Name: Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Bindungsregionen und die Generierung hochwertiger Templates für ChIP-seq-Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit wird von einem Institut Development Award aus dem Kinderkrankenhaus von Philadelphia unterstützt.

Ein. Querverbindung Chromatin <ol><li> Wachsen Zellen in 100x20mm Zellkulturschalen. Die Menge der Zellen können von 1 bis 10 Millionen Zellen pro Schale je nach Zelltyp reichen. Etwa 2 Millionen Zellen ist ausreichend für eine Immunpräzipitation. </li><li> Querverbindung Zellen in 1% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schaukelstuhl. </li><li> Quench Vernetzung durch Zugabe einer Endkonzentration von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur gerührt. </li><li> Waschen der Zellen mit 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) zweimal, dekantieren PBS, und fügen Sie 0,2 ml PBS. </li><li> Ernten Sie die Zellen mit einem Kunststoff Zellenabstreifer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin down Zellen bei 2.000 rpm für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie den Überstand. Die Zellen in SDS-Lyse-Puffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) für Ganzzelllysat oder halten sie als Pellet für nukleare Extraktion. </li><li> Die Zellen können bei -80 ° C gespeichert werden, oder man kann immediat gehenEly mit Beschallung. </li></ol> 2. Bereiten Kerne (Fahren Sie mit 3.5 für Ganzzelllysat Schritt) <ol><li> Nachtrag Cell Lysis Buffer (5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) mit 1X Proteinase-Inhibitor jedes Experiment. </li><li> Resuspendieren aufgetaut Zellpellet in etwa das 10-fache Volumen Pellet mit Cell Lysis Buffer. </li><li> Dounce nachhomogenisieren 10 mal mit Stößel dann auf Eis inkubieren 10 min. </li><li> Zentrifuge Probe bei 4.000 rpm für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und speichern Kernpellet. </li></ol> 3. Beschallung * <ol><li> Warm up SDS Lysis Buffer und Ergänzung Menge Puffer mit Proteinase-Inhibitor verwendet werden. </li><li> Resuspendieren Kernpellet in SDS Lysis Buffer (ca. 0,5 ml Puffer pro 1-10.000.000 Zellen) </li><li> Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> 0,5 ml Aliquots der Proben zu Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mit Ultraschall auf nassem Eis mit Misonix Ultraschallgerät mit 30 Sek. auf 45 Sek. undoff bei einer Amplitude von 2 Einstellung. Anzahl der Zyklen für ideal Fragmentgröße werden, indem zuerst versucht verschiedene Taktzahlen (zB 2, 4, 8, 12, 16 und 20 oder mehr Zyklen) ermittelt werden. Eine andere Marke von Ultraschallgerät verwendet, jedoch die Bedingungen variiert werden. Versuche mit der Anzahl der Zyklen und Zeit-und Ausschalten muß durchgeführt werden, um die optimalen Bedingungen zu bestimmen. </li><li> Sammle 20 ul jeder Probe Beschallung Ergebnisse zu überprüfen und zu quantifizieren tun. Der Rest der Probe bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Verdünnen Sie die 20 ul Probe durch Zugabe von 30 ul 0,1 × TE-Puffer. </li><li> Gönnen Probe mit 1 ul RNase A bei 37 ° C für 1 Stunde dann 1 ul Proteinase K und Inkubation bei 62 ° C für 2 Stunden. </li><li> Führen Sie 20 ul der Probe auf einem 2% Agarosegel. </li><li> Reinigen Sie die verbleibende Probe mit QIAquick PCR Purification Kit dann quantifizieren mit NanoDrop Spektralphotometer. </li></ol> * Für nativen ChIP kann microccocal Nucleaseverdau alternativ zum Abscheren des DNA verwendet werden. 4. Blockieren Agarosekügelchen * <ol><li> Wenn Perlen bereits blockiert sind, gehen Sie zu Schritt 5.1. </li><li> Verwenden Protein A oder Protein G-Agarose. Für 5 Immunpräzipitationen (IPs), verwenden Sie 600 ul 50% Kügelchenaufschlämmung (300 ul Wulst Pellet) </li><li> Um die Perlen waschen, schleudern sie unten bei 800 rpm für 1 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. In etwas mehr als 2 ml ChIP Dilution Buffer (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, 167 mM NaCl, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1) zugeben und langsam umdrehen, die Röhre 10X. Spin down wieder bei 800 rpm für 1 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Wäsche 2 weitere Male. </li><li> Blockieren Perlen durch Drehen bei 4 ° C über Nacht in Blocking-Lösung. Siehe Tabelle 1 für das Rezept des Blocking-Lösung. </li></ol> 5. Pre-clear Chromatin <ol><li> Thaw beschallt Chromatin auf Eis. </li><li> Spin down bei 12.000 rpm foder 10 min bei 4 ° C auf Eis sofort, SDS (weiß Pellet) entfernen setzen. </li><li> Sammle Überstand verwerfen Pellet, und kombinieren Proben, wenn nötig. </li><li> Nehmen Sie die Beträge für das Experiment auf Berechnungen (1-10 ug von Chromatin pro IP) benötigt. </li><li> Verdünnen Chromatin 10X in ChIP Dilution Buffer mit Proteinase-Inhibitor ergänzt. </li><li> In 100 ul blockiert Perlen pro IP. </li><li> Drehen bei 4 ° C für 1 Stunde. </li></ol> 6. Immunpräzipitation <ol><li> Spin down Proben bei 800 rpm für 1 min und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Spin down Überstand bei 800 rpm für 1 min und Übertragung auf ein anderes sauberes Röhrchen. </li><li> Sparen Sie 20 ul der Überstand, die als Input-Steuerung dienen, bei -20 ° C. </li><li> Aliquot des Chromatins der Anzahl von IPs in den Test erfolgen. </li><li> In 2 ug Antikörper pro 1-10 ug von Chromatin zu jeder Probe. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C Drehung. </li><li> In 100 ul blockiert Perlen an jede IP-Probe. </li><li> Inkubation für 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Pellet die Perlen indem sie zum Stillstand bei 800 rpm für 1 min und entsorgen Sie so viel von der Überstand wie möglich. </li><li> Waschen Sie Perlen einmal mit wenig Salz Immune Complex Waschpuffer. 1 ml Puffer in jedes Röhrchen, drehen bei Raumtemperatur 5-8 min; Spin-Down bei 800 rpm für 1 min, dann Überstand verwerfen. Wiederholen waschen einmal mit hoher Salz Immune Complex Waschpuffer und LiCl Immune Complex Waschpuffer und zweimal mit TE-Puffer für insgesamt 5 Wäschen (Tabelle 2). </li></ol> 7. Elution <ol><li> Thaw Eingang Proben aus vorherigen Tag, um mit den Fliessmitteln verarbeitet werden. </li><li> Als Elutionspuffer frisch (Tabelle 3). </li><li> Machen Sie einen Master-Mix von genug Elutionspuffer für IPs und Eingang Kontrollproben sowie 1-2 zusätzliche Proben benötigt. </li><li> 100 l Elutionspuffer auf jedem IP Probe und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 mMit Drehung. </li><li> Spin down bei 800 rpm für 1 min und fügen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Einen weiteren hinzufügen 100 ul Elutionspuffer zu jedem Röhrchen von Perlen und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min mit der Drehung. </li><li> Vortex für 15 sec nach der Inkubation; Abzentrifugieren bei 5000 Upm für 1 min, dann verbinden sich mit dem Überstand aus der ersten Elution Überstand. (Stellen Sie sicher, dass keine über Perlen in den Überständen links. Falls Sie unsicher sind, Spin-down Überstand erneut bei 5.000 rpm für 1 min und den Überstand in ein neues Röhrchen. </li><li> In 180 ul Elutionspuffer auf die 20 ul Eingang Kontrollproben. </li></ol> 8. Reverse-Kreuz-link <ol><li> Zum 200 ul Elutionsmitteln und Eingabe-Steuerelemente, Add 8 ul 5 M NaCl. </li><li> Seal-Röhrchen mit Parafilm und Inkubation im Wasserbad bei 65 ° C über Nacht. </li></ol> 9. DNA Purification <ol><li> Behandle jeden Probe mit 1 ul RNase A für 1 h bei 37 ° C. </li><li> In 4 μl von 0,5 M EDTA, 8 ul 1 M Tris-HCl, mischen, dann fügen Sie 1 ul Proteinase K zu jeder Probe und Inkubation bei 45 ° C für 2 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Proben mit dem QIAquick PCR Purification Kit. Die Proben können bei -20 ° C und PCR Check gespeichert werden können, zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden. </li></ol> * Alternativ können ChIP-grade magnetischen Kügelchen anstelle Agarose für die Immunpräzipitation Teil verwendet werden. 10. PCR Check <ol><li> Für die PCR Überprüfung einfach Primer für Regionen bekannt, die durch das Protein von Interesse gebunden werden. Verwenden Sie außerdem Primer für nicht-bindenden Regionen als negative Kontrollen. </li><li> Mischen Sie die Reagenzien für die Reaktion. Verdünnen Eingang Probe bei 1:100 (Tabelle 3). </li><li> Führen Reaktion. PCR-Programm: </li></ol> Schritt 1: 94 ° C 3 min Schritt 2: 94 ° C 20 sec 59 ° C 30 sec 72 ° C 30 sec (Wiederholen Sie Schritt 2 für mindestens 30 cycln) Schritt 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Führen Proben auf 1% Agarosegel. </li><li> Die Anreicherung kann auch quantitativ mit Echtzeit-PCR bestimmt. </li></ol>

<ol><li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4, 651-657 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+STAT+nuclear+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tracking STAT nuclear traffic.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).</li>
<li>Lodige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+determines+the+cytokine+sensitivity+of+STAT+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).</li>
<li>Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+between+IFNgamma+and+TLR+signalling+pathways+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages.</a> Immunobiology. 211, 511-524 (2006).</li>
<li>Vinkemeier, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+the+message+across%2C+STAT%21+Design+principles+of+a+molecular+signaling+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit.</a> The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).</li>
<li>Brierley, M. M., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stats%3A+multifaceted+regulators+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Stats: multifaceted regulators of transcription.</a> J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).</li>
<li>Bentley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+re-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-genome re-sequencing.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).</li>
<li>Grant, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+gene+confers+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).</li>
<li>Sladek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+identifies+novel+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes.</a> Nature. 445, 881-885 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wellcome+Trust+Case+Control+Consortium.+Genome-wide+association+study+of+14%2C000+cases+of+seven+common+diseases+and+3%2C000+shared+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls.</a> Nature. 447, 661-678 (2007).</li>
<li>Saxena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+loci+for+type+2+diabetes+and+triglyceride+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels.</a> Science. 316, 1331-1336 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+genome-wide+association+signals+in+UK+samples+reveals+risk+loci+for+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes.</a> Science. 316, 1336-1341 (2007).</li>
<li>Scott, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li>
<li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li>
<li>Salonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+Diabetes+Whole-Genome+Association+Study+in+Four+Populations%3A+The+DiaGen+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).</li>
<li>Zeggini, E., McCarthy, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF7L2%3A+the+biggest+story+in+diabetes+genetics+since+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA.</a> Diabetologia. 50, 1-4 (2007).</li>
<li>Weedon, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+TCF7L2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet.+Med%22%5BJournal%5D)">The importance of TCF7L2.</a> Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).</li>
<li>Hattersley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+suspect%3A+the+TCF7L2+gene+and+type+2+diabetes+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk.</a> The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).</li>
<li>Yochum, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+analysis+of+chromatin+occupancy+identifies+beta-catenin+target+genes+in+colorectal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).</li>
<li>Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+the+TCF-4+gene+%28TCF7L2%29+to+human+chromosome+band+10q25.3%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3.</a> Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).</li>
<li>Pomerantz, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li>
<li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li>
<li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+%28TCF7L2%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li>
<li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Es ist nun möglich, die Durchführung einer genomweiten Profil von Protein-DNA-Wechselwirkungen Assoziation mit ChIP-seq, wie bereits vor kurzem mit anderen Transkriptionsfaktoren 2,3 demonstriert. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Sequenzierung Ergebnis ist die Erzeugung eines hochwertigen Chromatinimmunpräzipitation DNA-Vorlage. Sobald die DNA-Matrize erzeugt wurde und festgestellt, angemessen angereichert werden, kann man dann nehmen Sie es in der Bibliothek Vorbereitung für ...

Seit vielen Jahren hat es einen unerfüllten Bedarf, um den Satz von Genen, gebunden und durch ein bestimmtes Protein genomweiter, insbesondere in den Transkriptionsfaktor reguliert Klasse zu identifizieren. Odom et al. 1 verwendet Chromatinimmunpräzipitation (Chip) mit Promoter Microarrays systematisch zu identifizieren, die Gene von vorgegebenen Transkriptionsfaktoren in der menschlichen Leber und Pankreas-Inseln besetzt kombiniert. Anschließend entwickelte Johnson et al. 2 eine groß angelegte Chromatinimmunpräzipitation Assay auf direkte Ultra Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-seq), um umfassend abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen über die gesamte Säugergenomen basiert. Als Testfall sie in vivo der Bindung des Neuron-einschränkende Faktor Schalldämpfer (NRSF) bis 1946 Stellen im menschlichen Genom abgebildet. Die angezeigten Daten scharfen Auflösung von verbindlichen Position (+ 50 Basenpaare), die sowohl die i erleichtertsolation der Motive und der Identifizierung von NRSF-bindende Motive. Diese ChIP-seq Daten hatten auch hohe Sensitivität und Spezifität und statistische Sicherheit (P &lt;10 -4), Eigenschaften, die wichtig für die Ableitung neuer Kandidat Wechselwirkungen sind. Robertson et al. 3 auch ChIP-seq verwendet werden, um Ziele in der Karte STAT1 Interferon-γ (IFN-γ)-stimulierten und unstimulierten humanen HeLa S3-Zellen in vivo. Durch ChIP-seq, mit 15,1 und 12,9 Mio. eindeutig zugeordnet Sequenz liest, und eine geschätzte False Discovery Rate von weniger als 0.001, identifizierten sie 41.582 und 11.004 mutmaßliche STAT1-bindenden Regionen in stimulierten und unstimulierten Zellen. Von den 34 Loci bekannt STAT1 auf Interferon ansprechenden Bindungsstellen 4-8 enthalten, gefunden ChIP-seq 24 (71%). ChIP-seq Ziele wurden in Sequenzen ähnlich bekannt STAT1 Bindungsmotive bereichert. Vergleiche mit zwei bestehenden ChIP-PCR-Datensätze vorgeschlagendass ChIP-seq Sensitivität lag zwischen 70% und 92% und eine Spezifität von mindestens 95%. Darüber hinaus war es klar, dass ChIP-seq sowohl niedrige analytische Komplexität und Sensibilität, die mit zunehmender Tiefe Sequenzierung bietet. Als solche &quot;nächsten Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die kostengünstig gegenüber älteren Technologien 9 erzeugt werden können. ChIP-seq Methoden daher direkt liefern Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung der Säuger Protein-DNA-Wechselwirkungen 3. Im Jahr 2006 wurde eine starke Assoziation von Varianten in den Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2) Gen mit Typ-2-Diabetes 10 entdeckt. Andere Forscher haben bereits unabhängig diese Feststellung in verschiedenen Ethnien repliziert und interessanterweise von den ersten genomweiten Assoziationsstudien von Typ-2-Diabetes in Nature veröffentlicht 11,12 </sup&gt;, Wissenschaft und anderswo 13-15 16,17 war die stärkste Assoziation mit der Tat TCF7L2, dies ist nun die wichtigste genetische Befund bei Typ-2-Diabetes als 18-20 Laufenden. Darüber hinaus hat TCF7L2 das Krebsrisiko 21,22 in Verbindung gebracht worden, ja, wurde diese Verbindung noch deutlicher, wenn der Locus 8q24 durch genomweite Assoziationsstudien von einer Reihe von Krebsarten, einschließlich kolorektalen Karzinomen ergab, wurde gezeigt, dass durch eine extreme stromaufwärts TCF7L2 bindende Element der Fahrt die Transkription von MYC 23,24. Daher besteht ein großes Interesse an der Feststellung der nachgeschalteten Gene durch diese Taste Transkriptionsfaktor reguliert. Basierend auf den Erfahrungen mit TCF7L2 als Beispiel der Methodik, umreißt dieses Papier wie man qualitativ hochwertige ChIP-DNA-Template zu erzeugen. Chip wurde im kolorektalen Karzinom-Zelllinie HCT116, z. anschließende Sequenzierung, um Aufbau eines High-Resolution Karte der Gene durch TCF7L2 25 in dem Bestreben, weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen ergeben gebunden.

<table><tbody><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ChIP-Kit </td><td>Millipore</td><td>17-371</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Hot Start Polymerase </td><td>Promega</td><td>M5001</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>XL-2000</td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop 1000 Spektralphotometer </td><td>Thermo-Scientific<</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Positivkontroll-Primersequenzen (TCF7L2-1) Vorwärts- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCCTCTGTCTTCG-3' Negativkontroll-Primersequenzen (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGTCTGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td></tr></tbody></table>

generierung von high quality chromatin immunpräzipitation dna vorlage für hochdurchsatz-sequenzierung (chip-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq) Methoden direkt anbieten Ganzgenom Deckung, wo die Kombination Chromatinimmunpräzipitation (Chip) und massiv parallele Sequenzierung genutzt werden, um das Repertoire der Säuger-DNA-Sequenzen, die von Transkriptionsfaktoren in vivo gebunden zu identifizieren. &quot;Next-Generation&quot; Genom-Sequenzierung Technologien bieten 1-2 Größenordnungen Anstieg in Höhe von Sequenz, die sein können kostengünstig im Vergleich zu älteren Technologien erzeugt so dass für ChIP-seq Methoden, um direkt zur Verfügung Ganzgenom Abdeckung für wirksame Profilierung von Säugetieren Protein-DNA-Wechselwirkungen. Für eine erfolgreiche ChIP-seq Ansätze, muss man erzeugen hochwertige ChIP DNA-Vorlage, um die besten Ergebnisse zu erhalten Sequenzierung. Die Beschreibung ist um Erfahrungen mit dem Proteinprodukt des Gens am stärksten in der Pathogenese von Diabetes Typ 2, nämlich der Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 7-like 2 (TCF7L2 gebracht basierend). Dieser Faktor ist auch in verschiedenen Tumoren in Verbindung gebracht. Skizziert ist wie man qualitativ hochwertige ChIP DNA-Vorlage aus dem kolorektalen Karzinom Zelllinie HCT116 abgeleitet zu erzeugen, um eine hochauflösende Kartendarstellung durch Sequenzierung der Gene von TCF7L2 gebunden bestimmen zu bauen, geben weitere Einblicke in seine wichtige Rolle in der Pathogenese von komplexen Merkmalen.

Sobald das Chromatin wurde mit Ultraschall behandelt wurde, und wurden mit RNase und Proteinase behandelt, sollten die Proben auf der 2% igen Agarosegel aufgetrennt ein Abstrich mit der Masse der DNA, die in der gewünschten Größe. Wenn mehrere Zyklen geprüft, ist eine allmähliche Abnahme in der Größe der Anzahl von Zyklen erhöht (Abbildung 2) zu sehen. Nach Abschluss der Immunopräzipitation des Protokolls ist die Anreicherung kann entweder durch PCR oder Echtzeit-PCR überprü...

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Proteinbindungsregionen über Chromatin nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Protein an die DNA vernetzt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA zu fragmentieren.Anschließend wird das DNA-gebundene Zielprotein immunpräzipitiert und anschließend eluiert. Im letzten Schritt wird die Vernetzung rückgängig gemacht und die DNA isoliert. Letztendlich dient die Chromatin-Immunpräzipitation dazu, die Lokalisation der Proteinbindung über das gesamte Genom hinweg aufzuzeigen.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik beantworten, beispielsweise die Identifizierung und Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen in einem bestimmten Gewebe oder einer Zelllinie. Die Zellen für dieses Verfahren werden in Zellkulturschalen mit den Maßen 100 mal 20 Millimeter gezüchtet. Die Zellanzahl kann je nach Zelltyp zwischen einer und zehn Millionen Zellen pro Schale variieren. Für eine Immunpräzipitation sind etwa zwei Millionen Zellen ausreichend, um Proteine mit der Chromatin in den Zellen zu vernetzen.Fügen Sie Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 1 % hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schwenken. Stoppen Sie die Vernetzung durch Zugabe von Glycin auf eine Endkonzentration von 125 Millimolar und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Waschen Sie die Zellen bei Raumtemperatur zweimal mit einer x Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung. Nach dem zweiten Waschschritt gießen Sie den PBS ab und geben 0,2 Milliliter frischen PBS hinzu. Gewinnen Sie die Zellen mit einem Kunststoff-Zellabstreifer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2000 U/min fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.Aspirieren Sie den Überstand zur nukleären Extraktion. Behalten Sie die Zellen als Pellet zur Herstellung eines Gesamtzelllysats, das im nächsten Abschnitt demonstriert wird. Resuspendieren Sie die Zellen in SDS-Lysispuffer; Gesamtzelllysate werden aus den vernetzten Zellen durch Beschallung auf nassem Eis hergestellt.Mit einem My ator muss dieses Verfahren durch Ausprobieren verschiedener Sonikationsbedingungen optimiert werden, um die ideale DNA-Fragmentgröße zu erhalten. Die Proben müssen während des gesamten Verfahrens auf Eis gehalten werden. Sonizieren Sie jede Probe unter diesen Einstellungen: 30 Sekunden an und 45 Sekunden aus bei einer Amplitude von zwei.In diesem Beispiel sind 12 Zyklen erforderlich, um die ideale Fragmentgröße zu erhalten. Sammeln Sie 20 Mikroliter jeder Probe, um die Beschallungsergebnisse zu überprüfen und zur Quantifizierung. Der Rest der Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Verdünnen Sie die 20-Mikroliter-Probe durch Zugabe von 30 Mikrolitern 0,1 XTE-Puffer. Behandeln Sie anschließend die Probe mit einem Mikroliter RNase A bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Fügen Sie danach ein Mikroliter Proteinase K hinzu und inkubieren Sie bei 62 Grad Celsius für zwei Stunden.Nach der Proteinase-K-Behandlung 20 Mikroliter der Probe auf einem 2 %-Agarosegel laufen lassen. Die Proben sollten eine Schmierung aufweisen, wobei der Großteil der DNA die gewünschte Größe aufweist. Wenn mehrere verschiedene Zyklen getestet werden, sollte eine schrittweise Abnahme der Größe erkennbar sein.Wenn die Anzahl der Zyklen zunimmt, wird die verbleibende Menge der Probe mit einem Kaya-Quick-PCR-Reinigungs-Kit gereinigt und mittels eines NanoDrop-Spektrums von TER quantifiziert, um dieses Verfahren zu beginnen. Fava beschallte Chromatinproben auf Eis zentrifugiert bei 12.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sofort auf Eis stellen.Um das SDS zu entfernen, das als weißes Pellet erscheint. Sammeln Sie den Überstand und verwerfen Sie das Pellet aus jeder Probe. Kombinieren Sie gegebenenfalls die Proben und stellen Sie die aufgrund vorheriger Berechnungen benötigten Mengen für das Experiment beiseite. Pro Immunpräzipitation werden ein bis zehn Mikrogramm Chromatin benötigt. Verdünnen Sie das Chromatin im Verhältnis 1:10 in Dilutionspuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitor. Geben Sie pro Immunpräzipitation 100 Mikroliter blockierte Aro Speeds hinzu und inkubieren Sie unter Schwenken bei vier Grad Celsius für eine Stunde.Beginnen Sie das Verfahren der Chromatin-Immunpräzipitation, indem Sie die Proben bei 800 U/min eine Minute lang bei vier Grad Celsius abzentrifugieren und jeden Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 800 U/min für eine Minute und überführen Sie ihn in ein anderes sauberes Röhrchen. Bewahren Sie 20 Mikroliter des Überstands bei minus 20 Grad Celsius auf, um als Input-Kontrolle zu dienen.Geben Sie den restlichen Chromatin später in Aliquote entsprechend der Anzahl der im Experiment erforderlichen Immunpräzipitationen auf. Fügen Sie jedem Probenansatz zwei Mikrogramm Antikörper pro ein bis zehn Mikrogramm Chromatin hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotation. Am folgenden Morgen geben Sie 100 Mikroliter blockierte Aros-Perlen zu jeder Immunpräzipitationsprobe hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rotation nach einer Stunde.Die Perlen durch Zentrifugation bei 800 U/min für eine Minute pelletieren. So viel wie möglich vom Überstand entfernen. Perlen waschen.Einmal mit einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt zum Waschen des Immunkomplexes: Fügen Sie je einen Milliliter des Puffers zu jedem Röhrchen hinzu. Inkubieren Sie unter Schwenken bei Raumtemperatur für fünf bis acht Minuten und zentrifugieren Sie anschließend nach dem Verwerfen des Überstandes bei 800 U/min für eine Minute. Waschen Sie die Pellets einmal mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt zum Waschen des Immunkomplexes, einmal mit Lithiumchlorid-Immunkomplexwaschpuffer und zweimal mit TE-Puffer, insgesamt fünf Waschschritte. Anschließend wird die DNA aus jeder Immunpräzipitationsprobe sowie aus den Input-Proben eluiert.Um die Quervernetzung rückgängig zu machen, geben Sie acht Mikroliter fünf molar Natriumchlorid zu 200 Mikrolitern jedes Eluats und jeder Input-Kontrolle hinzu. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius. Behandeln Sie am folgenden Tag jede Probe mit einem Mikroliter RNase A für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.Nach einer Stunde vier Mikroliter 0,5 M EDTA und acht Mikroliter 1 M Tris-HCl zu jeder Probe hinzufügen und mischen. Anschließend ein Mikroliter Proteinase K hinzufügen und zwei Stunden bei 45 Grad Celsius inkubieren. Die Proben mit dem Kaya Quick PCR-Reinigungs-Kit aufreinigen.Die Proben können bis zur Untersuchung mittels PCR bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Die Anreicherung durch Chromatin-Immunpräzipitation kann entweder mittels PCR oder Echtzeit-PCR überprüft werden. Bei PCR-Proben sollte nach Elektrophorese in einem Agarosegel in den Kanälen für Input und Chip-Probe ein Band unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein der Untersuchung – in diesem Fall dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 – sichtbar sein. Im Gegensatz dazu sollte im IgG-Negativkontrollkanal für den positiven Bindungsbereich kein Band oder bestenfalls ein sehr schwaches Band zu sehen sein.Für den negativen Bindungsbereich sollte im IgG-Kontroll- und Chip-Kanal eine sehr schwache Bande oder gar keine Bande sichtbar sein. Im Input-Kanal sollte eine Bande vorhanden sein.Diese Abbildung zeigt Ergebnisse derselben Proben, die mittels Echtzeit-PCR untersucht wurden. Wie beim vorherigen Ergebnis sollte eine signifikante Anreicherung des positiven Bindungsbereichs in der Chip-Probe im Vergleich zur IgG-Kontrolle vorliegen.Außerdem sollte, falls vorhanden, eine sehr geringe Anreicherung im negativen Bindungsbereich vorliegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Bindungsprotein in einem Gewebe oder einer Zelllinie mit Chromatin vernetzt, das gezielt angestrebte Protein präzipitiert und anschließend die DNA für weitere Analysen isoliert.

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Methoden zur Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen in vivo werden für jeden Aspekt der Genomforschung immer wichtiger, aber sie sind mühsam, kostspielig und zeitaufwändig. Hier wird ein kommerziell verfügbares robotisches Liquid-Handling-System vorgestellt, das die Chromatin-Immunpräzipitation automatisiert, um in vivo Protein-DNA-Wechselwirkungen mit begrenzten Zellmengen abzubilden.

Automatisierung von ChIP-seq Experimente Epigenetische Profile auf 10.000 HeLa-Zellen zu generieren

Wir präsentieren eine modifizierte native Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChIP-Seq) Methodik für die Generation der Sequenz Datasets geeignet für ein Nukleosom Dichte ChIP-Seq analytischer Rahmen micrococcal Nuklease (MNase) Zugänglichkeit zu integrieren mit Histon Modifikation Messungen.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das entwickelt ist, um die genomweite Bindung des Transkriptionsfaktors Oligodendrozyt 2 (Olig2) in akut gereinigte Brain Oligodendrozyt Vorläuferzellen (OPCs) analysieren durch Ausführen von niedrig-Zelle Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) , Bibliothek-Vorbereitung, Hochdurchsatz-Sequenzierung und bioinformatische Analyse der Daten.

Identifizierung von Transkription Faktor Olig2 genomische Bindungsstellen in akut PDGFRα + Zellen durch Low-Zelle Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Analyse gereinigt

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Dieser Artikel beschreibt ein halbautomatisches, mikroskaliertes ChIP-Seq-Protokoll von DNA-Regionen, die mit einer spezifischen Histonmodifikation (H3K27ac) unter Verwendung einer ChIP-Liquid-Handler-Plattform assoziiert sind, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung mittels Tagmentation. Das Verfahren umfasst eine Kontrollbewertung für Qualitäts- und Quantitätszwecke und kann auf andere Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren angewendet werden.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Lernen Sie die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zur Identifizierung von Protein-DNA-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Kartierung von Bindungsregionen und die Generierung hochwertiger Templates für ChIP-seq-Analysen.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Weitere Videos entdecken