Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteinbindungsregionen über Chromatin nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Protein an die DNA vernetzt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA zu fragmentieren.

Anschließend wird das DNA-gebundene Zielprotein immunpräzipitiert und anschließend eluiert. Im letzten Schritt wird die Vernetzung rückgängig gemacht und die DNA isoliert. Letztendlich dient die Chromatin-Immunpräzipitation dazu, die Lokalisation der Proteinbindung über das gesamte Genom hinweg aufzuzeigen.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik beantworten, beispielsweise die Identifizierung und Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen in einem bestimmten Gewebe oder einer Zelllinie. Die Zellen für dieses Verfahren werden in Zellkulturschalen mit den Maßen 100 mal 20 Millimeter gezüchtet. Die Zellanzahl kann je nach Zelltyp zwischen einer und zehn Millionen Zellen pro Schale variieren. Für eine Immunpräzipitation sind etwa zwei Millionen Zellen ausreichend, um Proteine mit der Chromatin in den Zellen zu vernetzen.

Fügen Sie Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 1 % hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schwenken. Stoppen Sie die Vernetzung durch Zugabe von Glycin auf eine Endkonzentration von 125 Millimolar und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Waschen Sie die Zellen bei Raumtemperatur zweimal mit einer x Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung. Nach dem zweiten Waschschritt gießen Sie den PBS ab und geben 0,2 Milliliter frischen PBS hinzu. Gewinnen Sie die Zellen mit einem Kunststoff-Zellabstreifer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2000 U/min fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Aspirieren Sie den Überstand zur nukleären Extraktion. Behalten Sie die Zellen als Pellet zur Herstellung eines Gesamtzelllysats, das im nächsten Abschnitt demonstriert wird. Resuspendieren Sie die Zellen in SDS-Lysispuffer; Gesamtzelllysate werden aus den vernetzten Zellen durch Beschallung auf nassem Eis hergestellt.

Mit einem My ator muss dieses Verfahren durch Ausprobieren verschiedener Sonikationsbedingungen optimiert werden, um die ideale DNA-Fragmentgröße zu erhalten. Die Proben müssen während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten werden. Sonizieren Sie jede Probe unter diesen Einstellungen: 30 Sekunden an und 45 Sekunden aus bei einer Amplitude von zwei.

In diesem Beispiel sind 12 Zyklen erforderlich, um die ideale Fragmentgröße zu erhalten. Sammeln Sie 20 Mikroliter jeder Probe, um die Beschallungsergebnisse zu überprüfen und zur Quantifizierung. Der Rest der Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Verdünnen Sie die 20-Mikroliter-Probe durch Zugabe von 30 Mikrolitern 0,1 XTE-Puffer. Behandeln Sie anschließend die Probe mit einem Mikroliter RNase A bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Fügen Sie danach ein Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 62 Grad Celsius für zwei Stunden.

Nach der Proteinase-K-Behandlung 20 Mikroliter der Probe auf einem 2 %-Agarosegel laufen lassen. Die Proben sollten eine Schmierung aufweisen, wobei der Großteil der DNA die gewünschte Größe aufweist. Wenn mehrere verschiedene Zyklen getestet werden, sollte eine schrittweise Abnahme der Größe erkennbar sein.

Wenn die Anzahl der Zyklen zunimmt, wird die verbleibende Menge der Probe mit einem Kaya-Quick-PCR-Reinigungs-Kit gereinigt und mittels eines NanoDrop-Spektrums von TER quantifiziert, um dieses Verfahren zu beginnen. Fava beschallte Chromatinproben auf Eis zentrifugiert bei 12.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sofort auf Eis stellen.

Um das SDS zu entfernen, das als weißes Pellet erscheint. Sammeln Sie den Überstand und verwerfen Sie das Pellet aus jeder Probe. Kombinieren Sie gegebenenfalls die Proben und stellen Sie die aufgrund vorheriger Berechnungen benötigten Mengen für das Experiment beiseite.

Pro Immunpräzipitation werden ein bis zehn Mikrogramm Chromatin benötigt. Verdünnen Sie das Chromatin im Verhältnis 1:10 in Dilutionspuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitor. Geben Sie pro Immunpräzipitation 100 Mikroliter blockierte Aro Speeds hinzu und inkubieren Sie unter Schwenken bei vier Grad Celsius für eine Stunde.

Beginnen Sie das Verfahren der Chromatin-Immunpräzipitation, indem Sie die Proben bei 800 U/min eine Minute lang bei vier Grad Celsius abzentrifugieren und jeden Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 800 U/min für eine Minute und überführen Sie ihn in ein anderes sauberes Röhrchen. Bewahren Sie 20 Mikroliter des Überstands bei minus 20 Grad Celsius auf, um als Input-Kontrolle zu dienen.

Geben Sie den restlichen Chromatin später in Aliquote entsprechend der Anzahl der im Experiment erforderlichen Immunpräzipitationen auf. Fügen Sie jedem Probenansatz zwei Mikrogramm Antikörper pro ein bis zehn Mikrogramm Chromatin hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotation. Am folgenden Morgen geben Sie 100 Mikroliter blockierte Aros-Perlen zu jeder Immunpräzipitationsprobe hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rotation nach einer Stunde.

Die Perlen durch Zentrifugation bei 800 U/min für eine Minute pelletieren. So viel wie möglich vom Überstand entfernen. Perlen waschen.

Einmal mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt zum Waschen des Immunkomplexes: Fügen Sie je einen Milliliter des Puffers zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie unter Schwenken bei Raumtemperatur für fünf bis acht Minuten und zentrifugieren Sie anschließend nach dem Verwerfen des Überstandes bei 800 U/min für eine Minute. Waschen Sie die Pellets einmal mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt zum Waschen des Immunkomplexes, einmal mit Lithiumchlorid-Immunkomplexwaschpuffer und zweimal mit TE-Puffer, insgesamt fünf Waschschritte. Anschließend wird die DNA aus jeder Immunpräzipitationsprobe sowie aus den Input-Proben eluiert.

Um die Quervernetzung rückgängig zu machen, geben Sie acht Mikroliter fünf molar Natriumchlorid zu 200 Mikrolitern jedes Eluats und jeder Input-Kontrolle hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius. Behandeln Sie am folgenden Tag jede Probe mit einem Mikroliter RNase A für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Nach einer Stunde vier Mikroliter 0,5 M EDTA und acht Mikroliter 1 M Tris-HCl zu jeder Probe hinzufügen und mischen. Anschließend ein Mikroliter Proteinase K hinzufügen und zwei Stunden bei 45 Grad Celsius inkubieren. Die Proben mit dem Kaya Quick PCR-Reinigungs-Kit aufreinigen.

Die Proben können bis zur Untersuchung mittels PCR bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Die Anreicherung durch Chromatin-Immunpräzipitation kann entweder mittels PCR oder Echtzeit-PCR überprüft werden. Bei PCR-Proben sollte nach Elektrophorese in einem Agarosegel in den Kanälen für Input und Chip-Probe ein Band unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein der Untersuchung – in diesem Fall dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 – sichtbar sein. Im Gegensatz dazu sollte im IgG-Negativkontrollkanal für den positiven Bindungsbereich kein Band oder bestenfalls ein sehr schwaches Band zu sehen sein.

Für den negativen Bindungsbereich sollte im IgG-Kontroll- und Chip-Kanal eine sehr schwache Bande oder gar keine Bande sichtbar sein. Im Input-Kanal sollte eine Bande vorhanden sein.

Diese Abbildung zeigt Ergebnisse derselben Proben, die mittels Echtzeit-PCR untersucht wurden. Wie beim vorherigen Ergebnis sollte eine signifikante Anreicherung des positiven Bindungsbereichs in der Chip-Probe im Vergleich zur IgG-Kontrolle vorliegen.

Außerdem sollte, falls vorhanden, eine sehr geringe Anreicherung im negativen Bindungsbereich vorliegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bindungsprotein in einem Gewebe oder einer Zelllinie mit Chromatin vernetzt, das gezielt angestrebte Protein präzipitiert und anschließend die DNA für weitere Analysen isoliert.