Name: Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Lernen Sie die selektive Markierung von auditorischen Fasern im Hühnerembryo durch Mikroinjektion in das akustische Ganglion. Diese Methode ermöglicht präzise Tracing-Studien zur Entwicklung des auditorischen Nervensystems.

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Die Autoren danken Dr. Candace Hsieh für Anregungen und Unterstützung danken, mit bildgebenden Verfahren und Dr. Doris Wu für Kompetenz auf chick Innenohr Anatomie während der frühen Embryogenese. Diese Arbeit wurde von der NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 und DOE GAANN P200A120165 unterstützt.

Ein. Bereiten Sie die folgenden Dissection Tools und Reagenzien <ul><li> Künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF; 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM HEPES, 10 mM Glucose, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) kontinuierlich mit 95% O infundiert 2/5% CO 2 bei Raumtemperatur. Infusionslösung, zu 2/3 eine 500 ml Nalgene Weithals-Glas mit einem Loch im Deckel gebohrt füllen. Tank wird über einen Schlauch zu einem Glasfuß Gasspüler, der die aCSF dringt durch das Loch im Glas Deckel befestigt werden. Passen Druck, um einen konstanten Strom von Blasen, die etwa 1/3 der Flüssigkeit zu erreichen, sind aber nicht stark genug, um zu bewirken spritzt über die Felge zu erhalten. Submerge 5 ml Glasampullen (bis 6) in das Glas zu Nalgene einzelnen Proben voneinander und aus dem Gasstrom Turbulenzen zu trennen. ACSF sollte mindestens 20 Minuten vor jedem Gewebe Inkubationszeit Sauerstoff versorgt werden. </li><li> Kleine Silikon-Dissektion Teller (35 mm x 10mm Petri beschichtet mit Sylgard Elastomere Kit) mit zwei Dissektion Stifte in kleine sechseckige Polystyrol gelegt (47 mm unten) Wiegeschiffchen. </li><li> Zwei feinen Spitze-Zange, eine gekrümmte Spitze-Zange, einer 50 ml-Becher, und einen Behälter für das Tissue Abfall. </li><li> Gezogen Glasmikropipette (1,2 OD / 0,9 ID) zerbrochen zu etwa 20-50 um die Öffnung an der Spitze und mit Rhodamin Dextran Amin (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in einer 6,25% igen Lösung mit 0,4% Triton X-100 in PBS . Bringen Sie durch feine Schlauch an picospritzer und Mikromanipulator stabilisieren. </li></ul> 2. Micro-Dissektion Basilar Papilla am E8 4,5 Reveal <ol><li> Mit gebogenen Pinzette, schneiden E8 Embryo direkt unter dem Hirnstamm, indem Kopf direkt auf silikonbeschichteten Dissektion Gericht in Wiegeschiffchen. </li><li> Mit Dissektion Stifte, positionieren Sie den Kopf mit einem ventral so das Ohr auf der Seite von Interesse ist leicht sichtbar, geneigt der Kopf leicht nach dorsal und zeigt 10-30 Grad weg von center (Abbildung 2A). Unmittelbar sichern den Kopf mit Stiften. Wenn bilateralen Ablaufverfolgung gewünscht wird, in der Mitte der Kopf bei 0 Grad, oder eine vollständige ventral, so dass beide Seiten zugegriffen werden kann. Ähnliches gilt bei einer linksseitigen Injektion, sichern den Kopf bei -10 bis -30 Grad von der Mitte, so dass die linke Seite zugänglich ist. </li><li> Mit dem 50-ml-Becher, übertragen 30 ml des oxygenierten aCSF in die Schüssel, voll Eintauchen des Gewebes. </li><li> Fassen und schälen sich den Unterkiefer mit feiner Spitze Pinzette, dann entfernen Sie das untere Augenlid auf der Seite von Interesse. </li><li> Entfernen Sie den darüberliegenden Gefäßgewebe, einschließlich aller übrigen Gaumen und Kehle. Diese weichen Geweben sollte abzuschälen enthüllt die glatte Oberfläche zu entwickeln Chondrocranium mit den unverwechselbaren Vertebralarterien an seiner Oberfläche. Zu diesem Zeitpunkt sollte die charakteristischen weißen otoconial Masse sichtbar sein. </li><li> Vorsichtig zu sezieren die Haut um den äußeren Gehörgang, Knorpel des Kiefergelenks und des Mittelohrs, während die inner Ohr intakt. Verwenden Sie die Pinzette vorsichtig weggeschnitten diese knorpeligen Strukturen. </li><li> Entfernen Vertebralarterien und Bündelung Blut mit einem sanften Kehrbewegung mit den feinen Pinzette Tipps. Blut kann darüber hinwegtäuschen, Ansicht und Koagulation kann die Injektionspipette Öffnung stecken. </li><li> Das Cochlea Kanal mit benachbarten Sinnesepithel (basilaris Papilla) und akustische Ganglion liegt direkt unterhalb der Chondrocranium 6 und kann als länglicher fingerartigen Vorsprung aus dem Innenohr ventral, mit der am weitesten distalen Spitze (Apex) in der Nähe des vorderen visualisiert Mittellinie 5. Es kann eine kleine Ansammlung von Blut (rote) werden aus der Dissektion und / oder otolithic Verkalkungen (weiß) im Scheitelpunkt des Cochlea Kanal (2B), die in Visualisierung unterstützen kann. An der Spitze ist die lagenar Makula, dachte eine sensorische Patch der vestibulären Funktion 7,8 sein. </li></ol> 3. Selektive Markierung von CN VIII Auditory Fibers <ol><li&gt; Legen Sie die Injektionspipette in der Nähe des Embryos Fläche an der Ductus cochlearis und basiläre Papille Region. </li><li> Langsam senken die Mikropipette zum ersten Punktion der Schädel. Diese Oberkopf ist dünner als die Umgebung und erfordert weniger Kraftaufwand zu durchdringen. Die Mikropipette sollte nun im Inneren des Ductus cochlearis sein. Optional: eine kleine Injektion von Tracing Farbstoff kann hier gemacht werden, um in die Visualisierung der basilaris Papilla unterstützen. </li><li> Ohne Neupositionierung der Mikropipette weiter senken, bis es nur Verstöße gegen die tief Rand des Ductus cochlearis (Abbildung 1). Durchführen einer Injektion und wiederholen hier in mehreren Bereichen entlang der Länge des basilaren Papille (2C, 2D) mit Ausnahme des am meisten proximalen Spitze, wo der vestibulären Lagena befindet. Mit dem picospritzer zwischen 10-30 psi eingestellt ist, werden mehrere Injektionen gemacht. Das Volumen des injizierten Farbstoff Fluids variiert und hängt von dem Ausmaß der gewünschten Etikettierung. Jede Injektion sollte in einem Fluoreszenzfarbstoff-la führenBeled Ort von etwa 200 bis 400 Mikrometer Durchmesser (2D). </li><li> Sobald die Injektion abgeschlossen ist, verwenden Pinzette, um die Probe oberhalb des Hirnstamms durchschneiden und verwenden Sie eine Pipette, um den kaudalen Teil in einen kleinen Topf legen im Behälter aCSF kontinuierlich mit 95% O 2/5% CO 2 durchströmt. </li><li> Für jedes Embryo erlauben 20-30 min zur Farbstoffübertragung, abhängig vom Abstand der zentralen Tracing gewünscht. </li><li> Entfernen Gewebe und die Vorbereitungen für histologische Schnitte. In dem hier gezeigten Beispiel wird Gewebe in 4% Paraformaldehyd (in 1X PBS) über Nacht, 30% Saccharose (in 1X PBS) über Nacht eingetaucht. </li></ol> 4. Gegenfärbung und Analyse <ol><li> Gegenfärbung ist nützlich, um zu helfen orient der Beobachter an anatomische Lage sowie zu identifizieren bestimmte Regionen von Interesse. Eine wirksame Gegenfärbung in dieser Zubereitung ist Neurofilament Immunmarkierung (Figuren 1, 3B, 3E), die stark l MitAbels Axonen und ermöglicht Abgrenzung der axonalen Bahnen im ZNS. </li><li> Analyse sollte während der markierten Region durchgeführt werden, wie die Vorsprünge können mehrere hundert Mikrometer oder mehr entlang der Achse rostrokaudalen erstrecken. Einige Beispiele für grundlegende Untersuchungen sind: Targeting Fehlerraten, Timing und / oder Veränderungen der Divergenz der Projektionsmuster. RDA-markierte Axone visualisiert im peripheren und zentralen Nervensystems mit hoher Auflösung (3A, 3D). </li></ol>

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<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
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<li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144(2009).</li>
<li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution%3A+revisiting+a+10-year-old+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt werden.

Studien der frühen Entwicklung des VIII. Nerven wurden zum Teil wegen der Schwierigkeiten bei der Ermittlung embryonalen Axone aus mehreren verschiedenen Ganglien begrenzt. Mehrere Studien haben die molekularen Signale Führung auditorischen und vestibulären sensorischen Zellen und Ganglienzellen Schicksale während der frühen Entwicklung, 5,11,12 erforscht, aber die Prozesse, die die zentrale Innervation müssen noch bestimmt werden. Berichte von akustischen Ganglienzellen Projektionen beschreiben typischerweis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polystyrol Wiegen Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Verwenden, um Silikon-Dissektion Gericht zu machen </td></tr><tr><td> Sylgard Silikon-Elastomer Kit </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td><td> Coat Petri zu machen Dissektion Gericht </td></tr><tr><td> Dissection Pins </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Hält Embryo im Ort während der Präparation </td></tr><tr><td> NaCL </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Teil aCSF Rezept </td></tr><tr><td> Behälter für aCSF. Vorschlagen transluzenten Weithals-Nalgene Flasche, 500 ml (16 oz) mit Deckel. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Bohrloch Öffnung an der Oberseite des Deckels für Glas bubling Stammzellen zu durchdringen Flüssigkeit </td></tr><tr><td> Leere 5 ml Glasfläschchen oder vergleichbaren transparenten Flasche </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; während aCSF Inkubation verwenden, um Proben getrennt von einander und von der sprudelnden Strom </td></tr><tr><td> Tank von Carbogen (95% O 2/5% CO 2) durch einen Schlauch zur Waschflasche verbunden </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Bringen Sie durch einen Schlauch zu Glasfuß Bubbler zur Infusion in aCSF </td></tr><tr><td> Glasfuß Bubbler </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Um Carbogen in aCSF einzuflößen </td></tr><tr><td> Curved-Spitze Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501008 </td><td> Um Embryo Kopf vom Ei entfernen </td></tr><tr><td> Zwei feine Spitze Pinzette </td><td> World Precision Instruments </td><td> 501985 </td><td> Für Mikro-Dissektion </td></tr><tr><td> 50 ml Becherglas </td><td> verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin Dextran Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> verschiedene </td><td> Fluorescent Axon Tracer </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline, (1X PBS) </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Standard-Lab-Reagenz </td></tr><tr><td> Thin Wall Glaskapillaren 1,2 OD, 0,9 ID 4 &quot;(100 mm) Länge </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW120F-4 </td><td> Legen Sie mit RDA. Jede Kapillare macht zwei Glasmikropipetten </td></tr><tr><td> Needle / Pipette puller </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 720 </td><td> Einstellungen verwendet: Heat 16,4, Solenoid 2,2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> verschiedene </td><td> Bringen Sie durch feine Schlauch an Glasmikropipette </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> verschiedene </td><td></td></tr><tr><td> Dissection Mikroskop mit Fluoreszenz </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd </td><td> Verschiedene </td><td></td><td> Standard-Lab-Reagenz </td></tr><tr><td> anti-Neurofilament-Antikörper, optional </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Folgen histologischen Protokoll vom Hersteller empfohlen </td></tr><tr><td> Kryostat und zugehörige Materialien für das Schneiden </td><td> Leica </td><td> verschiedene </td><td></td></tr><tr><td> Epifluoreszenz-Mikroskop zum Abbilden </td><td> Zeiss, verschiedene </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selektive tracing von auditory fibers im avian embryonale vestibulocochlearis

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Die embryonale Küken ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der peripheren und zentralen Ganglienzellen Projektionen. Im auditorischen System würde selektive Markierung von auditiven Axone innerhalb des VIII. Hirnnerven verbessern das Studium der zentralen auditorischen Schaltungsentwicklung. Dieser Ansatz ist schwierig, weil mehrere Sinnesorgane des Innenohrs der VIII. Nerven 1 beitragen. Darüber hinaus haben Markern, die zuverlässig unterscheiden auditive gegenüber vestibulären Gruppen von Axonen innerhalb der Vogelgrippe VIII. Nerven noch nicht identifiziert werden. Auditive und vestibulären Wege nicht funktional in frühen Embryonen unterschieden werden, als sensorische hervorgerufenen Reaktionen nicht vorhanden sind, bevor die Schaltungen ausgebildet sind. Zentral vorstehenden VIII. Nervenaxone haben in einigen Studien verfolgt worden, aber auditiven Axon Markierung wurde durch Markierung von anderen VIII. Nerven Bauteile 2,3 begleitet. Hier beschreiben wir eine Methode zur anterograde Tracing von der akustischen ganglion selektiv label auditiven Axone innerhalb des sich entwickelnden VIII. Nerven. Erste, nach teilweiser Durchtrennung des vorderen Schädelbereich des 8-tägiger Hühnerembryos in sauerstoffhaltigen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit eingetaucht wird der Kanal durch Cochlea anatomischen Landmarken identifiziert. Als Nächstes wird ein feiner gezogen Glasmikropipette positioniert, um eine kleine Menge an Rhodamin Dextran Amin in den Kanal und benachbart tiefen Bereich, wo die akustischen Ganglienzellen befinden injizieren. Innerhalb 30 Minuten nach der Injektion werden auditive Axone zentral in den Hinterhirn zurückverfolgt und können später visualisiert werden nach histologischen Vorbereitung. Diese Methode liefert ein nützliches Werkzeug für Entwicklungsstudien der peripheren zum zentralen auditorischen Schaltung Bildung.

Die Komponenten der VIII. Nerv und der Anatomie des Nerven selbst sind komplex und gewundenen (Figuren 1, 3). Durch selektives Tracing Fasern aus akustischen Ganglienzellen können Segmente des VIII. Nerven sowie primären auditorischen Afferenzen im Hirnstamm sauber zurückverfolgt werden und sich von ihren vestibulären Gegenstücke (Abbildungen 2, 3). Ebenso könnte diese Technik verwendet, um periphere Vorsprünge der akustischen Ganglienzellen (3G) studieren oder modifizi...

Hier beschreiben wir eine Technik, die von Mikrodissektion Fluoreszenzfarbstoff Injektion in den akustischen Ganglion frühen Hühnerembryonen zur selektiven Rückverfolgung von auditorischen Axon Fasern im Nerv und Rautenhirn gefolgt.

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, auditorische Fasern selektiv vom peripheren Nervensystem zum zentralen Nervensystem in einem Embryo zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Mikrodosisschnittung durchgeführt wird, um das ventrale Chondrokranium freizulegen und das cochleäre Ductus des Vogels zu identifizieren. Der zweite Schritt besteht darin, eine Mikroinjektion in die darunterliegenden akustischen Ganglienzellen und deren Axone durchzuführen.Anschließend wird die Probe 20 Minuten lang in inkubiertem und oxygeniertem künstlichem Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) belassen, um den DIA-Transfer zu ermöglichen. Schließlich ermöglicht eine histologische Aufbereitung und Schnittführung des Gewebes die mikroskopische Visualisierung der zentralen Projektionen des akustischen Ganglions. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden bestehen darin, dass sie eine selektive Verfolgung des achten Nervs ermöglicht.Hörbündel mit hoher Auflösung ermöglichen einen schnellen Farbstofftransfer in lebendem Gewebe und erlauben Experimente in einem frühen Entwicklungsstadium. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hör­for­schung zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Moleküle leiten Axone zu ihren zentralen Zielstrukturen? Oder wie reagiert die Verschaltung auf Verletzungen oder ototoxische Einwirkungen? Geben Sie zunächst künstliches zerebrospinales Fluid in ein 500-Milliliter-Weithals-Nalgene-Gefäß, bis das Gefäß zu zwei Dritteln gefüllt ist. Setzen Sie den Deckel, in den ein Loch gebohrt wurde, wieder auf das Gefäß.Bringen Sie einen mit einem Tank mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid verbundenen Sauerstoffbubbler durch das Loch im Deckel in das aCSF ein. Schalten Sie das Gas ein und stellen Sie den Druck so ein, dass eine gleichmäßige Blasenströmung entsteht, die etwa ein Drittel der Flüssigkeitshöhe erreicht, jedoch nicht so stark ist, dass Spritzen über den Rand erfolgt. Tauchen Sie bis zu sechs Glasvials mit je fünf Milliliter in das Gefäß ein, um einzelne Proben voneinander zu trennen.Und durch die Turbulenz des Gasstroms. Lassen Sie das aCSF mindestens 20 Minuten lang zur Sauerstoffanreicherung stehen, während das aCSF oxigeniert wird. Ziehen Sie Glas-Mikropipetten auf, füllen Sie die Mikropipette mit einer 6,25 %igen Rodin-Dexter-Lösung und einer immunologischen Lösung in PBS, die 0,4 % Triton XX enthält. Befestigen Sie die Mikropipette am Mikromanipulator und brechen Sie die Spitze mit feiner Pinzette ab, um eine Öffnung von 20 bis 50 Mikrometern zu erzeugen. Verwenden Sie feines Schlauchmaterial, um den stabilisierten Mikromanipulator an den Pico-Spritzer anzuschließen.Stellen Sie den Pico-Spritzer zunächst auf 10 bis 30 PSI ein, um den Rest der Einrichtung abzuschließen. Stellen Sie sicher, dass eine kleine silikonbeschichtete Präparierschale mit zwei in eine kleine sechseckige Anordnung platzierte Präpariernadeln vorhanden ist. Weben Sie zwei feine Pinzetten mit spitzer Spitze.Eine Pinzette mit gebogenem Spitzenende, ein 50-Milliliter-Becherglas und ein Behälter für Gewebemüll im Präparationsbereich. Nachdem das Hühnerembryo aus dem Ei entfernt wurde, lege man den Kopf auf die silikonbeschichtete Präparationschale. In der Wanne positioniere man den Kopf so, dass die Seite mit der Ohrregion von Interesse – in diesem Fall die rechte Seite – im ventralen Blickfeld sichtbar ist.Wenn das Gewebe in der richtigen Position liegt, stabilisieren Sie es mit Präparationsnadeln, wobei der Bereich des Hinterhirns vermieden werden sollte. Überführen Sie mithilfe des 50-Milliliter-Bechers 30 Milliliter des oxygenierten A-CSF in die Schale, sodass das Gewebe vollständig bedeckt ist. Anschließend greifen Sie vorsichtig mit feinzinkigen Pinzetten das Unterkiefergewebe an und ziehen es nach unten ab.Entfernen Sie dann das untere Augenlid auf der interessierenden Seite. Anschließend entfernen Sie das daraufliegende vaskuläre und weiche Gewebe, einschließlich des verbliebenen Gaumens und der Speiseröhre. Sobald dieses Gewebe entfernt ist, sollte die glatte Oberfläche des ventralen Schädels und die charakteristischen Vertebralisarterien sichtbar werden.Dissezieren Sie vorsichtig die Haut um die äußeren Mitosen herum bis zum Knorpel des Kiefergelenks und des Mittelohrs, wobei das Innenohr intakt bleibt. Benutzen Sie die Pinzette, um die knorpeligen Strukturen des Kiefers und des Mittelohrs vorsichtig zu entfernen. Führen Sie nun eine sanfte Wischbewegung mit den feinen Pinzetten Spitzen aus, um Wirbelarterien und angesammeltes Blut zu entfernen.Dies ist wichtig, da Blut die Sicht behindern und Gerinnung die Öffnung der Injektionspipette verstopfen kann. Zu diesem Zeitpunkt sollte die charakteristische weiße Tialmasse sichtbar sein. Der Pfeil in dieser Abbildung zeigt den Cochleargang mit angrenzendem sensorischem Epithel und akustischem Ganglion an.Es liegt direkt unterhalb des Chondracraniums und kann, wie hier zu sehen, als länglicher, fingerartiger Fortsatz sichtbar gemacht werden, der sich vom Innenohr ventral aus erstreckt, wobei sich die Spitze in der Nähe der vorderen Mittellinie befindet, um auditorische Fasern zu markieren. Bringen Sie zunächst die Injektionspipette nahe der Embryonaloberfläche des Cochleargangs und des Bereichs der Baula papillaris an und senken Sie langsam die Mikropipette ab, um zuerst das Cranium zu durchstechen. Dieser Bereich des Craniums ist dünner als die umgebenden Regionen und erfordert weniger Kraft zum Durchdringen.Die Mikropipette sollte sich nun innerhalb des Cochleargangs befinden. Falls erforderlich, kann hier eine kleine Injektion von Tracerfarbstoff vorgenommen werden, um die Visualisierung der Basislamelle bis zum Säulenelement zu erleichtern. Setzen Sie das vorsichtige Absenken fort, bis die Mikropipette gerade die tiefe Grenze des Cochleargangs durchbricht.Dieses Bild zeigt die ideale Position der Pipette in dem entsprechenden Bereich des akustischen Ganglions. Führen Sie an dieser Stelle eine Injektion durch und wiederholen Sie dies in mehreren Regionen entlang der Länge der Basalpapille. Abhängig vom gewünschten Umfang der Markierung und unter Ausschluss der proximalsten Spitze, an der sich das vestibuläre Ligament befindet.Bei einem Druck des Pico-Spritzers zwischen 10 und 30 PSI sollte jede Injektion einen fluoreszierenden, mit DIA markierten Fleck mit einem Durchmesser von etwa 200 bis 400 Mikrometern ergeben, wie hier dargestellt. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Pinzette, um die Probe oberhalb des Hirnstamms zu durchtrennen, wie hier veranschaulicht, und benutzen Sie eine Transferpipette, um den Rückenmarksteil in eines der kleinen Gefäße innerhalb des Behälters mit perfundierter Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zu überführen.Pro Embryo sind je nach gewünschter Distanz der zentralen Linie 20 bis 30 Minuten für die Übertragung einzuplanen. Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, entfernen Sie das Gewebe und bereiten Sie es für die histologische Schnittführung vor. Dabei wird das Gewebe über Nacht in 4 % Paraldehyd in 1x PBS eingeweicht, gefolgt von einer Übernachtdurchtränkung in 30 % Saccharose in 1x PBS.Nachdem das Gewebe über Nacht in 30 % Saccharose äquilibriert wurde, erfolgt der kryosektionelle Schnitt in koronarer Ebene. Nach dem Schneiden ermöglicht die Immunfärbung mit geeigneten Antikörpern die Orientierung des Beobachters hinsichtlich der anatomischen Lage sowie die Identifizierung bestimmter Regionen von Interesse. Diese Abbildung zeigt die koronare Ansicht des E sechs-Hirnstamms mit intakten beidseitigen akustischen Ganglien.Die schematisch dargestellte rote Pipette veranschaulicht eine präzise Zielsteuerung auf akustische Ganglienzellen über einen dorsal-lateralen Einstiegspunkt. Die Schnitte sind immunmarkiert mit Anti-Neurofilament, um axonale Projektionen hervorzuheben. Die Vestibularorgan sind rostral zu dem dargestellten Schnittabschnitt gelegen. Der Nervus vestibulocochlearis ist markiert, ebenso wie das Ganglion acusticum und das Ganglion vestibulare. Die dorsale Seite ist oben, die Maßstabsleiste entspricht 300 Mikrometern. Im Folgenden sind repräsentative Aufnahmen mit niedriger und hoher Vergrößerung der selektiven Markierung auditorischer Fasern in einem Embryo im Entwicklungsstadium E8 aus 25 Mikrometern dargestellt.Koronare Schnitte, die vom selben Embryo stammen, zeigen unterschiedliche Ebenen, wie hier zu sehen ist. Mit RDA markierte Axone können vom Injektionsort, der durch den Pfeilkopf angegeben ist, entlang des vom Pfeil gekennzeichneten Hirnnervs und weiter in Richtung der primären auditorischen Zielkerne, die durch den Doppelpfeilkopf markiert sind, verfolgt werden; die Maßstabsleiste entspricht 300 Mikrometern. Die Immunfärbung mit einem Antikörper gegen Neurofilamente hebt alle axonalen Projektionen hervor, und die im vorherigen Bild sichtbaren, mit RDA markierten Fasern liegen innerhalb der auditorischen Projektionsbahn.AP und VP zeigen die jeweiligen peripheren auditorischen bzw. vestibulären Anteile außerhalb des Nerveneintrittspunkts. Das überlagerte Farbbild zeigt, wie die mit RDA markierten Axone in die lokale Anatomie eingebettet sind. Eine Aufnahme desselben Embryos mit höherer Vergrößerung an einer weiter kaudal gelegenen Position demonstriert die hohe Auflösung der Fasern am durch einen Pfeil gekennzeichneten Nerveneintrittspunkt sowie entlang des zentralen Weges, der durch einen Doppelpfeil markiert ist.Die Neurofilamentfärbung aller Axone ermöglicht die Abgrenzung von P-N-S-C-N-S sowie von putativen auditorischen gegenüber vestibulären Projektionen. Auch hier zeigen AP und VP die jeweiligen auditorischen und vestibulären Anteile peripher zum Nerveneintrittspunkt an, während AC und VC die jeweiligen auditorischen und vestibulären Projektionen zentral zum Nerveneintrittspunkt kennzeichnen. Auch hier wird die Überlagerung separater Kanäle als Farbmischung dargestellt.Die histologische Untersuchung des akustischen Ganglions zeigt die Lage der markierten Zellen des akustischen Ganglions aus der vorherigen Verfolgung sowie deren periphere Projektionen, die durch das Sternchen gekennzeichnet sind; eine rückläufig verfolgte Verbindung reicht stark bis zur Basilarmembran. Hier bezeichnet AG das akustische Ganglion, bp die Basilarmembran und lm die Lamina macularis. Die Maßstabsleiste entspricht 100 Mikrometern.Schließlich zeigt diese Abbildung einen 700 Mikrometer langen Spurverlauf, der bei einer auditorisch spezifischen Markierung des achten Nervs am Embryonalstadium E8 zu erwarten ist. Die durch den roten Kreis angegebene Injektionsstelle liegt kordial zum Nerveneintrittspunkt, und zentrale Projektionen verlaufen rostral und quartal. Einmal im Hirnstamm angelangt, entspricht die Maßstabsleiste hier 300 Mikrometer.Passen Sie beim Durchführen dieses Verfahrens Ihre Injektionen so an, dass sie Ihren Analysekriterien am besten entsprechen. Denken Sie daran, dass zwischen den Proben eine gewisse Variabilität hinsichtlich der genauen Anzahl und Lage der markierten Axone auftreten kann.

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