Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hühnerembryonen zu kultivieren, um die normale neuronale Entwicklung, insbesondere der spinalen Motoneuronen, aufrechtzuerhalten. Dazu wird zunächst der Hühnerembryo präpariert, um die viszeralen Organe zu entfernen. Der zweite Schritt besteht darin, den Embryo, der in einen Agaro-Block eingebettet ist, vorzubereiten und in Scheiben zu schneiden.

Als nächstes wird die Embryonenscheibe vorsichtig aus dem Agarro entnommen. Der letzte Schritt besteht darin, die Embryonenscheibe in ein Kulturmedium zu überführen, das 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie an dünnen Schnitten des Embryos verwendet, um das Vorhandensein und die Position von spinalen Motoneuronen nach der Kulturperiode zu zeigen.

Diese Methode kann also dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Mechanismen und Moleküle, die an der Migration von spinalen Motoneuronen beteiligt sind. Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da während der Dissektionsphasen des Protokolls viel Sorgfalt erforderlich ist.

Legen Sie befruchtete 10 Eier mit der längsten Seite waagerecht in einen Zwangszugbrutkasten bei 38 Grad Celsius, bis sie sich zu Hamburgern und Hamilton Stadium 24 entwickeln. Dies erfordert in der Regel eine Inkubationszeit von etwa vier Tagen. Am zweiten Tag der Inkubation sterilisieren Sie die Eierschale, indem Sie sie mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Seidenpapier abwischen, stechen Sie vorsichtig mit einer 21-Gauge-Nadel in das flache Ende der Eierschale, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, und entfernen Sie fünf Milliliter Albumin.

Dadurch wird der Embryo von der Schale weg abgesenkt, so dass der Embryo beim Öffnen der Schale nicht beschädigt wird. Legen Sie die Eier wieder in den Brutkasten und brüten Sie sie für weitere zwei Tage. Wenn die zwei Tage vergangen sind, verwenden Sie stumpf.

Tun Sie mehr. Nummer fünf, eine Pinzette, um vorsichtig die obere Mitte der Schale zu durchstechen und etwa neun Zentimeter große Quadratzentimeter der Schale zu entfernen. Schneiden Sie um den Embryo herum und heben Sie den Embryo vorsichtig heraus und setzen Sie ihn in HBSS ein.

Zum Sezieren. Alle verwendeten Embryonen sollten sich in der Nähe des Stadiums 24 befinden. Alle Embryonen, die Anzeichen einer Anomalie zeigen, sollten verworfen werden.

Legen Sie die Schale, in der sich der Embryo befindet, unter ein Seziermikroskop. Verwenden Sie zwei Pinzetten mit der Nummer fünf, um die Amnionenmembran zu entfernen. Die Chorio Alan zur Membran, der Alan Tous und der Kopf nehmen den Embryo anschließend aus, um alle inneren Organe zu entfernen, indem mit einer Mikropräparierschere die ventrale Mittellinie des Embryos geöffnet wird.

Halten Sie dann den Embryo mit einer Pinzette um die Region des rostralen Rumpfes. Fassen Sie den rostralen Teil des Darms und das Herz und ziehen Sie. Vierteljährlich. Sie sollten in der Lage sein, die Somiten des Embryos deutlich zu sehen.

Schneiden Sie nun die Brustkörperwand mit einer Mikrodissektionsschere ab. Schneiden Sie dann den Embryo quer zwischen den Knospen der oberen und unteren Gliedmaßen in zwei Hälften. Entfernen Sie vorsichtig die Lendenwirbelhälfte des präparierten Embryos mit zwei Zangen, um den Embryo aus der Sezierlösung zu wiegen, und legen Sie ihn mit einer Einweg-Nudelpipette von etwa fünf Zentimetern in eine trockene Petrischale.

Von unten geschnitten, saugen Sie etwa zwei Milliliter geschmolzene 4 % Gewicht pro Volumen an. Aros pipettiert in PBS etwa 0,5 Milliliter Aros auf den Embryo und saugt dann das Embryostück in die Pipette auf. Übertragen Sie den Embryo und den Aros in eine abziehbare Kunststoffform, ohne Blasen in den Aros zu bringen.

Senken Sie den Embryo vorsichtig mit dem Brustbereich nach unten auf den Boden des Aros in der Kunststoffform ab und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um sicherzustellen, dass der Embryo gerade ist. Der Agros enthält auch einen Teil der sich entwickelnden Gliedmaße, und es ist wichtig, dass die Embryonen vertikal im Aros positioniert sind, damit die Kunststoffform etwa zwei Minuten lang auf Eis gelegt werden kann. Achten Sie beim Festlegen des Aros darauf, dass der Embryo während dieser Zeit seine Ausrichtung nicht ändert.

Ähnlich wie beim VT 1000 S foma ähnlich aufstellen, so dass die Kammer mit HBSS gefüllt und von Eis umgeben ist. Kaltes Wasser. Befestigen Sie den Arous-Block mit Sekundenkleber auf der Vibram-Plattform und schneiden Sie den Block dann mit einer Rasierklinge ab, sodass das Embryostück von ein bis drei Millimetern Arous umgeben ist.

Starten Sie das Vibrato und beginnen Sie, den Embryo in Scheiben zu schneiden. Die Schnitte, die Gliedmaßenknospenabschnitte mit einem klaren apikalen elektrodermalen Kamm enthalten, werden ausgewählt und dann in eine Schale mit HBSS übertragen. In der Regel gibt es nur ein bis zwei geeignete Scheiben pro Embryo.

Entfernen Sie vorsichtig die Agarose um die Gewebescheiben herum mit zwei Nadeln. Es ist wichtig, dass dies gründlich und sorgfältig geschieht. Geben Sie 500 Mikroliter Kulturlösung in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekultur mit extrem geringer Anhaftung.

Übertragen Sie die Scheiben vorsichtig aus der HBSS-Lösung in die Vertiefung, legen Sie zwei oder drei Scheiben in jede Vertiefung und legen Sie dann die 24-Well-Platte in den Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden nach der Kulturperiode, bei 500 Mikrolitern ungepuffertem Fix in jeder Vertiefung der Embryoscheiben und lassen Sie sie 20 Minuten lang auf Eis. Saugen Sie dann die Gesamtlösung vorsichtig ab und waschen Sie sie dreimal im Fünf-Minuten-Intervall in PBS. Geben Sie dann 30% Saccharose in PBS in die Vertiefungen und stellen Sie die Platte etwa sechs Stunden oder länger bei vier Grad Celsius auf, bis die Scheiben einsinken.

Nachdem die Scheiben abgesunken sind, legen Sie die Scheiben in eine saubere 10 Zentimeter große Petrischale und tupfen Sie die überschüssige Saccharoselösung ab. Fügen Sie dann einen Milliliter OCT hinzu und lassen Sie die Scheiben fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius äquilibrieren. Montieren Sie jede Scheibe flach in eine mit OCT gefüllte, abziehbare Kunststoffform nach der Montage.

Stellen Sie die Formen zum Erstarren senkrecht auf Trockeneis, montieren Sie die OCT-Blöcke auf den Kryostaten und äquilibrieren Sie die Blöcke bei minus 24 Grad Celsius für etwa 20 Minuten. Schneiden Sie dann jede Scheibe in 15-Mikron-Abschnitte und montieren Sie sie auf Super Frosts plus Objektträger. Objektträger können bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, bis sie für die Immunfluoreszenzfärbung benötigt werden, wie im Textteil des Protokolls beschrieben, dieses Bild zeigt den Status der Erzeugung der lateralen motorischen Säule am Hamburger und Hamilton Stadium 24.

Die laterale Teilung der lateralen motorischen Säule wird durch LH X one Färbung im linken Feld visualisiert. Die laterale Motorsäule wird durch Färben mit Fox P eins in der Mittelplatte visualisiert, und die rechte Platte ist eine Verschmelzung der beiden Kanäle. Die Mittellinie ist als gestrichelte Linie dargestellt und DV bezeichnet hier die dorsale ventrale Achse.

Der Status der lateralen Teilung der lateralen motorischen Säule ist wiederum durch LH X eine Färbung in der linken Tafel und die laterale motorische Säule durch Fox P eine Färbung in der mittleren Tafel mit dem zusammengefügten Bild auf der rechten Seite dargestellt. Diese Bilder zeigen die Entwicklung im Stadium 27. Diese Bilder zeigen LH X, eine Expression auf der linken Seite und Fox P, eine Expression im mittleren Feld, in Abschnitten einer Schnitte, die in einem Medium kultiviert wurde, das das Überleben dissoziierter kranialer Motoneuronenzellen unterstützt.

LH X one wird nicht mehr in Motoneuronen exprimiert, obwohl es ein gewisses Überleben von LMC-Zellen gibt, was durch die Expression von Fox P one belegt wird. DV stellt die Ausrichtung der dorsalen ventralen Achse des Rückenmarks dar, und ML stellt die Ausrichtung der medialen lateralen Achse der lateralen motorischen Säule des Rückenmarks dar. Laterale Teilungszellen, die wiederum für LH X one im ventralen Horn im linken Panel und die LMC im Allgemeinen für Fox P one gefärbt sind, können in Scheiben beobachtet werden, die in einem Medium kultiviert wurden, das 4 % Kükenserum und 100 Nanogramm pro Milliliter CNTF enthält.

Beachten Sie, dass einige laterale Teilungszellen der motorischen Säule in einer lateralen Position im Bauchhorn zu finden sind, wie durch den Pfeil im linken Feld angezeigt. Dieses Bild zeigt den Status der Expression von LH X one und Fox P one in Schnitten eines Embryos, der während der Schnittkultur des zuvor gezeigten Embryos in OVO gehalten wurde. Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung des Prozentsatzes der lateralen Säulen-Lateral-Divisionszellen, die FOX P ein-positiv und LHX eins positiv färben, im Vergleich zu lateralen motorischen Säulenzellen, die FOX P ein-positiv und LHX eins färben.

Negative Daten werden für Zellen gezeigt, die in Scheibenkulturen unter anderen Bedingungen gefunden wurden als für Kontrollembryonen, die in Ovo gehalten wurden, was 100% der Daten entspricht, die mit dem T-Test der Studenten analysiert wurden. Das dreifache Sternchen stellt ein Signifikanzniveau von weniger als 0,01 dar, während dieses Protokoll versucht wird. Es ist wichtig, beim Präparieren des Embryos und bei der Entnahme des Agros aus den Scheiben vorsichtig zu sein, da es wichtig ist, die Integrität der motorischen Axone in der Knospe der Gliedmaßen zu erhalten.