Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Transkriptionsregulatoren beliebiger Gene unter Verwendung eines einfachen Hochdurchsatz-Transfektionsprotokolls und eines hausgemachten Dual-Glow-Luciferase-Assays. Dies wird erreicht, indem zunächst ein einzigartiger Satz von dualen Luciferase-Reporterplasmiden entworfen und kloniert wird. Diese Plasmide werden in Mikrotiterplatten mit Plasmiden aus einer DNA-Expressionsbibliothek in 2 9 3 T-Zellen transfiziert, so dass jede Vertiefung mit einem Plasmid mit einer einzigen Bibliothek transfiziert wird.

Nach 48 Stunden wird die Luciferase-Aktivität von Firefly untersucht, gefolgt von einem Test der Vanille-Luciferase-Aktivität. Der letzte Schritt besteht darin, das Aktivitätsverhältnis von Glühwürmchen zu Vanille-Luciferase zu berechnen. Letztendlich die relative Induktion des interessierenden Gens als Reaktion auf jede Bibliothek.

Das Gen wird durch das Verhältnis der Aktivität von Glühwürmchen zu Vanille-Luciferase in jeder Vertiefung nach plattenbasierter Normalisierung abgeleitet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Reporter-Assay-Protokollen besteht darin, dass sie in der Lage ist, schnell und mit minimalem Personal- und Kostenaufwand funktionelle Daten für eine große Anzahl von Genen zu generieren. Einen Tag vor der Transfektion, die als erster Tag des Screenings bezeichnet wird, werden 2 9 3 T-Zellen in 96 gesetzt.

Well-Plattenzellen werden auf eine Konzentration von 1,5 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter dimensioniert, gezählt und resuspendiert. In DMEM, das 14%FBS enthält, gießen Sie die Zellen in ein steriles Reservoir. Platzieren Sie das Reservoir mit sechs 96-Well-Platten mit klarem Boden und eine Schachtel mit Filterpipettenspitzen auf dem Roboterdeck des automatisierten Liquid Handlers.

Für jede zu siebende Bibliotheksplatte sollten zwei Platten mit Zellen platziert werden. Geben Sie 100 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung jeder Platte für eine Dichte von 1,5 mal 10 Zellen pro Vertiefung. In dieser Demonstration werden drei Bibliothekstafeln gezeigt.

Daher werden sechs Zellplatten vorbereitet, die Zellplatten werden zwei Minuten lang bei 50-fachem G zentrifugiert, wobei niedrige Rampengeschwindigkeiten verwendet werden, um eine gleichmäßige Zelldichte in jedem Well zu gewährleisten. Dieses Bild zeigt, wie die plattierten Zellen nach der Zentrifugation aussehen sollten. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid.

Zur Herstellung der Glühwürmchen- und Vanille-Reporterplasmide verdünnen Sie jedes auf fünf Nanogramm pro Mikroliter in endotoxinfreiem Wasser in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Kombinieren Sie die Verdünnungen in einem Verhältnis von fünf bis drei Glühwürmchen zu Vanilleplasmid nach Volumen. Pipettieren Sie die kombinierten Plasmide in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, wobei 17 Mikroliter pro Bibliotheksplatte abgegeben werden, plus zwei bis 10 Mikroliter Überschuss in jede Vertiefung, die Zellen werden am zweiten Tag des Screenings transfiziert.

Um dieses Verfahren für jede Bibliotheksplatte zu beginnen, mischen Sie 107,5 Mikroliter op-Defekt bei Raumtemperatur mit 4,3 Millilitern serumfreiem Medium, einer Verdünnung von eins bis 40 in einem Polystyrolröhrchen, inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, geben Sie 44 Mikroliter pro Bibliotheksplatte in jede Vertiefung einer 96-Well-Polystyrol-V-Bodenplatte ab. Legen Sie die DNA-Platte der Bibliothek, die verdünnte Opt-Effektplatte, die Reporterplasmidplatte und eine Schachtel mit Pipettenspitzen auf das Aspirat des Roboterdecks. 17 Mikroliter Reporterplasmide, 43 Mikroliter verdünnter opt-Effekt und 26 Mikroliter Bibliotheks-DNA, wobei zwischen jeder Aspiration ein Luftspalt von fünf Mikrolitern eingefügt wird.

Die DNA der Bibliothek sollte zuletzt aspiriert werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Geben Sie den Inhalt der Spitzen in eine neue Plattenabdeckung aus Polystyrol mit V-Boden und stellen Sie ihn 20 Minuten lang beiseite, damit sich Lipid-DNA-Komplexe bilden können. Wenn Sie mehrere Bibliotheksplatten durchtrennen, ersetzen Sie die Pipettenspitzen und die Bibliotheksplatte und wiederholen Sie den Vorgang nach 20 Minuten. Decken Sie die opt effect DNA-Mischplatte auf und platzieren Sie sie mit zwei Platten mit 2 9 3 T-Zellen auf dem Roboterdeck mit einer einzigen Schachtel Pipettenspitzen.

Aspirieren Sie 80 Mikroliter der opt-effect-DNA-Mischung und geben Sie langsam 40 Mikroliter pro Vertiefung für jede Zellplatte ab. Decken Sie die Zellen ab, nachdem die DNA-Mischung mit opt-Effekt zu den Zellen in allen Platten hinzugefügt wurde. Die Platten 30 Minuten lang bei 1.200 mal G zentrifugieren.

Stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator und inkubieren Sie die Zellen vier bis sechs Stunden lang. Während dieser Inkubation bereiten Sie frische Medien vor, indem Sie 12 Milliliter DMEM mit 10 % FBS und 10 Mikrogramm Ciprofloxin pro Milliliter mischen. Gießen Sie für jede transfizierte Bibliotheksplatte frisches Medium in ein steriles Reservoir.

Legen Sie als Nächstes zwei Kartons mit Roboterspitzen, eine einzelne Platte mit Zellen, das Reservoir mit dem Frischmedium und ein Abfallreservoir auf das Roboterdeck. Anschließend werden 100 Mikroliter Medium aus den Zellen abgesaugt und in den Abfallbehälter gegeben, der teilweise mit 70 % Ethanol gefüllt ist. Mit frischen Spitzen werden 100 Mikroliter Frischmedium abgesaugt und langsam auf die Zellen abgegeben.

Stellen Sie die Platten für 48 Stunden wieder in den Inkubator. Es werden die Glühwürmchen- und Vanille-Luciferase-Assays durchgeführt. 48 Stunden nach der Transfektion am vierten Tag des Screenings für jede Bibliotheksplatte werden acht Milliliter mit drei x Firefly Assay Puffer und 12 Milliliter mit drei x Vanilla Assay Puffer aus ihren jeweiligen Stammlösungen hergestellt. Geben Sie 82 Mikroliter Firefly Assay Puffer in jede Vertiefung einer 96 Well V Bodenplatte für jede zu untersuchende Library Plate ab.

Geben Sie auf ähnliche Weise 122 Mikroliter Vanille-Assay-Puffer in jede Vertiefung einer weiteren 96-Well-Platte mit V-Boden. Legen Sie für jede zu untersuchende Platte beide Assay-Puffer beiseite. Legen Sie eine Schachtel mit Pipettenspitzen, ein Abfallreservoir und zwei Platten mit Zellen, die von derselben Bibliotheksplatte transfiziert wurden, auf das Roboterdeck, saugen Sie 60 Mikroliter Medium aus jeder Platte ab und entsorgen Sie sie in dem Abfallbehälter, der teilweise mit 70 %igen Ethanol-Abdeckplatten gefüllt ist, und stellen Sie ihn beiseite.

Als nächstes platzieren Sie zwei Schachteln mit Pipettenspitzen. Die Platte mit drei x Firefly-Assay-Puffer und einem Satz Zellplatten auf dem Roboterdeck. Aspirieren Sie 40 Mikroliter mit drei x Glühwürmchen-Assay-Puffer und geben Sie ihn in die erste Zellplatte, wobei Sie ihn gründlich mischen.

Umstellung auf neue Pipettenspitzen. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Zellplatte. Stellen Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, um die Lyse abzuschließen.

Zeichnen Sie die Lumineszenz aus jedem Well jeder Zellplatte eine Sekunde lang pro Well auf dem Luminometer auf. Bringen Sie die Platten wieder in das Roboterdeck zurück. Legen Sie zwei Schachteln mit Pipettenspitzen, die Platte mit drei x Assay-Puffer und einen Satz Zellplatten auf das Roboterdeck.

Aspirieren Sie 60 Mikroliter mit drei x Vanille-Assay-Puffer und geben Sie ihn in die erste Zellplatte. Gründlich mischen. Umstellung auf eine neue Schachtel mit Pipettenspitzen.

Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Zellplatte. Erfassen Sie die Lumineszenz aller Platten auf einem Luminometer. Jede Vertiefung wird eine Sekunde lang aufgezeichnet.

Typische Luciferase-Werte für eine einzelne Halbplatte sind in diesen Tabellen aufgeführt. Das Lumineszenzverhältnis von Glühwürmchen zu Erneuerung oder F zwei R-Verhältnis für jede Vertiefung wird berechnet, indem die Anzahl des Glühwürmchensignals durch die Anzahl der laufenden Erneuerungssignale dividiert wird, und die Ergebnisse sind in Feld C dargestellt. Feld D zeigt den Induktionswert für jede Vertiefung, berechnet durch Division des F zwei R-Verhältnisses der Vertiefung durch das durchschnittliche F zwei R-Verhältnis der Platte, ohne die höchsten und niedrigsten 25 % der Bohrlöcher. Die Induktionswerte sollten über Replikate für eine einzelne transfizierte Bibliotheksplatte gemittelt werden.

Und Gene, die Alpha-Synuclein mehr als dreifach induzieren oder unterdrücken, gelten als Treffer. Beachten Sie, dass der 32-fache Induktor in der Vertiefung H zwei in diesem repräsentativen Ergebnis, das hier gezeigt wird, eine grafische Darstellung der Induktionswerte für die einzelne Platte ist, wobei die Vertiefung H zwei blau hervorgehoben ist. Hi.H two ist ein neuronaler Transkriptionsfaktor, der bisher nicht mit der Alpha-Synuclein-Expression in Verbindung gebracht wurde.

Es ist wichtig zu überprüfen, ob das Screening innerhalb des linearen Bereichs der Reporterassays durchgeführt wird, so dass Klone, die eine erhöhte Expression verursachen, gemessen werden, da eine erhöhte Luciferase-Aktivität zu diesem Ende Zellen mit zunehmenden Mengen an Glühwürmchen- und Vanille-Luciferase-Plasmiden unter der Kontrolle des starken H-C-M-V-I-E-Promotors und Assays transfiziert wurden. Mit diesem Protokoll wurde beobachtet, dass die Glühwürmchenaktivität über einen breiten Wertebereich linear bleibt. Während die Kurve für die Vanilleaktivität oberhalb von 15 Nanogramm pro Vertiefung abflacht.

Es ist auch wichtig, die Assays unmittelbar nach dem Inkubationsschritt durchzuführen, um Nichtlinearität aufgrund von Substratverarmung zu vermeiden. Ein zeitlicher Verlauf des Zerfallssignals für den Glühwürmchen-Luciferase-Assay zeigte eine signifikante Glühwürmchen-Luziferase-Aktivität bis zu einer Stunde nach Zugabe von Reagenzien unter Verwendung dieses Protokolls, 7.670 menschliche Gene wurden gescreent und 68 neue Regulatoren von Alpha-Synuclein wurden schließlich in den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen identifiziert. Jede horizontale Linie stellt das Induktionsverhältnis eines einzelnen Gentreffers im Vergleich zu einem kontrollierten GFP-neutralen Induktor dar.

Blaue Linien stellen positive Induktoren dar, während die einzige rote Linie einen Suppressor darstellt, die Induktionswerte werden berechnet, da das Verhältnis des Alpha-Synuclein-Promotors, der die Luciferase-Aktivität von Glühwürmchen antreibt, zu dem CMV-Promotor, der die ausgeführte Luciferase-Aktivität jedes Treffers antreibt, normalisiert auf denselben Luciferase-Konstrukt-Assay unter Verwendung eines GFP-Induktors Nach diesem Verfahren. Andere Methoden wie quantitative PCR in Verbindung mit weiteren Überexpressions- und Knockdown-Assays können durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die identifizierten Treffer das endogene Ziel regulieren.