Name: Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung von Exosomen aus Blut und Kulturmedien mittels Differentialzentrifugation und die anschließende microRNA-Profilierung mittels Real-Time-PCR. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von bis zu 758 bekannten microRNAs für Biomarker-Forschung.

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Diese Studie wurde durch Mittel aus Rita Allen Foundation Zuschuss für Seena Ajit unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Erika Balogh und Dr. Soumitra Ghoshroy von der University of South Carolina Electron Microscopy Center for Instrument Gebrauch, wissenschaftliche und technische Unterstützung zu bestätigen.

Alle Experimente mit Blutproben von Menschen und Nagetiere wurden in Übereinstimmung mit allen einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Aufsichtsbehörden ausgeführt. Menschliche Probanden wurden nach der Einwilligung durch den Drexel University College of Medicine Institutional Review Board und allen Verfahren durchgeführten Studien an Tieren wurden von Institutional Animal Care Drexel und benutzen gebilligten eingeschrieben. 1. Exosome Reinigung von Blut (~ 5,5 h) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Wir suspendieren exosomes von einem Röhrchen Blut (~ 10 ml menschlichem Blut und ~ 2 ml Blut der Maus) in 300 ul RNA Lysepuffer vom mirVana miRNA Isolation Kit. </li><li class="jove_content"> Um exosomes von Zellkulturmedien zu reinigen, wird das Medium bei 500 × g für 10 min zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und durch einen 0,22 um Filter nach Zentrifugation mit 12.000 x g filtriert. Die exosome Reinigung aus Zellkulturmedienerfordert keine Verdünnung in PBS, das PBS waschen oder die zweite Ultrazentrifugation. </li><li class="jove_content"> Wenn die gereinigten exosomes für Proteomstudien verwendet wird, das Hinzufügen eines Saccharosegradientenzentrifugation Schritt nach der Ultrazentrifugation wird der Anteil der Proteinaggregate und Verunreinigungen 15. </li><li class="jove_content"> Die beobachtete Morphologie exosomes kann sich je nach der Quelle und der Verarbeitungsschritte für TEM. Konnten wir nicht beobachten die schalenförmigen Morphologie für Exosomen, die zuvor auf Unterschiede in Probenaufbereitung 9,15 zugeschrieben. Unsere TEM-Bilder einschließlich der Immunogoldmarkierung sind ähnlich zu früheren Berichten aus verschiedenen Quellen, einschließlich Blut, Galle und kortikalen Kultur abgeleitet exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Umkehren EDTA beschichtete Röhrchen mit dem Blut und 5x Platz stehend bei Raumtemperatur für 10-60 min. </li><li> Zentrifuge bei 2.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li&gt; <li> Sammeln Sie die obere Schicht, das Plasma, in 15 ml-Röhrchen und halten auf dem Eis. </li><li> Verdünnte Flüssigkeit mit einem gleichen Volumen von PBS. Zentrifuge 30 min bei 2.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Übertragen in Zentrifugenröhrchen, fügen 1X PBS für ein Gesamtvolumen von 24 ml und zentrifugiert 45 min bei 12.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Transfer zum Röhren Ultrazentrifuge zentrifugiert 2 h bei 110.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Pellet in PBS und zentrifugieren 1 Stunde bei 100.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Pellet in geeigneten Puffer (RNA Lysepuffer). </li><li> Resuspendieren in PBS oder RIPA Puffer für Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analyse sind. </li></ol> 2. RNA Aufreinigung mithilfe eines modifizierten mirVana miRNA Isolation Kit (~ 1 Stunde) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen der persönlichen Schutzausrüstung (PSA), Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Obwohl das Protokoll vom Verkäufer bietet die Möglichkeit der Reinigung nur miRNA, die wir immer isolieren Gesamt-RNA einschließlich mRNA und miRNA, so dass wir beide aus der gleichen Probe zu studieren. </li><li class="jove_content"> Hinzufügen eines On-Column-DNase Behandlungsschritt entfernt Spuren von DNA, die vorliegen können. Je nach Quelle der exosomes hat DNA wurde berichtet, dass in exosomes von einigen Quellen einschließlich Maus und Mensch Mastzelllinien 8 aber chromosomale DNA-Sequenzen in exosomes von Medien von kultivierten Kardiomyozyten 18 gereinigt erkannt gereinigt fehlen. </li><li class="jove_content"> Wir reduziert das Volumen der Waschlösung 1 bis 350 ul (Schritt 2.4 unten), weil der Verkäufer liefert nur genug Waschlösung 1 für eine 700 ul hinaus. Wenn das Volumen nicht reduziert wird, gibt es nicht genügend Lösung für die Verwendung der gesamten Inhalte der links. Verbleibenden Schritte wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. </li></ul><ol><li> In 1/10 volumen von miRNA Homogenat Additive (30 ul) und Inkubation auf Eis für 10 min. </li><li> Auszug mit einem Volumen von Säure-Phenol: Chloroform gleich dem anfänglichen Lysat Volumen. Zentrifuge und wieder das obere Phase in ein frisches Röhrchen. </li><li> In 1,25 Vol. 100% Ethanol (375 ul). Vortex. Übernehmen, um Patrone filtern und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> Fügen Sie die Hälfte der empfohlenen Menge miRNA Waschlösung 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> In 10 ul DNase 1 bis 70 ul Puffer RDD (Qiagen) für jede Probe. In 80 ul bis Spalte und Inkubation 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> In Wash Solution 1 (350 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. </li><li> In Wash Solution 2/3 (500 ul) und zentrifugiert 15 sec bei 10.000 x g. Zu wiederholen. </li><li> Eluieren mit 40 ul 95 ° C Nuklease-freiem H 2 O. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration der RNA und RNA verdünnen bis 100 ng / ul. </li></ol> 3. miRNA Profiling von Exosomen von Blood TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten (~ 6,5 h) TIPPS <ul><li class="jove_content"> Bereiten Sie den Bereich für die Isolierung von RNA durch das Tragen von PSA, Wischflächen und Pipetten mit RNase Zap und mit sterilen Spitzen mit Filter und Rohre. </li><li class="jove_content"> Vorverstärkung (Pre-Amp) Schritt für 1-350 ng RNA (350-1,000 ng Proben erfordern keine Pre-Amp Schritt nach cDNA-Synthese) empfohlen. Es ist wichtig, um festzustellen, ob Pre-Amp, die für Ihre Probe ist, weil man alle Proben unter gleichen Bedingungen behandeln müssen. Pre-Amp-Schritt erhöht die Kosten und die Ct-Werte haben eine geringere akzeptabel abgeschnitten (32 statt 40). </li><li class="jove_content"> Es ist zweckmäßig, die Reaktion in cDNA Streifen Rohre anstelle Vorbereitung einer Platte abhängig von der Anzahl der Karten, die in einem einzigen Tag ausgeführt werden kann. Dies minimiert Gefrier-Tau von cDNA-Proben, die nicht am selben Tag verarbeitet wird. </li><li class="jove_content"> Exosomen aus verschiedenen Quellen gesammelt haben unterschiedmieten RNA-Mengen. Dieses Protokoll ermöglicht ein Maximum von 3 ul RNA-Matrize für die cDNA-Synthese-Reaktion. Je nach Quelle, die Höhe der exosomalen RNA, isoliert werden können vielleicht beschränkt. Während eine typische Gewebe genug wäre, dass RNA-Ausbeute von 100 ng cDNA RNA in 3 ul Volumen Exosomen aus menschlichem Blut oder Zellkulturmedien gemacht werden würde enthalten oft weniger RNA und cDNA müssen aus weniger Ausgangsmaterial hergestellt werden. Maus Blut exosomes einen höheren Gehalt an RNA und mindestens 100 ng in 3 ul erhalten werden kann. </li></ul><ol><li> Zur Herstellung von cDNA aus RNA gereinigt mit Megaplex Pools Reverse-Transkriptase-Primer (Pool A und Pool B enthalten Primer für die miRNAs auf mikrofluidischen Karten Array A und B), tauen die Reaktionskomponenten auf Eis. </li><li> Label zwei RNase-freies 1,5 ml Röhrchen für RT-Reaktion mit Pool A Primer oder Pool B Primer und Komponenten hinzufügen, um in der Tabelle. Fügen Sie mindestens ein zusätzliches Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix durch t empfohlener Anbieter. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> RT-Reaktion Bauteile </td><td> Komponente Konzentration </td><td> Volume 1 Probe (insgesamt V / Probe = 4,5 ul) </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td></td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT-Puffer (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ul </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0.20 ul </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 5 mM </td><td> 0,90 ul </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 ul </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer A oder B (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ul </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transkriptase </td><td> 75 U </td><td> 1.50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Umkehren Rohre 6 mal und Centrifuge kurz. Dann Pipette 4,5 ul RT-Reaktion Mischung in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion. </li><li> In 100 ng RNA und die Lautstärke zu 3 ul mit DEPC behandeltem Wasser oder fügen Sie 3 ul Gesamt-RNA, rühren mit der Pipettenspitze und dichten die Gefäße oder Teller. Spin kurz und Inkubation auf Eis für 5 min. </li><li> Legen Sie die Reaktion in der PCR-Maschine und führen Sie es unter den folgenden Bedingungen (wie von der Applied Biosystems Megaplex Pools Protokoll empfohlen): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühne </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Zyklus (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 Sek. </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Bewahren cDNA bei -20 ° C (gut für mindestens eine Woche) oder weiterhin pre-Amp Schritt, der für eine Woche gespeichert werden können. </li><li> Auftauen PreAmp Primer für Pool A und Pool B auf Eis und invertieren zu mischen. Swirl Taqman Pre-Amp Master mischen und halten auf dem Eis auch. </li><li> Folgen Sie dem Chart Zugabe von mindestens einem zusätzlichen Volumen von Komponenten für 2 oder mehr Reaktionen oder machen einen Master-Mix als vom Hersteller empfohlen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Pre-Amp Reaction Bauteile </td><td> Volume 1 Probe </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7,5 ul </td></tr><tr><td> Taqman PreAmp Master Mix (2X) </td><td> 12,5 ul </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primer A oder B (10X) </td><td> 2,5 ul </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipette 2,5 ul RT product in MicroAmp 8er Strips oder eine 96-Well-Platte MicroAmp optische Reaktion und verzichtet 22,5 ul PreAmp Reaktionsmix in jede Vertiefung. </li><li> Verschließen Sie die Platte, auf Eis 5 min inkubieren und laden Sie dann die Probe in der PCR-Maschine. Führen Sie unter den folgenden Bedingungen. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bühne </td><td> Temp </td><td> Zeit </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Zyklus (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sec </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Halten </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Nachdem die Reaktion beendet Preamp, kurz zentrifugieren oder Platte und fügen Sie dann 75 ul 0,1 X TE pH 8,0 in jede Vertiefung oder Rohr. </li><li> Seal und mischen und kurz drehen. Bewahren Sie das verdünnte Produkt für eine Woche bei -20 ° C oder weiter auf die Platte laden. </li><li> Kombinieren Sie die folgenden in einem RNase-freies 1,5 ml Röhrchen auf Eis. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bauteile </td><td> Volume 1 Karte </td></tr><tr><td> Taqman Universal-PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> Das verwässerte Preamp Produkt </td><td> 9 ul </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 441 ul </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Kehren Sie die Röhre zu mischen und kurz zentrifugieren. Je 100 ul PCR-Reaktionsmischung in jedem Hafen der TaqMan MicroRNA Array Karte. </li><li> Zentrifuge die Karte 2 x 1.000 g für 1 min. Verschließen Sie die Karte und führen Sie es mit der Vorlage mit den Primer in der Applied Biosystems Handbuches und der 384er Taqman Low Density Array-Einstellungen werden zur Verfügung gestellt. Wir verwenden Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time-PCR-System. </li></ol> 4. mRNA-Analyse von TaqMan (~ 1,5 h) <ol><li> Um qPCR Reaktion vorzubereiten, mischen Sie die Reaktions-Komponenten in der Reihenfolge in der Tabelle. Alle Proben werden mit Primer-Sonden für das Gen von Interesse sowie 18S rRNA-Gen als normalizer analysiert werden. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Taqman Reaction Bauteile </td><td> Volume 1 Probe </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7 ul (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe) </td></tr><tr><td> Taqman Schnelle Master Mix (2X) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Taqman Primer-Sonden (20x) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> cDNA von 100 ng RNA </td><td> 2 &amp; mu; L (Anpassung auf der Grundlage individueller Probe) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Führen Sie die 96-Well-Platte mit der Fast-96-Well-Block, wie vom Hersteller (Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System) empfohlen. </li></ol>

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Protokoll, zeigen wir die Quantifizierung von miRNAs und mRNAs von Exosomen durch differentielle Zentrifugation von Blut-und Kulturmedien gereinigt. Exosomen haben diverse Komponenten abhängig von ihren Ursprungs sind und in einer Reihe von biologischen Funktionen, wie Immunreaktion, Antigenpräsentation, intrazelluläre Kommunikation und die Übertragung von RNA und Proteinen 9,11,12,19,20 beteiligt. Während Größe und Form ist eine Determinante der exosome Reinheit, zeigen eine Reihe von Papieren, wel...

Kurze kodierenden miRNAs die Genexpression durch Bindung an die Ziel-mRNA. Seed Sequenzkomplementarität von ~ 7 Basenpaaren ermöglicht miRNA in die Ziel-mRNA, was zur Inhibierung der Translation oder Verringerung der Stabilität der mRNA, die beide in einer verminderten Expression des Zielproteins 1 Ergebnis binden können. Forschung in den letzten zehn Jahren hat eindeutig eine fundamentale Rolle für miRNAs bei der Vermittlung zellulärer Funktionen bewährt. Es hat auch erhebliche Anstrengungen zur Sezieren miRNA vermittelten molekularen Veränderungen zugrunde liegen verschiedene Krankheiten 2,3 gerichtet. Außerdem ebnete kürzliche Identifizierung von stabilen miRNAs in Körperflüssigkeiten 4-6 den Weg für ihre Verwendung als neue Biomarker zugänglich klinische Diagnose. Ein Modus von miRNA Transport in Körperflüssigkeiten ist via Exosomen, kleine Bläschen, die mRNAs tragen, Proteine, Lipidmediatoren und miRNAs an Empfänger Zellen über systemische Blut zirkulierendenion 7-14. Dies führt in der Modulation der Genexpression in Zellen des Empfängers und stellt einen neuen Mechanismus der zellulären Kommunikation. Zum Beispiel können Zellen modulieren immun-regulatorischen Prozesse durch Sekretion und / oder absorbierenden exosomes Biomoleküle enthaltenden in Entzündungen wie Interleukin-1β (IL1 &amp;bgr;), Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) beteiligt, transformierender Wachstumsfaktor-β5 (TGFβ5) und die miRNAs, dass diese Gene regulieren 13. Wie aberrante miRNA Expression ist ein gemeinsames Merkmal in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, bieten diese Moleküle spannende neue Möglichkeiten für die Entdeckung und Validierung neuer therapeutischer Targets 2. Zirkulierende miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der verschiedenen exosomes ist, basierend auf den Source-Zellen, von denen sie gelöst. So bieten sie einen Weg, um den physiologischen Zustand der Zellen zu untersuchen und wie die Zellen zu verändern, auch Signalisierungts in Reaktion auf Stress einschließlich Krankheiten. Studieren Änderungen in exosome Zusammensetzung kann Einblick in die Signaltransduktion stellen und untersuchen ihr Potential als Biomarker Dienstprogramm oder therapeutische Intervention Routen. Hier zeigen wir Ihnen die Reinigung von Exosomen aus mehreren Quellen auf veröffentlichten Protokollen. Diese exosomes wird für RNA-Isolierung durch qPCR gefolgt zu identifizieren und zu messen, die von miRNAs in den Exosomen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>EDTA-beschichteter Vacutainer (10 ml Röhrchen)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>Für die Exosomenaufreinigung aus menschlichem Blut</td></tr><tr><td>EDTA-beschichteter Vacutainer (2 ml Röhrchen)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Für die Exosomenaufreinigung aus Mausblut</td></tr><tr><td>PAXgene Blood RNA Tube</td><td>BD Diagnostics</td><td>762165</td><td>Für die miRNA-Isolierung aus dem Gesamtblut</td></tr><tr><td>miRVana microRNA-Isolationskit</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Säure-Phenol: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td> 4326614 <td>Für TLDA-Karten</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Nagetier Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp Nagetier Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4444747</tr><tr><td>Taqman Array Nagetier MicroRNA A+B Set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Human Pool Set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp Human Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Karten Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA RT Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman schneller universeller PCR-Mastermix </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>Für mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>Tumornekrosefaktor (Primersonde)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A (Primersonde)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima Erststrang cDNA Synthesekit für RT-qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>Für mRNA</td></tr><tr><td>HSP70 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>Für Western Blot</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Für die Elektronenmikroskopie</td></tr><tr><td>Kaninchen-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Nickel 300 mesh Kohlenstoff Formvar Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer 300 Mesh Carbon Formvar Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabelle 1. Tabelle der spezifischen Reagenzien.</td></tr></tbody></table>

reinigung und microrna profiling von exosomen aus blut und kultur medien abgeleitet

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stabile miRNAs sind in allen Körperflüssigkeiten und einige zirkulierenden miRNAs sind vor dem Abbau durch Sequestrierung in kleine Bläschen genannt exosomes geschützt. Exosomen mit der Plasmamembran, die zur Übertragung von RNA und Proteine ​​an die Zielzelle fusionieren. Ihre biologische Funktionen umfassen Immunantwort Antigenpräsentation und intrazelluläre Kommunikation. Versand von miRNAs die Genexpression in den Empfänger-Zellen über das Blut regulieren kann hat neuartige Wege für die Ziel-Intervention eröffnet. Neben dem Angebot einer Strategie für die Verabreichung von Medikamenten oder RNA Therapeutika können exosomalen Inhalt als Biomarker, die bei der Diagnose helfen, Bestimmung Behandlungsmöglichkeiten und Prognose dienen können. Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exos werdenomal Marker und PCR für mRNAs von Interesse. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren. Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs in Patienten, Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention zu quantifizieren. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen variations in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt. Hier werden wir das Verfahren für die quantitative Analyse von miRNAs und Boten-RNAs (mRNA) von Exosomen in Blut und Zellkulturmedien abgesondert beschreiben. Gereinigt wird exosomes gekennzeichnet mit Western-Blot-Analyse für exosomalen Marker und PCR für mRNAs von Interesse sein. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Immunogoldmarkierung wird verwendet, um exosomalen Morphologie und Integrität zu überprüfen. Gesamt-RNA aus diesen Exosomen gereinigt werden, um sicherzustellen, dass wir sowohl mRNA und miRNA aus derselben Probe studieren. Nach der Validierung durch RNA Integrität Bioanalyzer, führen wir einen mittleren Durchsatz quantitative real time PCR (qPCR), um die exosomalen miRNA TaqMan Low Density Array (TLDA) Karten und Genexpressionsstudien für Transkripte von Interesse zu identifizieren. Diese Protokolle können verwendet werden, um Änderungen in exosomalen miRNAs quantifizieren in Patienten Nagermodellen und Zellkulturmedien vor und nach pharmakologische Intervention. Exosomalen Inhalte variieren aufgrund der Quelle des Ursprungs und den physiologischen Bedingungen der Zellen, die Sekretion von Exosomen. Diese Variationen können Einblick darüber, wie Zellen und Systeme mit Stress oder physiologische Störungen bewältigen zu stellen. Unsere repräsentative Daten zeigen Variationen in miRNAs präsentieren in Exosomen aus Maus-Blut, menschlichem Blut und Zellkulturmedien gereinigt

Nach der Trennung von Exosomen aus Blut oder Zellkulturmedien, kann die Reinheit der Exosomen durch Elektronenmikroskopie (EM) und Western-Blot (1A und 1B) getestet werden. Wir bestätigten unsere exosome Präparate aus verschiedenen Quellen mit EM und Western-Blot unter Verwendung mehrerer Antikörper. 1A zeigt EM-Aufnahmen bestätigen, dass exosomes intakt mit einem Durchmesser von ~ 30 -100 nm und enthalten von CD81 Immungoldmarkierung. Häufig verwendete exosomalen Marke...

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mikro-RNAs nachzuweisen und zu quantifizieren, die in Exosomen enthalten sind, die aus Blut oder Zellkulturmedien gewonnen wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst mittels Differenzialzentrifugation Exosomen aus Blut oder Zellkulturmedien angereichert werden. Im zweiten Schritt wird mithilfe eines Nirvana-Micro-RNA-Isolationskits die gesamte exosomale RNA isoliert.Nach der Bestätigung der Integrität und Konzentration der gereinigten RNA wird diese mithilfe der Reagenzien aus dem Megaplex-Reversetranstranskriptase-Reaktionskit in cDNA umgesetzt. Anschließend erfolgt ein Vervielfältigungsschritt unter Verwendung der Megaplex-Preamp-Primer und des Attack Man PreAmp Master Mix. Zur Amplifizierung der Mikro-RNAs wird im letzten Schritt eine Echtzeit-PCR-Reaktion durchgeführt, wobei 2 384-Well-Mikrofluidikkarten oder TAC Man Low-Density-Array-Karten mit getrockneten TAC MAN-Primer-Sonden verwendet werden.Schließlich ermöglicht dieses Verfahren den Nachweis von bis zu 758 bekannten Mikro-RNAs. Diese Technik misst Variationen im exosomalen Mikro-RNA-Gehalt, die von der Herkunft und den physiologischen Bedingungen abhängen, unter denen sie sezerniert werden. Die Bedeutung der Quantifizierung dieser einzigartigen Signaturen reicht bis zur Entwicklung von Biomarkern und neuartigen therapeutischen Ansätzen.Um dieses Verfahren zu beginnen, invertieren Sie ein EDTA-beschichtetes Röhrchen mit 10 Milliliter Vollblut fünfmal, um eine gleichmäßige Vermischung des Antikoagulans sicherzustellen, und stellen Sie es 10 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur aufrecht. Zentrifugieren Sie danach die Probe bei 2000 ×g und 4 °C für 15 Minuten, um das Blut zu trennen. Entfernen Sie nach 15 Minuten das Röhrchen aus der Zentrifuge und sammeln Sie das Plasma in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Plasma auf Eis und verdünnen Sie es mit einem gleichen Volumen an PBS.Dann mischen Sie die Probe vorsichtig und geben Sie sie in die Zentrifuge, zentrifugieren Sie bei 2000 × g und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Entfernen Sie anschließend die Probe aus der Zentrifuge. Überführen Sie sie in ein neues Zentrifugenröhrchen.Geben Sie ein XPBS zu 24 Milliliter hinzu und zentrifugieren Sie bei 12.000 ×g und vier Grad Celsius für 45 Minuten. Danach überführen Sie das Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren bei 110.000 ×g und vier Grad Celsius für zwei Stunden. Nach zwei Stunden.Entfernen Sie die Probe aus dem Ultrazentrifugalmikroskop und pipettieren Sie vorsichtig das Überstand ab. Resuspendieren Sie das Präparat in kaltem PBS und stellen Sie die Probe erneut in die Ultrazentrifuge. Zentrifugieren Sie bei 100.000 × g und vier Grad Celsius für eine Stunde, nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist.Entfernen Sie das Überstandvolumen vorsichtig mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Präparat in 300 Mikrolitern RNA-Lysepuffer. Alternativ kann die Probe in PBS oder RIPPA-Puffer suspendiert werden. Bereiten Sie für die Elektronenmikroskopie beziehungsweise die Western-Blot-Analyse den Bereich zur Isolierung von RNA vor, indem Sie persönliche Schutzausrüstung tragen, Oberflächen und Pipetten mit R a's zap abwischen und sterile Filterpipettenspitzen sowie -röhrchen verwenden.Bestimmen Sie anschließend, ob eine Vervielfältigung der RNA erforderlich ist, indem Sie die isolierte RNA mit einem Spektrometer quantifizieren. Bei Proben mit mehr als 350 Nanogramm RNA ist eine Vorverstärkung möglicherweise nicht notwendig, es sei denn, das Transkript von Interesse liegt in geringer Menge vor. Bereiten Sie danach cDNA aus der gereinigten RNA unter Verwendung von Megaplex-Pools und Reverse-Transkriptase-Primern vor.Beginnen Sie damit, die Primer auf Eis aufzutauen. Während Pool A und Pool B die Primer für die mikro-RNAs auf den mikrofluidischen Karten Array A bzw. B enthalten, beschriften Sie zwei RNA-freie 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Reverse Transkription mit Pool-A-Primern bzw. Pool-B-Primern und bereiten Sie jeweils separat einen Master-Mix aus den in der Textanleitung beschriebenen Komponenten vor. Achten Sie darauf, die Primer aus Pool A und Pool B getrennt zu halten.Danach die Röhrchen mit der Master-Mixlösung sechsmal umstülpen und kurz zentrifugieren. Anschließend 4,5 µL der RT-Reaktionsmischung in jedes Röhrchen der Mikro-Ramp-Acht-Röhrchen-Streifen pipettieren. Als Nächstes 3 µL der RNA-Probe, die zwischen 1 und 350 Nanogramm RNA enthält, zu jedem Röhrchen hinzufügen. Die Probe mit der Pipettenspitze mischen und die Röhrchen verschließen.Zentrifugieren Sie die Proben kurz und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation füllen Sie die Reaktionsgefäße in das PCR-Gerät ein und führen die PCR unter den folgenden Bedingungen durch. Sobald die PCR abgeschlossen ist, lagern Sie das cDNA bei minus 20 Grad Celsius bis zu einer Woche lang oder fahren Sie mit der Vorvermehrung für Proben mit weniger als 350 Nanogramm fort.Oder wenn der gewünschte Transkript in geringer Menge vorhanden ist, führen Sie die folgenden Vorverstärfungsschritte durch. Beginnen Sie damit, die Vorverstärkungsprimer für Pool A und Pool B auf Eis zu pipettieren und vorsichtig zu mischen, indem Sie das Gefäß umdrehen. Danach wirbeln Sie die TackMan-Vorverstärkungsmastermix vorsichtig und stellen ihn auf Eis. Bereiten Sie anschließend die Amplifikationsmastermix vor.Pipettieren Sie anschließend 2,5 µL des CD-NA-Produkts in Mikro-Amp-8er-Röhrchenstreifen und geben Sie dann 22,5 µL der Präamplifikations-Reaktions-Master-Mix hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen abschließend fünf Minuten lang auf Eis. Danach laden Sie die Probe in die PCR-Maschine und führen sie unter den folgenden Bedingungen durch.Nach Abschluss der Vorverstärkungsreaktion die Röhrchen kurz zentrifugieren und anschließend 75 Mikroliter 0,1× Tris-EDTA, pH 8,0, zu jedem Röhrchen hinzufügen. Danach die Röhrchen kurz mischen und erneut zentrifugieren. Danach fortfahren, um die TaqMan Micro-RNA-Anordnung zu beladen, oder das verdünnte Produkt bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius lagern.Um die Proben für die tac MAN-Mikro-RNA-Anordnung vorzubereiten, geben Sie 450 Mikroliter der tac man universellen PCR-Master-Mix, neun Mikroliter des verdünnten Vervielfältigungsprodukts und 441 Mikroliter nukleasefreies Wasser in ein RNAsefreies 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Mischen Sie dann das Röhrchen, indem Sie es sechsmal umdrehen, und zentrifugieren Sie die Probe. Geben Sie anschließend kurz 100 Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung in jede Öffnung der tac man Mikro-RNA-Anordnungskarte ab.Als Nächstes die Karte zweimal bei 1000 × g für eine Minute zentrifugieren und anschließend versiegeln. Danach das Array in den Thermocycler einlegen. Anschließend die Proben mit den standardmäßigen thermischen Zyklenbedingungen gemäß der Anleitung von Applied Biosystems für das 384-Well-TAC-Man-Low-Density-Array laufen lassen, um die mRNA-Analyse im Applied Biosystems 7.900 HG Fast Real-Time-PCR-System durchzuführen.Zunächst wechseln Sie die Heizblöcke, um eine 96-Well-Platte laufen zu lassen. Das links gezeigte Bild des Transmissionselektronenmikroskops zeigt Exosome, die aus Mausblut isoliert wurden, unter Verwendung der in diesem Video beschriebenen Methoden.Das Bild rechts zeigt Exosome, die aus Zellkulturmedien gereinigt und anschließend mit Goldmarkierung gegen CD81 markiert wurden; Exosome weisen typischerweise Durchmesser zwischen 30 und 100 Nanometern auf. Die relative Häufigkeit normalisierter microRNAs in Exosomen, die aus Nagetierblut, menschlichem Blut und Kulturmedien humaner aortaler endothelialer Zellen isoliert wurden, ist hier als Delta-CT-Werte dargestellt, die auf die endogene U6-RNA-Kontrolle normalisiert sind. Positive Delta-CT-Werte deuten darauf hin, dass die microRNA weniger häufig vorhanden ist, negative Delta-CT-Werte, dass die microRNA häufiger vorhanden ist.Nicht alle Mikro-RNAs sind in jeder Probenart vorhanden. Beispielsweise wurde mere 1 26 in exosomalen Blutproben von Nagetieren nicht nachgewiesen, und mere 200 C fehlt in H-A-O-E-C-Exosomen. Die verbleibenden vier Mikro-RNAs sind in allen drei Proben in unterschiedlichen Mengen vorhanden.Obwohl sich dieses Protokoll auf die Charakterisierung von exosomalen Mikro-RNAs konzentriert, können einzelne mRNA-Transkripte aus Exosomen ebenfalls mittels qPCR quantifiziert werden, wenn sie mit mRNA aus Vollblut verglichen werden. Exosomale RNA zeigte eine ähnliche Expression sowohl von TNF-Alpha als auch von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor A. Die Kombination dieser Techniken hat Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie den Weg geebnet, die Funktion zirkulierender RNAs bei der Vermittlung von Genexpressionsänderungen sowie die Identifizierung molekularer Signaturmuster, die mit Exosomen in gesunden und krankhaften Zuständen assoziiert sind, zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Extrazelluläre Vesikel im Blut wurden als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten vorgeschlagen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Mikrovesikeln aus Plasmamembranen aus peripheren Blutproben und deren anschließende Analyse mittels konventioneller Durchflusszytometrie und Western Blotting vor.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie extrazelluläre MicroRNAs von Zellkulturmedien für kleine RNA Bibliotheksbau und Sequenzierung der nächsten Generation zu reinigen. Verschiedenen Qualitätskontrolle Checkpoints werden beschrieben, Leser zu verstehen, was beim Arbeiten mit niedrigen Eingabesamples wie ExRNAs zu erwarten.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Eine Exosom ist eine neue Generation von Drug Delivery Träger. Wir etabliert eine Exosom Isolierung Protokoll mit hoher Ausbeute und Reinheit für SiRNA Lieferung. Wir auch Eindringmittel gekennzeichneten unspezifische SiRNA in Exosomen gekapselt und die zelluläre Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Krebszellen untersucht.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Erfahren Sie die Reinigung von Exosomen aus Blut und Kulturmedien mittels Differentialzentrifugation und die anschließende microRNA-Profilierung mittels Real-Time-PCR. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von bis zu 758 bekannten microRNAs für Biomarker-Forschung.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

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