Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Skelettmuskelfasern aus embryonalen und larvalen Zebrafischen effizient zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser vorbereitet werden, dann werden ein bis vier Tage nach der Befruchtung die Zebrafischembryonen dissoziiert. Dann werden Myofasern, die aus den dissoziierten Embryonen isoliert wurden, auf die Polylysin-Deckgläser plattiert.

Schließlich werden die Myofasern fixiert, gefärbt und für die Analyse von Muskelproteinen abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine subzelluläre Lokalisation von Muskelproteinen durch Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ganzembryonenanalyse besteht darin, dass sie eine detailliertere Untersuchung der Morphologie und Physiologie einzelner Muskelfasern ermöglicht.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Muskelbereich zu beantworten, z. B. solche, die sich auf die Lokalisierung subzellulärer Proteine beziehen, und sie kann mit der Kalziumbildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Validierung von Zebrafischmodellen für Muskelerkrankungen, da sie zur Visualisierung pathognomonischer struktureller Anomalien im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten verwendet werden kann. Es kann auch verwendet werden, um neue Aspekte von Muskelerkrankungen zu identifizieren.

Pathogenese: Mit dieser Methode kann Aufschluss über die Struktur und Funktion der Muskeln gegeben werden. Es kann auch auf andere Studien angewendet werden, z. B. auf Erkrankungen des menschlichen Skeletts. Um sich auf die Dissoziation von Zebrafischembryonen vorzubereiten, bereiten Sie Deckblätter vor, indem Sie Parfum schneiden und auf den Boden einer 60-Millimeter-Petrischale legen.

Legen Sie dann Glas-Deckgläser auf das Parfum und pipettieren Sie 50 bis 200 Mikroliter Polylycine-Lösung auf jedes Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Polylysinlösung entfernen und zweimal mit 100 Mikrolitern PBS waschen. Lassen Sie die Deckgläser trocknen und bewahren Sie sie dann in einer abgedeckten Schüssel auf.

Für die Dissoziation von Embryonen. Übertragen Sie Zebrafischembryonen 10 bis 23 Tage nach der Befruchtung in ein Standard-Zentrifugenröhrchen von 1,5 Millilitern und entfernen Sie so viel überschüssiges Fischwasser wie möglich. Pipettieren Sie 900 Mikroliter kohlendioxidunabhängiges Medium in das Röhrchen.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter Kollagenase mit 3,125 Milligramm pro Milliliter hinzu, zwei oder vier Lösungen, um die Dissoziation zu beginnen. Drehen Sie die Embryonen auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur und verwenden Sie alle 30 Minuten ein P 1000 Rohr Pepin, um die Probe zu iterieren, um eine Überverdauung zu verhindern, wenn keine ganzen Embryonen sichtbar sind, aber feste Stücke vorhanden sind. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Proben drei bis fünf Minuten lang bei 0,8 bis 2,3 g pelletieren.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn zweimal mit kohlendioxidunabhängigem Medium. Führen Sie die Suspension durch einen 70-Mikrometer-Filter, um Schmutz bei etwa 50 bis 100 Mikrolitern Myofasersuspension auf jeden mit Poly L Lysin beschichteten Deckglas zu entfernen. Lassen Sie die Myofasern eine Stunde lang bei Raumtemperatur absetzen, nachdem Sie die Myofasern fixiert und immunmarkiert haben, und montieren Sie sie mit dem Textprotokoll.

Der Deckmantel lässt sich verblenden, indem zuerst ein bis zwei Tropfen Antifa-Reagenz auf einen Objektträger aufgetragen werden. Nehmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig ein Deckglas auf, drehen Sie es um und legen Sie es auf die Tropfen des Anti-Fade-Reagenzes auf dem Objektträger. Legen Sie dann ein bis zwei Taschentücher auf eine harte feste Oberfläche und drehen Sie den Objektträger schnell auf die Gewebe um.

Üben Sie leichten Druck auf die Ecken des Objektträgers aus, um überschüssiges Antifa-Reagenz zu entfernen und eine dichte Abdichtung zwischen dem Objektträger und dem Deckglas zu bilden. Lassen Sie die Objektträger fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen, bevor Sie sie abbilden oder bei vier Grad Celsius lagern. Hier zeigen Myofasern, die immunfluoreszierend gegen den Anodynrezeptor und Alpha-Actinin markiert sind, die Triade bzw. das Zand.

Wir haben in früheren Studien isolierte Myop-Fasern verwendet, um die subzelluläre Lokalisation von Muskelproteinen zu bestimmen. Untersuchung der Lokalisation chimärer exprimierter Transgene und Definition spezifischer Myofaserparameter einschließlich der Größe. Diese Abbildung zeigt die normale koffeininduzierte Kalziumfreisetzung in Myop-Fasern, die das PSKM GCaMP 3-Konstrukt exprimieren.

Die Technik, wie sie im Textprotokoll beschrieben ist, kann verwendet werden, um die Anregungskontraktionskopplungsapparatur mittels Live-Bildgebung abzufragen. Nach diesem Verfahren ist dies der Fall. Andere Methoden wie die Live-Calcium-Bildgebung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. gibt es Defekte in der Erregungskontraktionskopplung nach ihrer Entwicklung? Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Erforschung von Muskelerkrankungen den Weg, um Validierungsstudien neu identifizierter Gene für Muskelerkrankungen zu untersuchen und neue Aspekte der Pathogenese von Muskelerkrankungen zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die einzelnen milden FBS von Zebrafisch-Ems isolieren können.