Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung und Quantifizierung von microRNAs, die in Exosomen vorhanden sind, die aus Blut oder Zellkulturmedien gewonnen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Exosomen aus Blut oder Zellkulturmedien mittels Differenzialzentrifugation gereinigt werden. Der zweite Schritt besteht in der Aufreinigung der gesamten exo-omalen RNA mit einem Nirvana-Mikro-RNA-Isolationskit.

Nach Bestätigung der Integrität und Konzentration der gereinigten RNA wird sie unter Verwendung von Reagenzien im Megaplex-Reverse-Transkriptase-Reaktionskit in CDNA umgewandelt. Als nächstes wird ein Pre-Amplification-Schritt mit Megaplex Preamp Primern und Attack Man Preempt Master Mix durchgeführt. Um die microRNAs zu amplifizieren, besteht der letzte Schritt darin, eine Echtzeit-PCR-Reaktion mit 2 384-Well-Mikrofluidikkarten oder TAC-Man-Array-Karten mit niedriger Dichte durchzuführen, die getrocknete TAC-MAN-Primersonden enthalten.

Letztendlich wird dieses Verfahren den Nachweis von bis zu 758 bekannten microRNAs ermöglichen. Diese Technik misst Schwankungen des exo-omalen microRNA-Gehalts, die von der Quelle und den physiologischen Bedingungen abhängen, unter denen sie sezerniert werden. Die Implikationen der Quantifizierung dieser einzigartigen Signaturen erstrecken sich auf die Entwicklung von Biomarkern und neuartigen therapeutischen Interventionen. Strategien.

Um dieses Verfahren zu beginnen, drehen Sie ein EDTA-beschichtetes Röhrchen mit 10 Millilitern Vollblut fünfmal um, um das Mischen des Antikoagulans sicherzustellen, und stellen Sie es 10 bis 60 Minuten lang aufrecht bei Raumtemperatur auf, zentrifugieren Sie dann die Probe 15 Minuten lang bei 2000 mal G und vier Grad Celsius, um das Blut zu trennen. Nehmen Sie nach 15 Minuten das Röhrchen aus der Zentrifuge und sammeln Sie das Plasma in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Plasma auf Eis und verdünnen Sie es mit der gleichen Menge PBS.

Mischen Sie dann die Probe vorsichtig und geben Sie sie für 30 Minuten bei 2000 mal G und vier Grad Celsius in die Zentrifugenzentrifuge. Nehmen Sie anschließend die Probe aus der Zentrifuge. Übertragen Sie das Röhrchen in ein neues Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie ein XPBS auf 24 Milliliter und zentrifugieren Sie 45 Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie ihn zwei Stunden lang bei 110.000 Mal G und vier Grad Celsius. Nach zwei Stunden.

Entnehmen Sie die Probe aus dem ultra und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Den Gaumen in gekühltem PBS resuspendieren und die Probe wieder in die Ultrazentrifuge geben. Nach der Zentrifugation eine Stunde lang bei 100.000 G und vier Grad Celsius drehen.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und suspendieren Sie den Gaumen in 300 Mikrolitern RNA-Lysepuffer. Alternativ kann die Probe in PBS- oder RIPPA-Puffer suspendiert werden. Bereiten Sie für die Elektronenmikroskopie bzw. Western-Blot-Analyse den Bereich für die Isolierung der RNA vor, indem Sie persönliche Schutzausrüstung tragen, Oberflächen und Pipetten mit RA-Zap abwischen und sterile Filterspitzen und -röhrchen verwenden.

Bestimmen Sie dann, ob eine Voramplifikation der RNA erforderlich ist, indem Sie die isolierte RNA mit einem Spektrometer für Proben mit mehr als 350 Nanogramm RNA quantifizieren. Eine Vorverstärkeramplifikation ist möglicherweise nicht erforderlich, es sei denn, das interessierende Transkript weist eine geringe Häufigkeit auf. Als nächstes bereiten Sie CD-NA aus gereinigter RNA mit Hilfe von Megaplex-Pools vor. Reverse Transkriptase-Primer.

Beginnen Sie damit, die Grundierungen auf Eis aufzutauen. Pool A und Pool B enthalten Primer für die Mikro-RNAs auf mikrofluidischen Karten, Array A und B, während sie auftauen, markieren zwei RNAs, freie 1,5-Milliliter-Röhrchen für die reverse Transkription mit Pool A-Primern oder Pool B-Primern und bereiten den Mastermix für jede getrennt von den Komponenten her, wie im Textprotokoll beschrieben. Achten Sie darauf, die Grundierungen von Pool A und Pool B getrennt aufzubewahren.

Dann die Röhrchen mit dem Mastermix sechsmal umdrehen und zentrifugieren Sie kurz 4,5 Mikroliter des RT-Reaktionsmixes in jedes Röhrchen der Mikrorampe, acht Röhrchenstreifen. Geben Sie anschließend drei Mikroliter der RNA-Probe, die zwischen einem und 350 Nanogramm RNA enthält, in jedes Röhrchen. Rühren Sie die Probe mit der Pipettenspitze um und verschließen Sie die Röhrchen.

Schleudern Sie die Proben kurz herunter und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Laden Sie nach der Inkubation die Reaktionsgefäße in die PCR-Maschine und lassen Sie sie unter den folgenden Bedingungen laufen. Wenn die PCR abgeschlossen ist, lagern Sie das CDNA bis zu einer Woche lang bei minus 20 Grad Celsius oder setzen Sie die Voramplifikation für Proben mit weniger als 350 Nanogramm fort.

Oder wenn das Transkript von Interesse in geringer Häufigkeit vorliegt, führen Sie die folgenden Schritte zur Vorverstärkerverstärkung durch: Beginnen Sie damit, den Vorverstärkerprimern für Pool A und Pool B auf Eis zu folgen und sie zum Mischen umzukehren. Als nächstes schwenken Sie den Tack Man Preempt-Mastermix und halten Sie ihn auf Eis. Bereiten Sie dann auch den Amplifikations-Mastermix vor.

Pipettieren Sie anschließend 2,5 Mikroliter des CD NA-Produkts in Mikroamper-Achterrohrstreifen und fügen Sie dann 22,5 Mikroliter des Reaktions-Mastermixes für die Vorverstärkeramplifikation hinzu. Zum Schluss inkubierst du die Röhrchen fünf Minuten lang auf dem Eis. Laden Sie dann die Probe in die PCR-Maschine und führen Sie sie unter den folgenden Bedingungen aus.

Nachdem die Preem-Amplifikationsreaktion beendet ist, zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz und geben Sie dann 75 Mikroliter 0,1 x Tris, EDTA pH 8,0 in jedes Röhrchen. Anschließend die Röhrchen kurz anrühren und herunterschleudern. Fahren Sie fort, um das tach man microRNA-Array zu laden, oder lagern Sie das verdünnte Produkt bis zu einer Woche lang bei minus 20 Grad Celsius.

Um die Proben für das tac MAN micro RNA Array vorzubereiten, kombinieren Sie 450 Mikroliter des tac man universal PCR Master Mix, neun Mikroliter des verdünnten Preamp-Amplifikationsprodukts und 441 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu einem RNAs-freien 1,5 Milliliter Röhrchen auf Eis. Mischen Sie dann das Röhrchen, indem Sie es sechsmal umdrehen und zentrifugieren Sie die Probe. Geben Sie kurz 100 Mikroliter des PCR-Reaktionsmixes in jeden Port der tac man micro RNA Array-Karte.

Zentrifugieren Sie die Karte anschließend eine Minute lang zweimal bei 1000 mal G und versiegeln Sie dann die Karte. Laden Sie als Nächstes das Array in den Thermocycler. Führen Sie anschließend die Proben unter Verwendung der standardmäßigen Temperaturwechselbedingungen durch, die mit den Primern im Applied Biosystems-Handbuch für das 384-Well-TAC-Man-Array mit niedriger Dichte bereitgestellt wurden, um die mRNA-Analyse im angewandten Biosystem 7, 900 HG schnelles Echtzeit-PCR-System durchzuführen.

Tauschen Sie zuerst die Heizblöcke aus, um eine 96-Well-Platte zu betreiben. Das links gezeigte Bild des Transmissionselektronenmikroskops zeigt Exosomen, die aus Mausblut isoliert wurden. Verwenden Sie die in diesem Video beschriebenen Methoden.

Das Bild auf der rechten Seite zeigt Exosomen, die aus Zellkulturmedien gereinigt wurden, und dann mit Gold markierte Anti-CD-81-Exosomen haben typischerweise einen Durchmesser von 30 bis 100 Nanometern. Die relative Häufigkeit normalisierter microRNAs, die in Exosomen gefunden wurden, die aus Nagetierblut, menschlichem Blut und humanen Aorten-Endothelzellkulturmedien isoliert wurden, wird hier als Delta-CT-Werte dargestellt, die auf U sechs RNA-endogene Kontroll-positive Delta-CT-Werte normiert sind, was darauf hinweist, dass die microRNA weniger häufig und negativ ist. Delta-CT-Werte deuten darauf hin, dass die microRNA häufiger vorkommt.

Nicht alle microRNAs sind in jedem Probentyp vorhanden. Zum Beispiel wurde nur 1 26 in Blutexosomen von Nagetieren nicht nachgewiesen und nur 200 C fehlen in H-A-O-E-C-Exosomen. Die restlichen vier microRNAs sind in allen drei Proben in unterschiedlichen Mengen vorhanden.

Obwohl sich dieses Protokoll auf die Charakterisierung exomaler microRNAs konzentriert, können einzelne Mr.NA Transkripte auch aus Exosomen mittels QPCR quantifiziert werden, wenn sie mit Mr.NA aus Vollblut verglichen werden. Exo Omal, RNA zeigte eine ähnliche Expression von TNF Alpha und vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A. Die Kombination dieser Techniken hat Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie den Weg geebnet, die Funktion zirkulierender RNAs zu erforschen. Bei der Vermittlung von Veränderungen der Genexpression und bei der Identifizierung molekularer Signaturen, die mit Exosomen sowohl im Normal- als auch im Krankheitszustand assoziiert sind.