Name: Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen In-vivo- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-02T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Kontrolle einzelner Pyramidenzellen in vivo mit hoher Präzision. Diese Methode ermöglicht die Aktivierung oder Hemmung spezifischer neuronaler Populationen mit Millisekunden-Auflösung für Neurowissenschaftler.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute on Drug Abuse (NIDA) Zuschuss R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovative Seed Grant (DCC) und NIDA Ausbildungsförderung T32 DA017637 (MVB) unterstützt.

1. Virus-und Lagervorbereitung <ol><li> Die Verwendung von replikationsinkompetent AAV-Vektoren für die Bereitstellung von Opsin-Gene auf Gehirn von Nagetieren ist für Biosafety Level 1 (BSL-1) zugelassen und erfordert einen angemessenen Schutz und Umgang mit Verfahren wie in der US-Regierung Publikation, in Mikrobiologie und biologische Sicherheit Biomedical Laboratories, an skizzierten die Centers for Disease Control Website bei ( <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> Um wiederholte Frost-Tau-Zyklen, Pipetten Virus aus Herstellers Fläschchen in kleineren Arbeits Aliquots in der Klasse II Biosicherheitswerkbank und an einem -80 ° C Gefrierschrank vermeiden. </li><li> Vor stereotaktische Injektion, ermöglichen ein Aliquot auf Eis aufgetaut und dann kurz Spin-Down mit einer Tischzentrifuge. </li><li> Langsam Verfüllung einer Hamilton-Glasspritze und Nadel mit einer kleinen Menge Silikonöl oder Mineralöl.Stellen Sie sicher, gibt es keine sichtbaren Luftblasen in der Spritze Barrel. Legen Sie die Spritze in einen Mikroinjektor Pumpe und befestigen Sie die Pumpe direkt auf die vertikale stereotaktischen Arm (dh stereotaktischen Manipulator). </li><li> Senken Sie den stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel den Boden des Virus aliquoten Rohr berührt. Verwenden Sie den Regler für die Mikroinjektor Pumpe, um das gewünschte Volumen an Virus (1,5 ul für eine 1 ul Injektion) zurücktreten. </li><li> Alle Materialien und Oberflächen, die in Kontakt mit dem Virus zu kommen, sollte mit einem Desinfektionsmittel wie Chlor Bleichmittel (10%) dekontaminiert werden. </li></ol> 2. Chirurgie und Virus Injection <ol><li> Betäuben Tier mit einem Gemisch aus Ketamin (Ratte, 125 mg / kg, ip) - Xylazin (Ratte, 10 mg / kg, ip) Cocktail. Um die Wirksamkeit der Narkose zu messen, prüfen, ob ein Reflex auf einer Zehe Prise und geben zusätzliche Dosen von Ketamin, wenn nötig. Mit Standard-aseptischen Operationsmethoden, legen Tier in einen stereotaktischen Apparat (David Kopf InInstrumente). </li><li> Machen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut auf der Oberseite des Tierschädel mit kleinen chirurgischen Schere oder Skalpell. Trennen Sie vorsichtig Bindegewebe und reinigen Sie die Oberseite des Schädels mit einer kleinen Knochenschaber. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres Ebene, so dass die z-Koordinaten für Bregma und Lambda gleich sind. Bestimmen Sie die Koordinaten für die stereotaktische Zielgehirnbereich aus einer Hirnatlas wie The Rat Brain in Stereotaktische Koordinaten (George Paxinos und Charles Watson, Academic Press, 2007) oder Gehirn der Maus in Stereotaktische Koordinaten (BJ Keith Franklin und George Paxinos, Academic Press , 2007). Markieren Sie die Stelle der Injektion soll mit einem chirurgischen Stift. </li><li> Vorsichtig dünn die Schädel über dem Zielgebiet mit einer Handbohrmaschine und aufhören, wenn der Bohrer den Boden des Schädels erreicht. Mit ein Paar extra feinen Pinzette, entfernen Sie die Knochen ausgedünnt, um die Dura freizulegen. </li><li> Positionieren Sie die Spritzennadel über das Ziel sindein und senken Sie die Nadel bis zum dura berührt und diesen Punkt zu berechnen, die z-Koordinate. Ganz langsam senken Sie die Injektionsnadel in das Gehirn, bis die richtige Position erreicht ist z. In diesem Protokoll prälimbischen Bereich des medialen präfrontalen Kortex (2,7 mm anterior zum Bregma, ± 0,5 mm lateral zur Mittellinie und -2.2 mm von Dura) oder der Rücken subiculum (-6.0 mm anterior zum Bregma, 3,0 mm lateral ± zur Mittellinie bzw. -2,0 mm von Dura) in einem erwachsenen Sprague Dawley Ratten (ca. 275 g) ausgerichtet. </li><li> Injizieren Virus bei einer Rate von 0,1 ul / min. Nachdem die Injektion abgeschlossen ist 10 Minuten warten, bevor Zurückziehen der Nadel, um einen Rückfluß des Virus auf der Gehirnoberfläche zu vermeiden. </li><li> Verwenden Sie eine Naht nähen mit Kanüle, um die Haut zu versiegeln und Antibiotika gelten für die Wunde. </li><li> Der Zeitverlauf der ChR2 NpHR und funktionelle Expression von AAV-Vektoren in Abhängigkeit von der Versuchsplanung und virale Titer variieren. Für dieses Experiment in vivo </em&gt; Aufnahmen wurden 18-21 Tage nach der Injektion durchgeführt. </li></ol> 3. Licht Lieferung und In-vivo-Erfassung von ChR2 oder NpHR-exprimierenden Neuronen <ol><li> Bringen Sie eine Wolframelektrode (~ 1-1,5 MOhm, Mikrosonden) auf eine Glaskapillare (Fisher Scientific) mit Superkleber. </li><li> Verwenden Sie eine Faser Stripping Tool (Thorlabs), um das blanke Ende eines Multimode-Lichtwellenleiter (200 um Kerndurchmesser, Thorlabs) und sauber Faserspitze mit Ethanol aus. Sehr leicht punkten Faserspitze mit einem keilförmigen Diamantmesser (Thorlabs) und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Faser (zB mit feinen Pinzette). Die Faser sollte leicht in die Partitur zu spalten. </li><li> Verbinden des FC Ende der Faser an den PC-Anschluss an den Ausgangsanschluss eines 200 mW einzelnen Diodenlaser ( <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) mit der gewünschten Wellenlänge. Stellen Sie sicher, dass geeignete Schutzbrille wird zu allen Zeiten bei der Arbeit mit Lasern getragen. </li><li> Messen Sie die laser Intensität an der Spitze der optischen Faser mit einem optischen Leistungsmesser ( <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Für die in vivo-Aufnahmen kann die Lichtintensität so wenig wie 20 bis 100 mW / mm 2 zuverlässig wecken ChR2-oder NpHR-vermittelte Aktivierung oder Silencing bzw. neuronaler Aktivität. </li><li> Setzen Sie das optische Faser in die Kapillare. Positionieren Sie die Faserspitze etwa 500 um über der Spitze der Wolframelektrode und binden einen dünnen Faden zweimal an wenigen Stellen in der Nähe der Spitze, so dass die Elektrode und die Faser gerade sind. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Spitze der Elektrode und dem nächsten Knoten ist lang genug zum Einsetzen an die Zielregion. </li><li> Bereiten Sie das Tier wie in den Schritten 2.1 und 2.2. Verwenden Sie die Anfangs Kraniotomie als Leitfaden für eine neue, saubere kleine Fenster in den Schädel für die Positionierung des Optrode (machen <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). Machen Sie einen kleinen Schnitt an der dura mit einer feinen Nadel. </li><li> Die Optrode vorsichtig absenken durch den Schädel und Fenster in das Gehirn auf die transduzierten Region mit einem Mikromanipulator (Narishige). Dann vorab die Optrode langsam in 10-50 um Schritte, bis die Entstehung eines auf Licht reagierenden Zelle. </li><li> Eine kundenspezifische Software-Benutzerschnittstelle (Neurolux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ) in LabVIEW (National Instruments) geschrieben wird verwendet, um die einzelnen Diodenlaser zu steuern und zu visualisieren und aufzeichnen laufenden neuronalen Aktivität. Aufgezeichneten Signale werden mit einem EXAMP-20K (Kation Scientific) Verstärker Bandpass gefiltert (0,3-8 kHz) und National Instruments Analog-Digital-Karte (NI USB-6009) eingefangen. Die Neurolux Pro Benutzeroberfläche ermöglicht die Wahl der Analogeingänge (wählen Sie zwei Kanäle für die neuronale und TTL-Signal) und Digitalausgang. Der Benutzer kann die Abtastrate (20 kHz), die Baseline-Phase (Pre-Licht) und Post-Lichtperiode zu definieren. Der Benutzer kann die TTL-Laser stimulati definierenauf Impulsbreite, Frequenz und Stimulationsdauer (wenn Frequenz 20 Hz und Stimulationsdauer beträgt 500 ms, 10 Laserpulse mit definierter Impulsbreite geliefert werden). Der Benutzer kann auch Dauerlicht Lieferung wählen (z. B. Abbildung 1). Für wiederholte Aufnahmen kann der Benutzer auch die Anzahl der Pulszüge, und das Intervall zwischen den Zügen zu definieren. Daten können mit oder ohne Aufzeichnung auf der Festplatte erfasst werden. </li><li> Nach der Aufnahme werden die Tiere mit der Ketamin / Xylazin betäubt und Cocktail transkardial mit physiologischer Kochsalzlösung und Paraformaldehyd (4%), um Optrode Platzierung und Opsin-Expression zu verifizieren durchblutet. </li></ol>

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299(2007).</li>
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<li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2%2B%2Fcalmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li>
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<li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+local+circuits+in+vivo%3A+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li>
<li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+optogenetic+silencing+of+orexin%2Fhypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Eine Vielzahl von Techniken sind für genetisch-Targeting mikrobiellen Opsin-Gene auf diskrete Hirnregionen bei Nagetieren zur Verfügung. Virale Gentransfer eine relativ kostengünstige und schnelle Ansatz für die Vermittlung und ChR2 NpHR Ausdruck mit Zelltyp-Spezifität. AAV-Vektor-Systeme sind eine häufige Wahl für den Einsatz in optogenetische Experimente aufgrund der hohen Produktions Titer, die während der Lagerung, seinen Mangel an Pathogenität, und seine Fähigkeit, langfristige Genexpression 10 zu erzeugen stabil bleiben. Viele der Opsin-Konstrukte mit Zelltyp-spezifische Promotoren sind in einer Vielzahl von AAV-Serotypen von Vektor-Kerneinrichtungen wie der Universität von Pennsylvania (im Handel erhältlich <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) oder der Universität of North Carolina in Chapel Hill ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). Ein Nachteil bei der AAV-Technologie ist diebegrenzte Verpackungskapazität (~ 4,7 kb), die eine Beschränkung der Transgen-Kassette Größe, die für die zellspezifische Targeting eingesetzt werden können platziert. Als Alternative, lentivirale Vektoren, die eine größere Verpackungskapazität haben, können Opsin Targeting unter der Kontrolle von Promotorsequenzen größer aufzunehmen. Die Verwendung eines Optrode ermöglicht eine zuverlässige Erkennung von elektrophysiologischen Signalen in Kombination mit zeitlich präzise Licht Lieferung. Wie oben beschrieben, jedoch ausreichende Sorgfalt bei der Konstruktion erforderlich ist. Da die optische Faser gespalten ist zerbrechlich, kann binden den Faden zu fest bewirken, dass die Faser zu brechen. Obwohl der Optrode für mehrere Aufnahmen benutzt werden, sollte die Elektrode und die optische Faser vor dem Einsetzen gereinigt werden (oder manuell, im Fall der optischen Faser blanke Ende gespalten), da die Impedanz der Elektrode und der Qualität des abgegebenen Lichts wird abgebaut bei wiederholter Anwendung. Während electrophysiological Aufnahmen ist es wichtig, dass der Optrode langsam vorgeschoben werden. Das hier verwendete Optrode hat etwa 350 um Dicke (Wolfram-Elektrode: 125 um; Kern der Glasfaser: 200 um) und schnelle Absenken könnte die Bewegung von Hirngewebe führen. Lichtinduzierte Artefakte könnte auch mit besonderem Aufnahme-und Lichtabgabe-Set-ups 11-12 betrachtet werden. Obwohl wir fanden keinen lichtinduzierten Artefakt in unserer experimentellen Zustand können Aufnahmen außerhalb der transduzierten Gehirnbereich potentiell als Kontrolle für Licht Artefakte verwendet werden. Eine weitere Überlegung bei der Aufnahme ist die erforderliche Lichtintensität zur Beobachtung von Veränderungen in ChR2-oder-exprimierenden Neuronen NpHR, vor allem für Langzeitaufnahmen. Starke Laserintensität und langLaserBeleuchtung kann in der Gewebeschädigung und / oder eine verminderte Reaktion auf nachfolgende gelieferten Licht 12-13 führen. Für Verhaltensexperimente für ELIMINIERU die Verwendung eines viralen Vektors Steuer erforderlichg eine Wirkung aufgrund der Wärme von der Faser geliefert. Bei vielen der im Handel erhältlichen optogenetischen Konstrukte sind komplementäre Steuerkonstrukte, in denen das Opsin-Gen-Sequenz entfernt wurde. Man beachte, dass gentechnisch ChR2-Varianten mit verbesserten Eigenschaften und die Kinetik wurden zusammen mit anderen Silencing opsins, die für bestimmte experimentelle Fragestellungen 14-15 besser geeignet sein können, entwickelt werden. Zum Beispiel kann eine neue Variante ChR2 durch gezielte Mutagenese etabliert, die als &quot;cheta&quot; können High-Fidelity-Spiking-Neuronen bei Frequenzen (bis zu mindestens 200 Hz) oberhalb der ursprünglichen ChR2 14 anzutreiben. Die Kombination von in vivo Lichtabgabe und gleichzeitige Aufnahme von neuronalen Antworten ist ein entscheidender Schritt bei der Schaffung kausalen Beziehungen zwischen gemusterten Aktivität in genetisch gezielt Zellpopulationen und entsprechende Zeit-locked Verhaltens Veranstaltungen. Die Verfahren und hardware hier skizzierte einen einfachen Ansatz für die Umsetzung Optogenetik für in vivo-Kopf-Aufnahmen in festen Nagetiere.

Die Fähigkeit, einen bestimmten Zelltyp innerhalb eines neuronalen Schaltkreis in einem zeitlich präzise Mode aktivieren oder zum Schweigen zu bringen ist entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise verarbeiten verschiedene Arten von Informationen Emotion und Kognition zugrunde liegen. Experimentelle Kontrolle über intakte neuronale Aktivität hat loss-/gain-of-function Werkzeuge (z. B. elektrische Stimulation, pharmakologische Modulation, Läsion), die keine beschäftigte die selektiv zur Bekämpfung spezifischer Populationen von Neuronen, entweder auf einem zeitlichen oder räumlichen Skala erforderlich. Direkt Bewältigung dieser technischen Herausforderungen ist die Entwicklung und Anwendung von genetisch codierbar lichtempfindlichen Werkzeuge Neurowissenschaftlern ermöglicht, die elektrische Aktivität des ausgewählten Zelltypen während der gut definierten Verhaltens Ereignisse. Viele dieser lichtempfindlichen Proteine ​​sind mikrobiellen Ursprungs, mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, und der lichtgetriebenen Chloridpumpe, halorhodopsin (NpHR) 2,3, weit verbreitet. Ein großer Vorteil der Optogenetik ist die Fähigkeit, genetisch zielspezifische Zellpopulationen in heterogenen Hirnregionen und die Technik wurde erfolgreich in einer Reihe von Modellorganismen (wirbellose Tiere zu nicht-menschlichen Primaten) 6.4 angewendet. Es wurden viele optogenetische transgenen Tieren erzeugt und sind im Handel erhältlich 7,8 jedoch Schaffung transgener Linien können arbeitsintensiv und kostspielig ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll für viral vermittelte Abgabe von ChR2 und NpHR Gene unter der CaMKIIα Promotor in Ratten prelimbic Cortex und Rücken subiculum Verwendung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektor. Im Vorderhirn ist CaMKIIα Ausdruck exklusiv für glutamatergen Pyramidenzellen 9. AAV ist üblicherweise für die Grundlagenforschung aufgrund seiner relativen Einfachheit der Herstellung und das Fehlen von Pathogenität sowie verwendete starke und persiStent Transgen-Expression, die mit diesen Vektoren 10 erreicht wurde. Zusätzlich beschreiben wir die Schritte und Hardware für die gleichzeitige Aufnahme und Lichtabgabe bei narkotisierten Kopf fest Ratten.

<table><tbody><tr><td>Spritze </td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l</td></tr><tr><td>Abnehmbare Nadel</td><td>Hamilton</td><td>7803-03</td><td>31 Gauge, abgeschrägte</td></tr><tr><td>Spitze Mikroinjektorpumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Pumpensteuerung</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-MICRO4</td><td></td></tr><tr><td>Silikonöl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12728</td><td></td></tr><tr><td>Laserschutzbrille</td><td>Kentek</td><td>KMT-4501</td><td></td></tr><tr><td>Multimode-Glasfaser</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &mu; m Durchmesser Kern, 0,37 NA</td></tr><tr><td>Faserabisolierwerkzeug</td><td>Thorlabs</td><td>T12S21</td><td>für 200 &mu; m Durchmesser Kern Multimode Faser</td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Photodetektor</td><td>Newport</td><td>818-SL/DB</td><td></td></tr><tr><td>Blauer Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a> </td><td>gekoppelt an ein 200 &mu; m Multimode-Faser mit FC/PC-Adapter </td></tr><tr><td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>gekoppelt an ein 200 &mu; m Multimode-Faser mit FC/PC-Adapter </td></tr><tr><td>Wolfram/Faseroptrode</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td>Lumitrode</td></tr><tr><td>Glas Kapillarrohr</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Hydraulischer Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MO-22</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Kation Scientific</td><td>ExAmp-20K</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungsgerät</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td></td></tr><tr><td>Nagetier-Kopfstütze für Aufnahmen</td><td>Lumiphy LLC</td><<td>a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktische Einheit für Kleintiere</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 963</td><td></td></tr></tbody></table>

eine methode zur high fidelity optogenetische kontrolle der einzelpyramidenzellen<em&gt; in-vivo-</em

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetische Methoden als ein mächtiges Werkzeug für die Aufklärung neuronalen Schaltkreis-Aktivität eine vielfältige Reihe von Verhaltensweisen in einem breiten Spektrum von Arten zugrunde liegenden entstanden. Optogenetischen Werkzeuge mikrobiellen Ursprungs bestehen aus lichtempfindlichen Membranproteine, die in der Lage, neuronale Aktivität ingenetically definierten Zelltypen über verhaltensrelevanten Zeitskalen zu aktivieren (zB Channelrhodopsin-2, ChR2) oder Stille (zB Halorhodopsin, NpHR) sind. Wir haben zuerst einen einfachen Ansatz für Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von ChR2 und NpHR Transgenen auf die Rücken subiculum und prälimbischen Region des präfrontalen Kortex bei Ratten nachweisen. Da ChR2 und NpHR genetisch anzielbare, beschreiben wir die Verwendung dieser Technik, um die elektrische Aktivität von spezifischen Populationen von Neuronen (dh Pyramidenzellen) in heterogenen Gewebe mit hoher zeitlicher Genauigkeit eingebettet steuern. Wir beschreiben hier die Hardware, kundenspezifische SoftwareBenutzerschnittstelle, und Verfahren, die für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrische Aufnahme von transduzierten Pyramidenzellen in einem in-vivo-narkotisierten Vorbereitung zu ermöglichen. Diese lichtreaktions Werkzeuge bieten die Möglichkeit zum Identifizieren der kausalen Beiträge verschiedener Zelltypen, um die Informationsverarbeitung und Verhalten.

Abbildung 1 zeigt einen Screenshot der kundenspezifische Software (Neurolux Pro) in LabVIEW-Umgebung entwickelt (National Instruments) für die gleichzeitige Aufzeichnung von neuronaler Aktivität und Steuerung von Lichtimpuls-Parameter (dh Impulsfrequenz, Impulsbreite, Stimulationsdauer). Das Software-Programm sendet ein Befehlssignal zu einem digitalen Erfassungseinrichtung, die TTL-Impulse für die Kontrolle über die einzelnen Diodenlaser erzeugt. Zusätzlich werden die Software-Programm zeigt und speichert die aufgezeichneten neuronalen Aktivität und TTL-Signale geliefert. Diese Signale werden durch die Erfassungseinrichtung bei einer definierten Abtastrate (z. B. 20 kHz) digitalisiert. Zeichneten Signale werden als ein zweidimensionales Array mit doppelter Genauigkeit in einer Binärdatei gespeichert. Figur 2 zeigt die individuelle Optrode bestehend aus einer Wolframelektrode mit einer optischen Faser befestigt ist. Eine optische Faser wird an der Elektrode unter Verwendung dünner Faden an drei festenPunkten. Falls erforderlich, können Super-Klebstoff verwendet werden, um ihnen zu haften. Allerdings vermeiden dauerhaftes Fixieren der optischen Faser an die Elektrode, denn obwohl die Elektrode mehrmals Lichtübertragung durch die Faser wieder verwendet werden bei wiederholtem Gebrauch verschlechtern und sollten gespalten und gereinigt oder mit jedem Einsetzen in das Gehirn zu ersetzen. Linke Platten aus Abbildung 3 zeigen Fluoreszenzbilder der verstärkten gelb fluoreszierendes Protein, Anzeichen für eine tatsächliche und ChR2 NpHR Ausdruck. Diese Fotografien zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rattenrücken subiculum (3A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (3B). Viral-Expression wurde vor allem auf die Rücken subiculum und prälimbischen Kortex beschränkt (z. B. einige Fluoreszenz in Gyrus dentatus (Abbildung 3A, links)). Es wurden auch die Spuren der Elektrode (dünne Spur, Pfeilkopf) und Glasfaser (dicke Spur, Pfeil) beobachtet. Abbildung 4 zeigt, dass ChR2 induziert zeitlich präzise Spick in Ratten prälimbischen Kortex. 4A ist ein Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf 20 Hz Lieferung von 10 ms blauen Lichtimpulse Ratte prälimbischen Cortex. Raster Grundstück (4B) zeigt ChR2-induzierte Aktivierung in sechs Vertreter Neuronen. Alle aufgezeichneten Neuronen zeigte Licht-evozierte Spicken mit perfekter Treue. Im Gegensatz zu ChR2, NpHR schnell und reversibel spontane Aktivität in vivo in Ratten prälimbischen Kortex (rechts von Abbildung 4) zum Schweigen gebracht. 4C ist ein Beispiel zeigt, dass eine kontinuierliche Spur 532 nm Beleuchtung (10 s) der prälimbischen Kortex exprimieren NpHR unter der CaMKllα Promoter beseitigt spontane Single-Unit-Aktivität in vivo. Beachten Sie, dass die komplette Silencing prälimbischen Pyramidenzellaktivität ist zeit gesperrt, um die 10 Sek. Dauerlicht Lieferung. Niedriger Raster Grundstück (4D) zeigt NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Sowohl in vivo-Aufnahmen sind typisch für diejenigen von erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten erhalten, in dem AAV-vermittelte Abgabe von mikrobiellen Opsin Gene trat 18-21 Tage vor. Figur 5 zeigt das Ergebnis der wiederholte ChR2 Stimulation einer Ratte prelimbic Pyramidenzelle. Blaue Lichtimpuls (10 ms) wurde bei 20 Hz für 5 sec (100 Impulse gesamt) ausgeliefert. Spannung Spuren des Lichts hervorgerufenen Spick wurden immer wieder alle 2 Minuten während einer 2 Stunden Aufnahme-Session (61 Wiederholungen insgesamt) erworben. Selbst bei der Verwendung dieses wiederholende Stimulationsprotokoll, ChR2 induzierte stabile und robuste Spick in Reaktion auf die Lichtabgabe. 6 und 7 zeigen die Ergebnisse der NpHR-induzierte Photoinhibition und ChR2-driven Photoaktivierung von Ratte subicular Neuronenaktivität. Wie es der Fall in prelimbic Hirnrinde waren NpHR und ChR2 Lage,vermitteln die lichtinduzierte zeit gesperrt Hemmung und Aktivierung der Opsin-transduzierte subicular Neuronen mit hoher Reproduzierbarkeit. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Screenshot der Neurolux Pro-Software-Schnittstelle für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrophysiologische Aufnahme. Abgebildet Trace zeigt NpHR induzierten Silencing der spontanen Aktivität der Ratte prälimbischen Pyramidenzellen als Reaktion auf 10 Sek. Dauer 532 nm Lichtabgabe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> 2. Hohe Leistungs Bild von benutzerdefinierten Optrode. Eine optische Faser wird in Glaskapillare mit einer Wolframelektrode angebracht ist und mit der Elektrode mittels Faden fixiert. Der Abstand von Mitte zu Mitte zw.een die Elektrodenspitze und der Faserspitze ist etwa 500 um. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> 3. Viral-Expression und Optrode Platzierung. (Links) Fotos zeigen repräsentative NpHR Ausdruck in Rücken subiculum (A) und ChR2 Ausdruck in prälimbischen Kortex (B). (Rechts) Schematische, die den Ort, wo jedes Foto aufgenommen wurde darstellt. Die Pfeilspitze und Pfeil in jeder Photographie zeigen den Ort der Wolframelektrode und der optischen Faser auf. SUB: subiculum, DG: Gyrus dentatus, PL:. Prälimbischen Kortex <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Abbildung 4. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von ChR2 oder NpHR-transduzierte Ratte prelimbic Kortex. (A) Beispiel Spur von ChR2 ausgelöste Aktionspotentiale in Reaktion auf die Lieferung von 20 Hz Blau (473 nm) Lichtpulse (10 ms, blauer Balken). (B) Raster Diagramm, ChR2-induzierte Spick in sechs Vertreter Neuronen. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen. (C) Beispiel Spur von NpHR-induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität im Dauer Grün (532 nm) Lichtbeleuchtung (10 sec, grüner Balken). (D) Raster Diagramm, NpHR-induzierten Silencing in sechs Vertreter Neuronen. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> 5. Repetitive 20 Hz ChR2 getriebenen Spick einer Ratte prälimbischen Pyramidenzelle in vivo. (A) Spannung Spuren der Licht-evozierte Spickzu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 übernommen, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 6" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Abbildung 6. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen aus NpHR-transduzierte Rattenrücken subiculum. (A) Beispiel-Trace zeigt, dass 10 Sek. Dauer 532 nm Beleuchtung (grüner Balken) der Rücken subiculum ausdrücken NpHR beseitigt spontane Aktivität. (B) Durchschnittswellenformen der beiden aufgezeichneten Einheiten aus der obigen Spur. Die Amplitudenschwelle zum Identifizieren zwei unterschiedlichen Neuronen verwendet. (C) Raster Grundstück mit fünf Wiederholungens NpHR induzierten Silencing dieser Einheiten. Jede Aktivität wird als Punkt aufgetragen. <img alt="Fig. 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Abbildung 7. Repetitive 20 Hz CR2-driven Spick einer Ratte Rücken subicular Neuron in vivo. (A) Spannungs Spuren des Lichts hervorgerufene Spiking zu den Zeitpunkten 0, 30, 60 übernommen, 90, 120 min nach Beginn der Aufzeichnungen. Einschub: Platzen typische Aktivität dieser Zelle. (B) Diagramm, Raster alle 61 Wiederholungen (2 min inter-trial-Intervall, 120 min Gesamt) der lichtinduzierten Aktivierung. Jede Einheit Aktivität wird als Punkt dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als &quot;Optogenetik&quot;, ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, genetisch definierte neuronale Populationen auf einer physiologisch relevanten Zeitskala schnell zu aktivieren oder zu hemmen. Dies wird erreicht, indem ein viraler Vektor verabreicht wird, der Transgene enthält, die für den blaulichtaktivierbaren neuronalen Kanalopsin oder den grünes Licht benötigenden neuronensilenzierenden Halorhodopsin codieren, und diese gezielt in genetisch definierte Neuronen eingebracht werden. Als zweiter Schritt wird eine lichtemittierende optrode konstruiert, die aus einer an eine Ableitelektrode angebrachten Glasfaser besteht und gleichzeitige Lichtapplikation und elektrische Aufzeichnung ermöglicht.Anschließend wird die TRO über die Opsin-transduzierte Hirnregion positioniert und in diese hinein abgesenkt. Um Kanal-Opsin- und Ha-Opsin-vermittelte Antworten hervorzurufen, werden Ergebnisse erhalten, die eine lichtinduzierte Aktivierung und Hemmung von Kanal-Redsin- und Ha-Hallin-transduzierten Neuronen zeigen, basierend auf der Einzelzell-Aufzeichnungstechnik, die die Ableitung individueller Neuronen ermöglicht. Diese Methode adressiert ein grundlegendes Bedürfnis der Neurowissenschaft, indem sie es uns erlaubt, exakt zu bestimmen, wie effektiv Licht die neuronale Aktivität mit millisekundengenauer Zeitauflösung und in spezifischen neuronalen Subtypen steuern kann, und dies wird Chin Nakamura demonstrieren.Ein Postdoktorand in meinem Labor stellt sicher, dass beim Zubereiten und Umgang mit Viren die Biosicherheitsstufe eins eingehalten wird und dass alle lokalen und behördlichen Richtlinien im Zusammenhang mit Tieren beachtet werden. Vor der stereotaktischen Injektion lässt man eine Portion des Virus auf Eis auftauen und zentrifugiert sie kurz. In einer Tischzentrifuge wird eine Hamilton-Glasspritze und Nadel langsam mit einer kleinen Menge Silikon- oder Mineralöl rückgefüllt.Stellen Sie sicher, dass sich keine sichtbaren Luftblasen im Spritzenzylinder befinden. Setzen Sie die Spritze in eine Mikroinjektionspumpe ein und befestigen Sie die Pumpe direkt am vertikalen stereotaktischen Arm. Nachdem Sie das Virus-Aliquotenröhrchen in eine stabile Position gebracht haben, senken Sie den stereotaktischen Arm so weit ab, bis die Nadelspitze den Boden des Virus-Aliquotenröhrchens berührt. Verwenden Sie den Controller der Mikroinjektionspumpe, um das gewünschte Volumen des Virus zu aspirieren. Nach der Anästhesie einer Ratte mit Ketamin und Xylazin überprüfen Sie die Reflexantwort auf einen Zehenquetschreiz, um eine ausreichende Anästhesietiefe unter Verwendung standardmäßiger aseptischer Methoden sicherzustellen. Platzieren Sie das Tier in eine stereotaktische Vorrichtung, nachdem Sie mit kleinen chirurgischen Scheren oder einem Skalpell einen medianen Hautschnitt entlang der Schädelloberseite vorgenommen haben.L&ouml;sen Sie vorsichtig das Bindegewebe und reinigen Sie die Sch&auml;deloberseite mit einem kleinen Knochenkratzer. Senken Sie die Nadel ab, und &uuml;berpr&uuml;fen Sie, ob die Z-Koordinaten f&uuml;r bgma und Lambda identisch sind, um sicherzustellen, dass der Kopf waagerecht liegt. Bewegen Sie dann den stereotaktischen Arm zu den Koordinaten der gew&uuml;nschten Hirnstruktur.Markieren Sie die beabsichtigte Injektionsstelle mit einem chirurgischen Stift. Verwenden Sie einen Handbohrer, um den Schädel über dem Zielgebiet vorsichtig auszudünnen. Stoppen Sie, wenn der Bohrer die Schädelbasis erreicht, und entfernen Sie den ausgedünnten Knochen mit einer besonders feinen Pinzette.Nachdem die Dura freigelegt ist, positionieren Sie die Spritzennadel über dem Zielbereich und senken Sie die Nadel ab, bis sie die Dura berührt. Verwenden Sie diesen Punkt, um die z-Koordinate zu berechnen. Senken Sie nun die Injektionsnadel sehr langsam in das Gehirn ab, bis die korrekte Z-Position erreicht ist.In diesem Protokoll wird die prälimbische Region des medialen präfrontalen Kortex gezielt. Injizieren Sie das Virus mit einer Rate von 0,1 µL pro Minute. Warten Sie nach Abschluss der Injektion 10 Minuten, bevor Sie die Nadel zurückziehen, um einen Rückfluss des Virus an die Oberfläche des Gehirns zu vermeiden.Nachdem die Haut mit einer Nahtnaht und anhängender Nadel verschlossen wurde, antibiotische Substanz auf die Wunde auftragen. Zunächst eine Wolframelektrode mit einem Widerstand von 1 bis 1,5 Megaohm mit einem Glas-Kapillarrohr mittels Sekundenkleber befestigen. Anschließend mithilfe eines Fasernentmantelungswerkzeugs das freie Ende einer Multimode-Lichtwellenfaser freilegen und die Faserspitze sehr vorsichtig mit Ethanol reinigen.Bewerten Sie die Faser Spitze mit einem keilförmigen Diamantmesser und verwenden Sie feine Pinzette, um überschüssige Faser vorsichtig zu entfernen. Die Faser sollte leicht an der Kerbe abbrechen. Verwenden Sie ein optisches Leistungsmessgerät, um die Laserintensität an der Spitze der optischen Faser zu messen.Für in vivo-Aufnahmen kann eine Lichtintensität von lediglich 20 bis 100 Milliwatt pro Quadratmillimeter zuverlässig die kanalroten oder hallinvermittelte Aktivierung bzw. Hemmung der neuronalen Aktivität hervorrufen. Als Nächstes führen Sie die optische Faser in das Kapillarrohr ein. Positionieren Sie die Faserspitze etwa 500 Mikrometer über der Spitze der Wolframelektrode und binden Sie einen dünnen Nahtfaden an mehreren Stellen nahe der Spitze doppelt fest, sodass die Elektrode und die Faser gerade ausgerichtet sind.Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Spitze der Elektrode und dem nächstgelegenen Knotenpunkt ausreichend lang ist, um eine Insertion in die Zielregion wie hier gezeigt zu ermöglichen. Bereiten Sie das Tier wie zuvor für die Operation vor. Verwenden Sie dann die ursprüngliche Kraniotomie als Orientierungshilfe, um ein neues, sauberes, kleines Fenster im Schädel anzulegen.Zur Positionierung des TRO. Verwenden Sie eine feine Nadel, um einen kleinen Einschnitt in die Dura zu machen. Senken Sie den TRO vorsichtig mithilfe eines Mikromanipulators durch das Schädel-Fenster in das transduzierte Hirnareal ab.Dann bewegen Sie den Offroad langsam in Schritten von 10 bis 50 Mikrometern vorwärts, bis eine lichtempfindliche Zelle erscheint. Hier wird eine benutzerdefinierte Software-Oberfläche, die in LabVIEW geschrieben ist, verwendet, um den Einzeldiodenlaser zu steuern und die laufende neuronale Aktivität zu visualisieren und aufzuzeichnen. Die aufgezeichneten Signale werden mit einem Ex-AMP-20-K-Verstärker erfasst, der mit einem Bandpassfilter von 0,3 bis acht Kilohertz ausgestattet ist, sowie mit einer Analog-Digital-Karte von National Instruments.Die Benutzeroberfläche von Neuro Lux Pro ermöglicht die Auswahl analoger Eingänge und digitaler Ausgänge. Wählen Sie zwei analoge Kanäle für das neuronale Signal und für Transistor-Transistor-Logik oder TTL-Signale. Stellen Sie die Abtastrate auf 20 Kilohertz ein, die Baseline-Periode vor der Lichtphase auf zwei Sekunden und die Periode nach der Lichtphase auf zwei Sekunden.Danach legen Sie die TTL-Laserstimulationspulsbreite, Frequenz und Stimulationsdauer fest. Hier beträgt die Frequenz 20 Hertz und die Stimulationsdauer 500 Millisekunden, was bedeutet, dass 10 Laserpulse mit definierter Pulsbreite abgegeben werden. Der Anwender kann entweder eine kontinuierliche Lichtabgabe oder wiederholte Aufnahmen wählen.Sie können das Intervall zwischen den Impulsen und die Anzahl der Pulse wählen. Die Daten können mit oder ohne Aufzeichnung auf Datenträger erfasst werden. Nach der Aufzeichnung wird das Tier gemäß genehmigter Verfahren getötet, und das Gehirngewebe wird aufgearbeitet, um die Platzierung der Elektrode und die Opsin-Expression zu überprüfen, wie hier gezeigt.Dieser Screenshot der Neuro LX Pro-Software-Oberfläche, die für die gleichzeitige Lichtabgabe und elektrophysiologische Ableitung eingerichtet ist, zeigt die durch Hall Rod Dobson induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität einer rap prälimbischen parametralen Zelle als Reaktion auf 10 Sekunden kontinuierliche Lichtabgabe mit 532 Nanometer. Dieses Mikrofotografie zeigt eine repräsentative Hallo Redsin-Expression im dorsalen Ulu. Das Schema rechts stellt die Position dar, an der die Aufnahme gemacht wurde.Der Pfeil zeigt die Position der optischen Faser an, der Pfeilkopf die Position der Wolframelektrode. Diese Aufnahme zeigt eine repräsentative Kanalopsin-Expression im prälimbischen Kortex. Auch hier stellt das Schema rechts die Stelle dar, an der die Aufnahme gemacht wurde.Der Pfeil zeigt die Position der Wolframelektrode an, und der Pfeilkopf zeigt die Position der optischen Faser an. Diese beispielhafte Aufzeichnung aus dem prälimbischen Kortex der Ratte zeigt Channelrhodopsin-2-vermittelte Aktionspotentiale als Reaktion auf die 20 Hertz schnelle Applikation blauer Lichtpulse mit 473 Nanometer Wellenlänge, jeweils 10 Millisekunden lang, wie durch den blauen Balken unten angegeben. Das Rasterdiagramm zeigt Channelrhodopsin-2-induziertes Feuern in sechs repräsentativen Neuronen.Jede Einheitaktivität wird als Punkt dargestellt. Diese beispielhafte Spur zeigt eine durch Hall-Opsin induzierte Unterdrückung der spontanen Aktivität während einer kontinuierlichen grünen Beleuchtung mit 532 Nanometer Licht für 10 Sekunden, wie durch den grünen Balken im selben Hirnbereich angegeben. Das Rasterdiagramm zeigt die durch Haller-Dosin induzierte Stummschaltung in sechs repräsentativen Neuronen.Jede Einheitaktivität wird als Punkt dargestellt. Dieses Bild zeigt repetitive, durch Kanalrhodopsin bei 20 Hertz ausgelöste Aktionspotentiale eines prälimbischen parametalen Neurons der Ratte in vivo. Spannungsspuren der lichtinduzierten Aktivität, aufgezeichnet zu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Beginn der Aufnahme, sind auf der linken Seite dargestellt. Auf der rechten Seite zeigt das Rasteregramm alle 61 Wiederholungen der lichtinduzierten Aktivierung.Jede Einheitaktivität wird als Punkt dargestellt. Oben sind hier in vivo elektrophysiologische Ableitungen von Haller-Dossin-transduzierten Ratten-Dorsalsicms dargestellt. Die Beispielkurve zeigt, dass eine kontinuierliche 532 Nanometer-Beleuchtung über 10 Sekunden, angegeben durch den grünen Balken am dorsalen Subm, das Hall Dobson exprahiert, die spontane Aktivität unterdrückt.Im Folgenden sind die durchschnittlichen Wellenformen der beiden aufgezeichneten Einheiten aus der obigen Spur dargestellt. Die Amplitudenschwelle wurde zur Identifizierung von zwei unterschiedlichen Neuronen verwendet. Schließlich zeigt das Rasterdiagramm fünf Wiederholungen der Haller-Dossin-induzierten Stillegung dieser Einheiten.Jede Einheitaktivität wird als Punkt dargestellt. Schließlich zeigt dieses Bild wiederholte, 20 Hertz-Kanalrhodopsin-getriebene Aktionspotentiale eines dorsalen subikulären Neurons der Ratte in vivo, dargestellt durch Spannungsspuren der lichtinduzierten Spikes, die zu den Zeitpunkten 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten aufgezeichnet wurden. Auf der linken Seite sind die nach Beginn der Aufnahmen gezeigten Spuren zu sehen; der Ausschnitt unten zeigt die typische Burst-Aktivität dieser Zelle.Das Rasterdiagramm rechts zeigt alle 61 Wiederholungen der lichtinduzierten Aktivierung. Die Aktivität jeder Einheit ist als Punkt dargestellt. Diese Technik ist wichtig, weil sie zeigt, dass spezifische neuronale Subtypen über längere Zeiträume hinweg aktiviert oder stillgelegt werden können.Tatsächlich haben wir gezeigt, dass wir Neuronen über zwei Stunden aktivieren können. Letztendlich bestünde das Ziel darin, dies an Tieren anzuwenden, die Verhaltensaufgaben zur Aufmerksamkeit oder zum Gedächtnis durchführen, um bestimmte Schaltkreise zu aktivieren und zu untersuchen, wie diese unterschiedliche Gedächtnisfunktionen steuern.

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Neurowissenschaften

Dieses Video demonstriert die Methode, die Optogenetik zu nutzen, um die Netzwerkdynamik des Hippocampus zu modulieren, indem genetisch veränderte lichtempfindliche Interneuronen in einem Maushirnschnitt aktiviert werden, die Synchronisation der Theta-Oszillation verbessert und das Verhalten neuronaler Schaltkreise untersucht wird.

Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Hier beschreiben wir unsere Strategie, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen in der anästhesierten Mausrinde zu erhalten. Neuronen, die ChR2 exprimieren, werden durch ihre Reaktion auf blaues Licht identifiziert. Die Methode verwendet standardmäßige extrazelluläre Aufzeichnungsgeräte und dient als kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder visuell gesteuerten Pflasterung.

Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.

Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie drahtlose Optogenetik in Kombination mit Hochgeschwindigkeits-Videografie in einer einzigen Pellet-Reach-to-Grasp-Aufgabe verwendet werden kann, um die neuronalen Schaltkreise zu charakterisieren, die an der Leistung eines qualifizierten motorischen Verhaltens in sich frei bewegenden Mäusen beteiligt sind.

Im lebenden Organismus Drahtlose optogenetische Steuerung des motorischen Verhaltens

Wir haben einen vereinfachten und kostengünstigen Ansatz für die Elektrodenherstellung entwickelt und Aufzeichnungen von Signalen über mehrere Regionen hinweg in frei beweglichen Mäusen durchgeführt. Die Verwendung der Optogenetik in Verbindung mit der Multiregionen-Elektrophysiologie und der Kalziumsignalaufzeichnung ermöglichte die Aufdeckung neuronaler Aktivitäten über Regionen hinweg im Anfallskindling-Modell.

Eine integrierte Methode zur Herstellung flexibler und komfortabler elektrophysiologischer Optroden für die In-vivo-Aufzeichnung in mehreren Regionen

Erfahren Sie die optogenetische Kontrolle einzelner Pyramidenzellen in vivo mit hoher Präzision. Diese Methode ermöglicht die Aktivierung oder Hemmung spezifischer neuronaler Populationen mit Millisekunden-Auflösung für Neurowissenschaftler.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen

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