60 Millimeter Petrischale schneiden und platzieren.Danach Deckgläser auf das Parfum geben und 50 bis 200 Mikroliter Poly-Lysin-Lösung auf jedes Deckglas pipettieren. Die Deckgläser bei 37 Grad Celsius mindestens eine Stunde lang inkubieren, anschließend die Polylysin-Lösung entfernen und die Deckgläser zweimal mit jeweils 100 Mikrolitern PBS waschen. Die Deckgläser trocknen lassen und danach in einer abgedeckten Schale aufbewahren.Zur Embryodissoziation. Überführen Sie 10 bis 23 Tage nach der Befruchtung befindliche Zebrafischeier in ein Standard-Zentrifgenröhrchen mit 1,5 Milliliter Fassungsvermögen und entfernen Sie so viel überschüssiges Fischwasser wie möglich. Geben Sie mit einer Pipette 900 Mikroliter kohlenstoffdioxidunabhängiges Medium in das Röhrchen.Gegeben Sie anschließend 100 Mikroliter einer 3,125 Milligramm pro Milliliter-Kollagenase, zwei oder vier Lösung zu, um die Dissoziation zu beginnen. Schwenken Sie die Embryonen bei Raumtemperatur auf einem Rotationskorb und pipettieren Sie alle 30 Minuten mit einer P-1000-Pipette den Probeninhalt um, um eine Überverdauung zu verhindern, wenn keine ganzen Embryonen mehr sichtbar sind, jedoch noch feste Bestandteile vorhanden sind. Beenden Sie die Reaktion durch Zentrifugation der Proben bei 0,8 bis 2,3 ×g für drei bis fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie zwei Mal mit kohlendioxidunabhängigem Medium. Lassen Sie die Suspension durch einen 70 µm-Filter laufen, um Verunreinigungen zu entfernen. Geben Sie etwa 50 bis 100 µL der Myofasern-Suspension auf jedes mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckglas. Lassen Sie die Myofasern eine Stunde bei Raumtemperatur sedimentieren, nachdem Sie die Myofasern gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll fixiert und immunmarkiert haben.Die Deckgläser, indem man zunächst einen bis zwei Tropfen Antifa-Reagenz auf einen Objektträger gibt. Mit einer Pinzette vorsichtig ein Deckglas aufnehmen, umdrehen und auf die Tropfen des Anti-Fade-Reagenz auf dem Objektträger platzieren. Danach ein bis zwei Tücher auf eine harte feste Unterlage legen und den Objektträger schnell mit dem Deckglas nach unten auf die Tücher stülpen.Leichten Druck auf die Ecken des Objektträgers ausüben, um überschüssiges Antifa-Reagenz zu entfernen und eine dichte Verbindung zwischen Objektträger und Deckglas zu erzeugen. Die Objektträger fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen, bevor sie entweder direkt abgebildet oder bei vier Grad Celsius gelagert werden. Hier dargestellt: Myofasern, die immunofluoreszent gegen den Anodyne-Rezeptor und Alpha-Aktinin markiert sind, zeigen die Triaden und die Z-Scheiben jeweils.Wir haben in früheren Studien isolierte Myofasern verwendet, um die subzelluläre Lokalisation von Muskelproteinen zu bestimmen. Um die Lokalisation chimärer exprimierter Transgene zu untersuchen und spezifische Parameter der Myofasern, einschließlich ihrer Größe, zu definieren. Diese Abbildung zeigt eine normale durch Koffein induzierte Kalziumfreisetzung in Myofasern, die den PSKM-GCaMP3-Konstrukt exprimieren.Die im Textprotokoll beschriebene Technik kann verwendet werden, um die Erregungs-Kontraktions-Kopplung über Live-Bildgebung zu untersuchen. Mithilfe dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Live-Kalzium-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob Defekte in der Erregungs-Kontraktions-Kopplung nach ihrer Entwicklung vorliegen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Muskelerkrankungsforschung, um Validierungsstudien neu identifizierter Muskelerkrankungsgene zu erforschen und neuartige Aspekte der Pathogenese von Muskelerkrankungen zu bestimmen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das individuelle milde FBS aus Zebrafisch-Embs isoliert.

analysis-embryonic-larval-zebrafish-skeletal-myofibers-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Der Zebrafisch ist mittlerweile ein etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug zur Modellierung von Muskeldystrophien, angeborenen Myopathien und verwandten neuromuskulären Erkrankungen. Doppelbrechung und berührungsevoziertes Fluchtverhalten sind zwei gängige nicht-invasive Assays, die verwendet werden, um den Grad der Muskeldesorganisation und der Beeinträchtigung des Bewegungsapparates von Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung zu bestimmen.

Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

In dieser Studie beschreiben wir eine einfache Methode zur Durchführung von Evans Blue Dye (EBD) Analysen an Zebrafischlarven.  Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Charakterisierung der Integrität der Skelettmuskulatur und die Abgrenzung von Zebrafischmodellen für Muskeldystrophie und eine wertvolle Methode für die Entwicklung neuartiger Therapeutika.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um Muskelfunktionen und -krankheiten zu untersuchen. Während der frühen Embryogenese beginnen Zebrafische regelmäßige Muskelkontraktionen, die ein rhythmisches Schwimmverhalten erzeugen, das sich verändert, wenn der Muskel gestört wird. Hier beschreiben wir einen berührungsevozierten Reaktions- und Fortbewegungsassay, um die Schwimmleistung als Maß für die Muskelfunktion zu untersuchen.

Mit Touch-evozierte Reaktion und Locomotion Assays zur Beurteilung der Muskelleistung und Funktion in Zebrabärbling

Die Finite-Elemente-Analyse ist ein häufig verwendetes Werkzeug, um die mechanische Leistung von Strukturen unter Last zu untersuchen. Hier wenden wir seine Verwendung an, um die Biomechanik des Kiefers des Zebrafisches zu modellieren.

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Lernen Sie die Isolierung von Skelettmuskelfasern aus Zebrafisch-Embryonen für detaillierte Morphologie- und Proteinlokalisationsanalysen. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelfaserstudien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

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