Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen In-vivo-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genetisch definierte neuronale Populationen auf einer physiologisch relevanten Zeitskala schnell zu aktivieren oder zum Schweigen zu bringen. Dies wird erreicht, indem ein viraler Vektor mit Transgenen, die das Blaulicht-Neuron aktivierendes Kanal-Opsin oder das Grünlicht-Neuron zum Schweigen bringen, an genetisch definierte Neuronen liefert. In einem zweiten Schritt wird eine lichtemittierende Operationsstraße konstruiert, die aus einer an einer Aufzeichnungselektrode befestigten Faseroptik besteht, die eine gleichzeitige Lichtabgabe und elektrische Aufzeichnung ermöglicht.

Als nächstes wird das TRO über der Opsin-transduzierten Gehirnregion positioniert und abgesenkt. Um Kanal-Opsin- und Ha-Opsin-vermittelte Reaktionen hervorzurufen, werden Ergebnisse erzielt, die eine lichtinduzierte Aktivierung und Hemmung von Kanal-Redsin- und Ha-Hallin-transduzierten Neuronen zeigen, basierend auf der Single-Unit-Recording-Technik, die die Aufzeichnung einzelner Neuronen ermöglicht. Diese Methode erfüllt ein grundlegendes Bedürfnis der Neurowissenschaften, indem sie es uns ermöglicht, genau zu bestimmen, wie effektiv Licht bei der Steuerung der neuronalen Aktivität mit einer Zeitauflösung von Millisekunden und in bestimmten neuronalen Subtypen sein kann, und dies zu demonstrieren.

Ein Postdoc in meinem Labor Sicherstellen, dass bei der Vorbereitung und Handhabung von Viren Verfahren der Biosicherheitsstufe eins eingehalten werden und dass alle lokalen und behördlichen Richtlinien in Bezug auf Tiere eingehalten werden. Lassen Sie vor der stereotaktischen Injektion ein Aliquot des Virus auf Eis auftauen und drehen Sie sich dann kurz herunter. Füllen Sie in einer Tischzentrifuge eine Hamilton-Glasspritze und -Nadel langsam mit einer kleinen Menge Silikon oder Mineralöl auf.

Stellen Sie sicher, dass sich keine sichtbaren Luftblasen im Spritzenzylinder befinden. Führen Sie die Spritze in eine Mikroinjektorpumpe ein und befestigen Sie die Pumpe direkt am vertikalen stereotaktischen Arm. Nachdem Sie das Virus-Aliquot-Röhrchen in eine stabile Position gebracht haben, senken Sie den stereotaktischen Arm ab, bis die Spitze der Nadel die Unterseite des Virus-Aliquot-Röhrchens berührt.

Verwenden Sie den Controller für die Mikroinjektorpumpe, um die gewünschte Virusmenge zu entnehmen. Nachdem Sie eine Ratte mit Ketamin und Xylazin betäubt haben, überprüfen Sie die Reflexreaktion auf ein Zehenklemmen, um eine angemessene Anästhesietiefe mit aseptischen Standardmethoden sicherzustellen. Setzen Sie das Tier in einen stereotaktischen Apparat ein, nachdem Sie mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einem Skalpell einen Mittellinienschnitt durch die Haut auf dem Tierschädel gemacht haben.

Trennen Sie vorsichtig das Bindegewebe und reinigen Sie die Schädeloberseite mit einem kleinen Knochenschaber. Senken Sie die Nadel ab, und stellen Sie sicher, dass die Z-Koordinaten für bgma und lambda gleich sind, um sicherzustellen, dass die Förderhöhe waagerecht ist. Bewegen Sie dann den stereotaktischen Arm zu den Koordinaten, die der interessierenden Gehirnstruktur entsprechen.

Markieren Sie die vorgesehene Injektionsstelle mit einem chirurgischen Stift. Verwenden Sie einen Handbohrer, um den Schädel vorsichtig über dem Zielbereich auszudünnen. Stoppen Sie, wenn der Bohrer die Unterseite des Schädels erreicht, und verwenden Sie eine extra feine Pinzette, um den ausgedünnten Knochen zu entfernen.

Nachdem die Dura freigelegt wurde, positionieren Sie die Spritzennadel über dem Zielbereich und senken Sie die Nadel, bis sie die Dura berührt. Und verwenden Sie diesen Punkt, um das z zu berechnen. Koordinieren Sie nun sehr langsam die Injektionsnadel in das Gehirn absenken, bis die richtige Z-Position erreicht ist.

In diesem Protokoll wird die prälimbische Region des medialen präfrontalen Kortex angesprochen. Injizieren Sie das Virus mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute. Warten Sie nach Abschluss der Injektion 10 Minuten, bevor Sie die Nadel zurückziehen, um einen Rückfluss des Virus an die Gehirnoberfläche zu vermeiden.

Nachdem Sie eine Nähnaht mit aufgesetzter Nadel verwendet haben, um die Haut zu versiegeln, tragen Sie Antibiotika auf die Wunde auf. Befestigen Sie zunächst eine Wolframelektrode von einem bis 1,5 Megaohm mit Sekundenkleber an einem Glaskapillarrohr. Verwenden Sie dann ein Faserabisolierwerkzeug, um das blanke Ende einer Multimode-Glasfaser freizulegen, und reinigen Sie die Faserspitze sehr leicht mit Ethanol

Ritzen Sie die Faserspitze mit einem keilförmigen Diamantmesser ein und entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die überschüssige Faser. Die Faser sollte sich an der Kerbe leicht spalten. Verwenden Sie ein optisches Leistungsmessgerät, um die Laserintensität an der Spitze der optischen Faser zu messen.

Für In-vivo-Aufzeichnungen kann eine Lichtintensität von nur 20 bis 100 Milliwatt pro Quadratmillimeter zuverlässig eine Kanal-Redsin- oder Hallin-vermittelte Aktivierung bzw. Stilllegung der neuronalen Aktivität hervorrufen. Führen Sie als Nächstes die optische Faser in das Kapillarrohr ein. Positionieren Sie die Faserspitze etwa 500 Mikrometer über der Spitze der Wolframelektrode und binden Sie einen dünnen Nahtfaden zweimal an einigen Stellen in der Nähe der Spitze, so dass die Elektrode und die Faser gerade sind.

Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Spitze der Elektrode und dem nächstgelegenen Knoten lang genug ist, um in den Zielbereich eingeführt zu werden, wie hier zu sehen. Bereiten Sie das Tier wie zuvor auf die Operation vor. Verwenden Sie dann die anfängliche Kraniotomie als Anleitung, um ein neues, sauberes, kleines Fenster im Schädel zu machen.

Zum Positionieren des tro. Mache mit einer feinen Nadel einen kleinen Schnitt in die Dura. Senken Sie den TRO vorsichtig mit einem Mikrom-Manipulator durch das Schädelfenster in das Gehirn in die transduzierte Region ab.

Dann geht es im Gelände langsam in 10 bis 50 Mikrometer-Schritten voran, bis eine lichtempfindliche Zelle entsteht. Hier wird eine benutzerdefinierte Software-Benutzeroberfläche verwendet, die in der Laboransicht geschrieben ist, um den Einzeldiodenlaser zu steuern und die laufende neuronale Aktivität zu visualisieren und aufzuzeichnen. Die aufgezeichneten Signale werden mit einem Ex-AMP 20 K-Verstärker erfasst, der mit einem Bandpass von 0,3 bis acht Kilohertz gefiltert ist, und einer Analog-Digital-Karte eines nationalen Instruments.

Die Benutzeroberfläche von neuro lux Pro ermöglicht die Wahl zwischen analogen Eingängen und digitalem Ausgang. Wählen Sie zwei analoge Kanäle für das neuronale und das Transistor-, Logik- oder TTL-Signal. Stellen Sie die Abtastrate auf 20 Kilohertz ein, die Basisperiode vor dem Licht auf zwei Sekunden und die Periode nach dem Licht auf zwei Sekunden.

Stellen Sie dann die Pulsbreite, die Frequenz und die Stimulationsdauer der TTL-Laserstimulation ein. Hier beträgt die Frequenz 20 Hertz und die Stimulationsdauer 500 Millisekunden, was bedeutet, dass 10 Laserpulse mit definierter Pulsbreite abgegeben werden. Der Benutzer kann entweder eine kontinuierliche Lichtabgabe oder wiederholte Aufnahmen wählen.

Sie können das Intervall zwischen den Impulsen und die Anzahl der Impulsdehnungen wählen. Die Daten können mit oder ohne Aufzeichnung auf Disc nach der Aufnahme erfasst werden. Das Tier wird nach zugelassenen Verfahren getötet und das Hirngewebe wird verarbeitet, um die Erosionsplatzierung und die Opsinexpression zu überprüfen, wie hier gezeigt.

Dieser Screenshot der Neuro LX Pro-Softwareschnittstelle, die für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrophysiologische Aufzeichnung eingerichtet ist, zeigt, wie Hall Rod Dobson die spontane Aktivität der prälimbischen Parametallzelle als Reaktion auf 10 Sekunden kontinuierlicher Lichtabgabe von 532 Nanometern zum Schweigen bringt. Dieses Foto zeigt die repräsentative Ausprägung von Hallo Redsin im dorsalen Ulu. Das Schema auf der rechten Seite stellt den Ort dar, an dem das Foto aufgenommen wurde.

Die Pfeilspitze zeigt die Position der Wolframelektrode an und der Pfeil zeigt die Position der optischen Faser an. Dieses Foto zeigt die repräsentative Opsin-Expression des Kanals im prälimbischen Kortex. Auch hier stellt das Schema auf der rechten Seite den Ort dar, an dem das Foto aufgenommen wurde.

Die Pfeilspitze zeigt die Position der Wolframelektrode an und der Pfeil zeigt die Position der optischen Faser an. Diese Beispielspur, die aus dem prälimbischen Kortex der Ratte aufgezeichnet wurde, zeigt, dass der Kanal Reds in zwei ausgelösten Aktionspotentialen als Reaktion auf die Abgabe von 20 Hertz von blauen 473 Nanometern Lichtimpulsen für jeweils 10 Millisekunden zeigt, wie durch den blauen Balken angezeigt. Unter. Das Rasterdiagramm zeigt das durch Kanalredsin induzierte Spiking in sechs repräsentativen Neuronen.

Jede Aktivität pro Einheit wird als Punkt dargestellt. Diese Beispielkurve zeigt eine Hall-Opsin-induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität während einer kontinuierlichen grünen Lichtbeleuchtung von 532 Nanometern für 10 Sekunden, wie durch den grünen Balken in derselben Gehirnregion angezeigt. Das Rasterdiagramm zeigt Haller-Dosin-induziertes Silencing in sechs repräsentativen Neuronen.

Jede Aktivität pro Einheit wird als Punkt dargestellt. Dieses Bild zeigt das repetitive 20-Hertz-Kanal-Opsin-getriebene Spiking eines prä-limpischen Parametall-Neurons einer Ratte in vivo Spannungsspuren des evozierten Lichts, Spikes, die zu den Zeitpunkten 0, 30, 90, 90 und 120 Minuten nach Beginn der Aufzeichnungen aufgenommen wurden, werden auf der linken Seite angezeigt. Auf der rechten Seite zeigt das Rasterdiagramm alle 61 Wiederholungen der lichtinduzierten Aktivierung.

Jede Aktivität pro Einheit wird als Punkt dargestellt. Hier in vivo sind oben elektrophysiologische Aufzeichnungen von Haller Dossin transduzierten dorsalen Sicm der Ratte zu sehen. Die Beispielkurve zeigt, dass eine 10-sekündige kontinuierliche Beleuchtung von 532 Nanometern, die durch den grünen Balken des dorsalen Subms angezeigt wird, der Hall Dobson exprimiert, die spontane Aktivität eliminiert.

Nachfolgend finden Sie die durchschnittlichen Wellenformen der beiden aufgezeichneten Einheiten aus der obigen Spur. Die Amplitudenschwelle wurde verwendet, um zwei unterschiedliche Neuronen zu identifizieren. Schließlich zeigt das Rasterdiagramm fünf Wiederholungen des Haller-Dossin-induzierten Silencings dieser Einheiten.

Jede Aktivität pro Einheit wird als Punkt dargestellt. Schließlich zeigt dieses Bild das repetitive 20-Hertz-Kanal-Opsin-getriebene Spiking eines dorsalen subularen Neurons einer Ratte in vivo Spannungsspuren des evozierten Lichts, Spiking, aufgenommen zu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten. Nachdem links der Beginn der Aufzeichnungen angezeigt wird, zeigt der Einschub unten die typische Bursting-Aktivität dieser Zelle.

Das Rasterdiagramm auf der rechten Seite zeigt alle 61 Wiederholungen der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Aktivität pro Einheit wird als Punkt dargestellt. Diese Technik ist wichtig, da sie zeigt, dass bestimmte neuronale Subtypen für lange Zeiträume aktiviert oder stummgeschaltet werden können.

Tatsächlich haben wir gezeigt, dass wir Neuronen über zwei Stunden lang aktivieren und anwenden können. Letztendlich wäre das Ziel, dies auf das sich verhaltende Tier bei Tieren anzuwenden, die Aufmerksamkeits- oder Gedächtnisaufgaben ausführen, damit wir bestimmte Schaltkreise aktivieren und sehen können, wie dies verschiedene Gedächtnisfunktionen steuert.