Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen Drosophila

Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Stichverletzung am ventralen Nervenstrang der Drosophila-Larve ZNS anzubringen und eine zelluläre Reaktion auf diese Verletzung zu induzieren. Dies wird erreicht, indem die Larven zunächst bis zu 96 Stunden nach der Ablage inszeniert werden. Dann wird das ZNS der Larve präpariert und der ventrale Nervenstrang mit einer feinen Zungennadel durchstochen.

Die letzten Schritte bestehen darin, die gestochenen ventralen Nervenstränge für die Immunfärbung zu kultivieren und dann zu fixieren oder sie einfach nur für Zeitrafferaufnahmen zu kultivieren. Letztendlich kann die konfokale Mikroskopie der Proben die Dynamik des Wundverlaufs und Veränderungen der Gliazellproliferation, Apoptose und Morphologie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber 16 Methoden wie der Verletzung der adulten Fliege besteht darin, dass sie zwar immer noch ein Paradigma für ein funktionierendes zentrales Nervensystem ist, das larvale ZNS jedoch technisch leichter zugänglich ist.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da der Benusnervencode degenerieren kann, wenn der Dissektionsschritt nicht mit der Gewährleistung hygienischer Bedingungen begonnen wurde. Reinigen Sie die Bank und Ihre Hände mit 70% Ethanol. Die Instrumente sollten in 70%ig Ethanol getränktes Tuch eingewickelt und beiseite gelegt werden.

Wenn Sie bereit sind, die Larven anzufassen, wickeln Sie das Gewebe aus und lassen Sie die Instrumente an der Luft trocknen. Für diese Protokolle ist es entscheidend, dass die Zangenspitzen perfekt aufeinander treffen. Wenn sie diese nicht anpassen, ist die Verwendung von Arkansas-Steinen gleichwertig.

Beladen Sie einen Färbeblock mit destilliertem Wasser und drei Blöcke mit zwei Millilitern M 3 PS Medium. Wähle ein Fläschchen mit 96 Stunden alter Lava und füge etwas Wasser hinzu. Nehmen Sie dann mit einem Spatel vorsichtig das Futter mit Larven aus dem Fläschchen und verteilen Sie es auf einem feuchten Papiertuch.

Übertragen Sie 10 Larven aus dem Aufstrich in den Färbeblock mit Wasser. Tausche das Wasser sechsmal aus, um die Lava vollständig zu reinigen. Ersetzen Sie dann das Wasser durch M drei PS Medien.

Übertragen Sie eine der Larven auf einen Färbeblock aus M drei PS und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop. Entfernen Sie das VNC mit minimaler Gewebeschädigung. Positionieren Sie zuerst die Rückenseite der Lava nach oben.

Fassen Sie dann in einem Drittel des Abstands vom vorderen Ende die dorsale Seite mit zwei Pinzettenpaaren an. Ziehen Sie dann das hintere Ende mit der Pinzette weg, um die Epidermis zu zerreißen. Schneiden Sie als nächstes den Darm dort ab, wo er dem Gehirn am nächsten ist, da dort nicht viel Nahrung enthalten sein sollte.

Das Gehirn und der VNC sind nun vom hinteren Rand der vorderen Hälfte aus zu sehen. Entfernen Sie vorsichtig den Fettkörper, den Darm und die Epidermis. Versorgen Sie die peripheren Nerven durch die thorakale VNC mit zwei nahe beieinander platzierten Pinzettenpaaren und ziehen Sie sie auseinander.

Ziehen oder reißen Sie keine Bandscheiben oder peripheren Nerven aus dem thorakalen VNC, da sonst der Mund degeneriert. Teile können auch an den VNC befestigt bleiben, imaginale Scheiben sollten am Gehirn befestigt bleiben. Nun ist der feuchtere P 20 breiter geworden.

TIPP in M mit drei PS Medium und übertragen Sie damit das VNC auf einen Färbeblock mit frischem M drei PS Medium, bevor Sie das VNC verletzen. Stellen Sie sicher, dass Sie genug gesammelt haben. Für den Zeitraffer werden vier bis fünf benötigt, für die Immunfärbung werden jedoch über 24 benötigt.

Übertragen Sie ein VNC unter einem Präpariermikroskop auf einen sauberen Färbeblock mit M und drei PS und halten Sie die dorsale Neuropille ins Blickfeld. Dies ist die natürlichste Ausrichtung für VNC mit angehängten optischen Lappen. Nun nur noch einmal: Mit einer Stennadel manuell von der Rückenseite im nahezu rechtwinkligen Winkel in die Bauchhälfte des VNC stechen.

Der Stich trifft sanft auf die Glasoberfläche unter dem Gewebe. Daher ist es wichtig, routinemäßig zu überprüfen, ob die Nadelspitze noch scharf genug für den nächsten Versuch ist. Wenn sie stumpf ist, spitzen Sie die Spitze.

Die Verwendung eines Arkansas-Steins oder eines gleichwertigen Stichvents, eines Nervenschutzes mit einer Tangoflecknadel, ist der wichtigste Schritt in diesem Verfahren, da es sich um ein Verletzungsparadigma handelt. Wenn die Nadel zu stumpf ist, wird die Wunde viel zu groß und die Öffnung kann zu einem Nervenschutz werden. Verhindern Sie beim Stechen, dass der Stiel des Nadelhalters das Medium berührt, wenn Sie fertig sind, die Wunde ist auch nach der Fluoreszenz-Immunfärbung nicht sichtbar.

Bei fixierten, gesunden VNC nach 22-stündiger Kultivierung können keine Anzeichen einer Degeneration beobachtet werden. Dieses Verfahren kann 22 Stunden nach dem Stich zu einer zellulären Degeneration innerhalb des VNC führen, die nichts mit dem Stich zu tun hat. Achten Sie auf raue Oberflächen, insbesondere im lateralen ventralen Bereich des Brustkorbs, wie durch die Pfeilspitzen angedeutet.

Im Extremfall steht der VNC überstanden. Achten Sie auch auf Löcher oder Vakuolen in der thorakalen Neuropille, die nach einer fluoreszierenden Immunfärbung als Löcher sichtbar sein können. Beachten Sie die Löcher an der Pfeilspitze.

Proben mit einem dieser Anzeichen einer Degeneration in der Neuropille müssen verworfen werden. Um die axonale Neuropille im lebenden VNC sichtbar zu machen, verwenden Sie eine GFP-Proteinfalle namens G neun, die alle Axone markiert. Um alle Gliazellen mit Ausnahme der Mittellinie gl zu visualisieren, verwenden Sie den Gliatreiber repo G vier mit zum Beispiel, die U-A-S-D-S red S 1 97 Y Reporterfliegen, die beide Reporter tragen, haben grüne Axone und rote GL, die im Zeitraffer in lebendem Gewebe aufgezeichnet werden können.

Nach dem Stechen des VNC von Tieren mit den erforderlichen Reportern übertragen Sie das gestochene VNC mit einem Milliliter M mit drei PS in eine mit Polyol-Lysin beschichtete 3,5-Millimeter-Glasbodenschale. Positionieren Sie das VNC mit der Rückenseite nach unten, drücken Sie das VNC vorsichtig mit der flachen Seite der Pinzette auf die Schale, so dass es dort klebt. Geben Sie nun vorsichtig einen Milliliter M drei PS mit 15 % FPS in eine 25 Grad Celsius kontrollierte Bildgebungskammer. Nehmen Sie Bilder des VNC mit konfokaler Mikroskopie auf dem etwas eingeschränkten LIR SP two auf.

Verwenden Sie ein 20-fach-Objektiv mit vierfachem Zoom. Stellen Sie den Scanmodus auf XYZT ein. Stellen Sie die Pixelauflösung auf 512 Quadrat ein.

Stellen Sie die Z-Schritte auf einen Mikrometer ein und erfassen Sie Bilder in einem Intervall von ein oder zwei Stunden. Mit diesen Einstellungen können acht bis neun Zeitpunkte mit anderen konfokalen Mikroskopen gescannt werden. Passen Sie die Einstellungen an, um Bildstapel über einen längeren Zeitraum zu erfassen.

Punkte bis zu 24 Stunden. Eine VNC-Läsion wurde im Zeitraffer als GFP-negativer Bereich in der Neuropille von Proben mit dem axonalen Marker G neun sichtbar gemacht, kurz nachdem kleine GFP-negative Bereiche, die wie Löcher oder Vakuolen aussahen, zu entstehen begannen. Solche GFP-negativen Bereiche vergrößerten sich in der Regel bis zu sechs bis acht Stunden nach dem Stechen.

In der Folge schrumpften die GFP-negativen Bereiche weiter und einige verschwanden sogar 22 Stunden nach dem Stechen. Die Fläche, die von der Wunde eingenommen wurde, war im Allgemeinen kleiner als die maximale Fläche, die sechs bis acht Stunden nach dem Stechen beobachtet wurde. In ähnlicher Weise nahm der DS-rote negative Bereich in den Gliafortsätzen zunächst zu.

Sie schrumpften jedoch um 22 Stunden nach dem Messerstich. Interessanterweise füllten oft DS-rot-positive Gliafortsätze die GFP-negativen Löcher in der Neuropille, bevor sie verschwanden. Die Immunfärbung von fixierten Proben, die repo GAL four und U-A-S-M-C-D-H-G-F-P trugen, um Gliazellmembranen mit Anti-GFP zu markieren, zeigte, dass eine dorsale Seitenstichverletzung zu einer Delle führte.

Ventrales Stechen schien die Neuropille und die Neuropillen-assoziierten Gliazellen stärker zu betreffen als Gliazellen an der Oberfläche und im Kortex. Gliaprozesse erschienen in der Neuropille unorganisiert, während sie in der Hirnrinde immer noch das VNC umhüllten und ihre netzartige Organisation beibehielten. Die Verletzung führte zu GS zwei positiven Zelltrümmern, wie die Pfeilspitzen zeigen.

Die Trümmer unterscheiden sich von normalen Zellen. Er ist viel kleiner und nicht mit einem Zellkörper verbunden. Dies ergab eine Schädigung der Neuropillen-assoziierten Gliazellen, der antigespaltenen Caspase.

Drei positive Apoptose. Sowohl bei Neuronen als auch bei Gliazellen wurde eine Färbung beobachtet, die zeigt, dass sie nach einer Stichverletzung Apoptose erfuhren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden.

Es dauert eine Stunde, um den Code des Vent-Nerven zu präparieren, zu stechen und für die konfokale Zeitraffermikroskopie vorzubereiten, und in zwei Stunden kann der 24 Vent-Nervencode präpariert, gestochen und für die Kultivierung vorbereitet werden, wonach die Probe zum gewünschten Zeitpunkt fixiert werden kann.