Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Schnitte von Hühnerembryonen zu kultivieren, um die normale neuronale Entwicklung, insbesondere der Spinalmotoneurone, aufrechtzuerhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hühnerembryo seziert wird, um die Eingeweideorgane zu entfernen. Der zweite Schritt besteht darin, das in einem Agaroseblock eingebettete Embryo vorzubereiten und in Scheiben zu schneiden.

Anschließend wird die Embryoschnittprobe vorsichtig aus dem Agar entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, die Embryoschnittprobe in ein Kulturmedium zu überführen, das 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Abschließend wird mittels Immunfluoreszenzmikroskopie an dünnen Schnitten der Embryoschnittprobe die Präsenz und Lokalisation spinaler Motoneurone nach der Kulturphase nachgewiesen.

Daher kann diese Methode helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Mechanismen und Moleküle, die an der Migration spinaler motorischer Neurone beteiligt sind. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da während der Dissektionsabschnitte des Protokolls viel Sorgfalt erforderlich ist.

Legen Sie 10 befruchtete Eier mit der längsten Seite horizontal in einen Bebrütungskasten mit Zwangsluftzirkulation bei 38 Grad Celsius, bis sie sich bis zum Hamburger- und Hamilton-Entwicklungsstadium 24 weiterentwickelt haben. Dies erfordert gewöhnlich etwa vier Tage der Inkubation. Am zweiten Inkubationstag sterilisieren Sie die Eierschale, indem Sie sie mit einem in 70 % Ethanol getränkten Papiertuch abwischen, und perforieren vorsichtig das flache Ende der Eierschale mit einer 21-Gauge-Nadel, die an einer 5-Milliliter-Spritze befestigt ist, um 5 Milliliter Albumin zu entnehmen.

Dadurch wird der Embryo von der Schale weggedrückt, sodass der Embryo nicht beschädigt wird, wenn die Schale geöffnet wird. Stellen Sie die Eier zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie weitere zwei Tage lang. Sobald die zwei Tage verstrichen sind, verwenden Sie abgestumpfte.

Machen Sie mehr. Nummer fünf: Mit einer Pinzette vorsichtig die obere Mitte der Schale durchstechen und etwa neun Quadratzentimeter Schale entfernen. Um den Embryo herumschneiden, den Embryo vorsichtig herausheben und in HBSS legen.

Zur Dissektion. Alle verwendeten Embryonen sollten nahe dem Entwicklungsstadium 24 sein. Embryonen, die Anzeichen von Abnormalitäten zeigen, sollten verworfen werden.

Platzieren Sie die Schale mit dem Embryo unter ein Stereomikroskop. Entfernen Sie die Amnionmembran mit zwei feinen Nummer-fünf-Präparationsbestecken. Die Chorionallantoismembran, das Allantois und den Kopf entfernen, anschließend den Embryo ausweiden, um alle inneren Organe zu entfernen, indem mit feinen Präzisionsschere die ventrale Mittellinie des Embryos eröffnet wird.

Dann halten Sie das Embryo im Bereich des rostralen Rumpfes mit einem Paar Pinzetten fest. Greifen Sie den rostralen Teil des Darms und des Herzens und ziehen Sie daran. Vierteljährlich. Die Somiten des Embryos sollten deutlich sichtbar sein.

Schneiden Sie nun die Brustwand mit einer Mikroschere aus. Danach wird das Embryo quer zwischen den oberen und unteren Gliedmaßenanlagen in zwei Hälften geteilt. Entfernen Sie vorsichtig die lumbale Hälfte des präparierten Embryos mit zwei Pinzetten, indem Sie den Embryo aus der Präparationslösung herausschälen und ihn mit einer Einweg-Pasta-Pipette mit etwa fünf Zentimetern Länge in eine trockene Petrischale überführen.

Schneiden Sie von der Unterseite, saugen Sie etwa zwei Milliliter geschmolzenes 4 % Gewicht pro Volumen ab. Geben Sie etwa 0,5 Milliliter Aros in PBS vorsichtig auf den Embryo und saugen Sie dann das Embryostück in die Pipette auf. Übertragen Sie den Embryo und das Aros in eine ablösbare Kunststoffform, ohne Blasen im Aros einzuschließen.

Senken Sie das Embryo vorsichtig mit dem Thoraxabschnitt nach unten in das Agarose-Loch der Kunststoffform ab und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um sicherzustellen, dass das Embryo gerade liegt. Die Agarose enthält ebenfalls einen Teil des sich entwickelnden Gliedmaßes, und es ist wichtig, dass die Embryonen senkrecht in der Agarose positioniert werden. Stellen Sie die Kunststoffform für etwa zwei Minuten auf Eis, um die Agarose zu fixieren. Achten Sie darauf, dass sich die Lage des Embryos während dieses Zeitraums nicht verändert.

Richten Sie die VT 1000 S oder eine ähnliche Vorrichtung so ein, dass die Kammer mit HBSS gefüllt und von Eis und kaltem Wasser umgeben ist. Befestigen Sie den Aros-Block mit Sekundenkleber auf der Vibram-Plattform und schneiden Sie den Block anschließend mit einer Rasierklinge so zurecht, dass das Embryostück mit einem bis drei Millimeter Aros umgeben bleibt.

Starten Sie den Vibratome und beginnen Sie mit dem Schneiden des Embryos. Die Schnitte, die Abschnitte der Gliedmaßenanlage mit einer deutlichen apikalen ekktodermalen Leiste enthalten, werden ausgewählt und anschließend in eine Schale mit HBSS überführt. In der Regel gibt es pro Embryo nur ein bis zwei geeignete Schnitte.

Entfernen Sie vorsichtig das Agarose um die Gewebeschnitte herum mit zwei Nadeln. Es ist entscheidend, dass dies gründlich und sorgfältig durchgeführt wird. Geben Sie 500 µL Kulturmedium in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 24-Loch-Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte.

Überführen Sie die Schnitte vorsichtig aus der HBSS-Lösung in die Vertiefung, wobei zwei bis drei Schnitte pro Vertiefung platziert werden. Danach stellen Sie die 24-Loch-Platte 24 Stunden lang in den Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Anschließend geben Sie nach der Kulturzeit 500 Mikroliter ungepuffertes Fixativ zu jeder Vertiefung mit Embryoschnitten hinzu und lassen die Platte 20 Minuten lang auf Eis stehen. Danach saugen Sie die gesamte Flüssigkeit vorsichtig ab und waschen dreimal mit PBS in Abständen von jeweils fünf Minuten. Geben Sie anschließend 30 %ige Saccharose in PBS zu den Vertiefungen und stellen Sie die Platte etwa sechs Stunden oder länger bei vier Grad Celsius, bis die Schnitte absinken.

Nachdem die Schnitte gesunken sind, überführen Sie sie in eine saubere 10 cm große Petrischale und tupfen Sie die überschüssige Saccharoselösung vorsichtig ab. Geben Sie dann ein Milliliter OCT hinzu und lassen Sie die Schnitte fünf Minuten lang bei 20 Grad Celsius equilibrieren. Bringen Sie jeden Schnitt flach in einer mit OCT gefüllten, ablösbaren Kunststoffform an, nachdem er befestigt wurde.

Stellen Sie die Formen vertikal auf Trockeneis, um sie zu verfestigen, montieren Sie die OCT-Blöcke am Kryostaten und äquilibrieren Sie die Blöcke bei minus 24 Grad Celsius für etwa 20 Minuten. Schneiden Sie danach jeden Block in 15 µm dicke Schnitte und bringen Sie diese auf SuperFrost-Plus-Objektträgern auf. Die Objektträger können bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie für die immunfluoreszenzgefärbte Färbung benötigt werden, wie im Textteil des Protokolls beschrieben. Dieses Bild zeigt den Entwicklungsstand der lateralen motorischen Säule im Hamburger-und-Hamilton-Stadium 24.

Die laterale Unterteilung der lateralen Motoneuronensäule wird im linken Panel durch LHX1-Färbung sichtbar gemacht. Die laterale Motoneuronensäule ist im mittleren Panel durch Anfärbung mit FoxP1 sichtbar, und das rechte Panel zeigt eine Überlagerung der beiden Kanäle. Die Mittellinie ist als gestrichelte Linie dargestellt, und DV bezeichnet hier die dorsoventrale Achse.

Der Zustand der lateralen Abteilung der lateralen motorischen Säule wird erneut durch LH X eins-Färbung im linken Panel und die laterale motorische Säule durch Fox P eins-Färbung im mittleren Panel dargestellt, wobei das überlagerte Bild rechts zu sehen ist. Diese Aufnahmen zeigen die Entwicklung im Stadium 27. Die Bilder zeigen die Expression von LH X eins links und die Expression von Fox P eins im mittleren Panel in Schnitten einer in einem Medium kultivierten Gewebescheibe, das das Überleben dissociierter kranialer motorischer Neuronen unterstützt.

LH X one wird in den Motoneuronen nicht mehr exprimiert, obwohl eine gewisse Überlebensfähigkeit der LMC-Zellen durch die Expression von Fox P one nachgewiesen ist. DV stellt die Orientierung der dorsoventralen Achse des Rückenmarks dar, und ML stellt die Orientierung der medio-lateralen Achse der lateralen motorischen Säule des Rückenmarks dar. Laterale Teilungszellen, erneut gefärbt für LH X one im Vorderhorn im linken Panel und die LMC allgemein gefärbt für Fox P one im mittleren Panel, können in Schnitten beobachtet werden, die in Medium kultiviert wurden, das 4 % Hühnerserum und 100 Nanogramm pro Milliliter CNTF enthält.

Beachten Sie, dass einige Zellen der lateralen Abteilung der lateralen Motoneuronensäule in einer seitlichen Position im Vorderhorn liegen, wie durch den Pfeil im linken Panel angezeigt. Dieses Bild zeigt den Expressionsstatus von LHX1 und FoxP1 in Schnitten eines Embryos, der während der zuvor gezeigten Schnittkultur im Ovo aufbewahrt wurde. Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung des Prozentsatzes an Zellen der lateralen Abteilung der lateralen Motoneuronensäule, die positiv für FOXP1 und LHX1 sind, im Vergleich zu Zellen der lateralen Motoneuronensäule, die positiv für FOXP1 und LHX1 sind.

Negativen Daten werden für Zellen angezeigt, die in Gewebsschnitten unter verschiedenen Bedingungen im Vergleich zu Kontrolle-Embryonen, die in ovo gehalten wurden und 100 % darstellen, gefunden wurden. Die Daten wurden mittels Students T-Test analysiert. Die drei Sternchen repräsentieren ein Signifikanzniveau von weniger als 0,01. Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, beim Dissektieren des Embryos und beim Entfernen der Agarose aus den Schnitten sorgfältig vorzugehen, da es entscheidend ist, die Integrität der motorischen Axone im Limbus zu bewahren.