Name: Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung disperser Zellkulturen aus präsomitischem Mesoderm von Danio rerio für die Einzelzell-Imaging der Segmentierungsuhr. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung zyklischer Genexpressionsoszillationen.

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Diese Arbeit wurde durch ein EMBO-Langzeit-Stipendiums (ABW) unterstützt, ein National Science Foundation International Postdoctoral Research Fellowship (ABW), die Max-Planck-Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), ein DIGS-BB-Stipendium (AO), und der Europäische Forschungsrat im Rahmen der Europäischen Gemeinschaften Siebten Rahmenprogramms STG-207634 (DS, ACO). Wir danken Ravi Desai für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir möchten auch die MPI-CBG-Protein-Expression Anlage für die Herstellung des Zebrafisch Fibronectin1 Fragment, dem Fisch den zuständigen Personen MPI-CBG für die Pflege und Wartung unserer Fisch-Linien und des MPI-CBG Lichtmikroskopie-Anlage für die Bildgebung Unterstützung danken.

1. Bevor Dissection <ol><li> Am Tag vor der Dissektion erhalten Embryonen aus einer incross der Zebrafisch-Paare heterozygot für das transgene Allel. <ol><li> Heben Embryonen in E3-Medium ohne Methylenblau bei 28 o C bis Schild Stufe (6 Stunden nach der Befruchtung). </li><li> Transfer-Embryonen in E3-Medium ohne Methylenblau bis 20 o CO / N. Bei 20 o C, werden Embryonen 1 h pro Somiten bilden, sobald sie Schwanzknospen-Stadium zu erreichen. Nach 17-20 h O / N bei 20 ° C, sollte Embryonen im 5-8 Somiten sein inszenieren am folgenden Morgen zu Beginn der Dissektion Protokoll. </li></ol></li><li> Assemble-Tools und Reagenzien für die Präparation erforderlich. <ol><li> Feuerpolierte Glaspipette für die Übertragung von Embryonen und Gewebe </li><li> Feinen Pinzette zur Entfernung von Chorion aus Embryonen </li><li> Sylgard-beschichtete 35-mm-Schale für die Präparation - Gießen Sylgard Polymer in eine 35 mm-Schale und Heilung O / N in einem 37 ° C Machen Sie das auch mit Dissektioneine Nadelspitze auf ein kleines Volumen des ausgehärteten Polymer zu entfernen. Das Gericht kann gereinigt und anschließend wiederverwendet werden. </li><li> Geschärfte, abgeflacht Wolframdraht-Tools für PSM Gewebemanipulation </li><li> Mikro-Skalpell zum Schneiden gewünschten Stücke von PSM zu Kultur </li><li> 35-mm-Kunststoffschale für Trypsin Inkubation </li><li> L15-Medium mit 10% fötalem Rinderserum </li><li> 0,25% Trypsin / EDTA-Lösung </li><li> Sigmacoted Gel-loading Tipps für die Verbreitung </li><li> Petrischalen aus Kunststoff E3-Medium ohne Methylenblau. </li></ol></li><li> Decken Sie Glasbodenschale mit Bild Fibronectin1 Substrat (10 ug / ml in PBS). Lassen Gericht auf der Bank zu beschichten beim Präparieren. </li><li> Verwenden Stereoskop mit geeigneten Fluoreszenzfiltern zu identifizieren und zu sortieren positiven transgenen Embryonen (5-8 Somitenstadium). <ol><li> Identifizieren transgenen Embryos durch die Untersuchung der präsomitischen Mesoderm (PSM) für YFP Expression unter Fluoreszenzkanal (Abbildung 1A). Fluoreszenz-shoULD unsichtbar im Bereich der letzten Somiten zum Schwanzknospen. Wählen Embryonen mit hellsten Signal; 25% der Nachkommen sollten homozygoten Embryonen mit 2 Kopien des Transgens sein. Die Anzahl der identifizierten Embryonen erforderlich ist je nach Experiment basiert. Ein Stück wird seziert Schwanzknospen ergeben 1000 Zellen, im Durchschnitt. Normalerweise sind ein paar zusätzliche positive Embryonen nützlich, wenn Fehler während der Präparation gemacht. </li><li> Verwenden Durchlicht als Positionsbezug, jede Autofluoreszenz zu unterscheiden, vor allem in den Dotterzelle, aus dem Signal. </li><li> Übertragen positive Embryonen zu einem separaten Kunststoffpetrischale mit E3-Medium ohne Methylenblau. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissection und Zerstreuung <ol><li> Bereiten Embryonen für die Präparation. <ol><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, mit feinen Pinzette vorsichtig entfernen das Chorion von jedem Embryo in der E3-Medium. Achten Sie darauf, um den Embryo zu beschädigen oder stören die Dotterzelle. </li&gt; <li> Füllen Sylgard-beschichtete Sezieren Gericht mit L15-Medium mit Serum. Mit einer Pinzette oder einem anderen flachen Werkzeug, entfernen Sie alle Luftblasen von der Oberfläche des Sylgard. </li><li> Übertragen dechorionated Embryonen mit der feuerpolierten Glaspipette auf die Dissektion Gericht. </li><li> Mit den Drahtwerkzeuge, verschieben Sie alle Embryonen auf der einen Seite der Sezieren Gericht. </li></ol></li><li> Dissect PSM von einer einzigen Embryo. <ol><li> Orient ein einzelner Embryo auf seiner lateralen Seite in der kleinen und in der Sylgard Schicht innerhalb der Sezieren Gericht (Abbildung 1B) gemacht. </li><li> Mit der Mikro-Skalpell, Schnitt durch den Embryo und Dotterzelle knapp vor den Hinterhirn und durch die ventralen Pol des Embryos (1B, gestrichelte rote Linie). </li><li> Entfernen Sie die vordere Stück des Embryos aus dem Brunnen, bewegen sie weg auf die Seite der Schale, und dann die Draht Werkzeuge, um aus dem hinteren Abschnitt einschließlich der PSM weg kratzen restlichen Dotterzelle Körnchen. </li><li>Sobald das Eigelb wurde abgekratzt, glätten und richten Sie die PSM mit dem vorderen Ende nach vom Experimentator und die hintere in Richtung des Experimentators (Abbildung 1C). </li><li> Wenn die dünne Schicht Ektoderm hat sich nicht von dieser Stelle gezogen wird, verwenden Sie die Draht Werkzeuge, um sie zu schälen weg von der Spitze des PSM Gewebe. </li><li> Mit der Mikro-Skalpell die Schwanzknospe, die hintersten Spitze des PSM über das Ende der Chorda, weg vom Rest des Gewebes (1C, gestrichelte rote Linie). Hinweis: andere Gewebeteile von der PSM beispiels anterioren PSM näher an der zuletzt gebildeten Somiten, können auch in Kultur genommen werden, abhängig von den experimentellen Frage. </li><li> Bewegen Sie den Schwanzknospen Stück in eine Ecke der Schale von der Sektionsbereich. Verwenden Sie die Draht Werkzeuge, um jeglichen Schmutz und unerwünschten Embryo Gewebe aus dem Seziersaal Feld zu löschen. </li><li> Wiederholen Sie mit dem nächsten Embryo. </li></ol></li><li> Pool Schwanzknospen Stücke aus mehreren Embryos, je nachdem, wie viele Zellen für das Experiment erforderlich ist. Im Durchschnitt ein einziges Stück Schwanzknospen Gewebe ergibt 1000 Zellen. </li><li> Füllen Sie leere 35-mm-Kunststoffschale mit einem kleinen Volumen von Trypsin-EDTA. </li><li> Mit der feuerpolierten Glas Pipette Schwanzknospen Stücke aus Sezieren Gericht in Schale mit Trypsin / EDTA. Schwanzknospen Stücke inkubieren in Trypsin / EDTA für 20 Minuten bei RT. </li><li> Während das Gewebe wird in Trypsin, entfernen Sie die Fibronectin1 Lösung aus dem Glasboden-Imaging-Gericht. <ol><li> Mit MilliQ Wasser waschen die Lösung aus Glas 3 mal. Saugen Sie jeden Wasch zu entfernen und sicherzustellen, dass das Gericht vollständig trocken ist. </li></ol></li><li> Dispersionsschwanzknospen Stücke in Medium für Bildgebung. <ol><li> Je 100 ul der L15-Medium mit Serum in bildgebenden Gericht. </li><li> Mit einem Gel-beschichteten Spitze, entfernen Sie die Stücke aus der Schwanzknospe Trypsin / EDTA in einem möglichst kleinen Volumen wie möglich. </li><li> Pipettieren Schwanzknospen-Stücke in das Medium in derBild Gericht. Pipettieren Sie die Stücke nach oben und unten mehrmals, um sie auseinander brechen und Zellen aussetzen im Medium. Achten Sie darauf, um Luftblasen zu einzuführen. Check für Zellklumpen unter dem Mikroskop und verteilen mehr als nötig. </li><li> Lassen Sie verteilten Zellen in der Suspension auf die Fibronectin1-beschichtete Glas für 20 min bei RT begleichen. </li></ol></li><li> Hinzufügen eines kleinen Volumens von Zusatz L15-Medium mit Serum zu den Zellen vor Beginn der Bildgebung. Seien Sie vorsichtig, nicht zu ständiger Zellen zu zerstören. </li><li> Angesichts der experimentellen Frage, fügen Sie keine zusätzliche oder medikamentöse Behandlungen auf die Kultur. </li></ol> 3. Imaging von Dispersed PSM Zellen <ol><li> Richten Sie Bild Gericht Temperaturkammer auf der Zeitraffer-Imaging-Mikroskop. Eingestellt Warner Kammer auf die gewünschte Temperatur für das Experiment. Lassen Gericht für mindestens 30 min ins Gleichgewicht vor Beginn der Bildaufnahme. Crosscheck Temperatur mit externen Temperaturfühler in die Schale gelegt, falls erforderlich. HINWEIS: Aufgrund derdie Beziehung zwischen Temperatur und Somitogenese Rate 21 stabile Temperaturregelung ist für genaue Messungen der Periode, in einzelnen PSM-Zellen. </li><li> Erwerben Sie Testbilder in der Fluoreszenzkanal, um zu überprüfen, dass die Belichtungszeit und Gain bieten einen großen dynamischen Bereich von Intensitäten ohne Sättigung zu guten Rauschpegel zu gewährleisten. Ein typisches Fluoreszenzbild von dispergierten Zellen aus unseren Linien erzeugt mit diesem Protokoll erfassten erfordert 400 ms und 40 ms für einen Durchlichtbild mit einem EMCCD Kamera, die bei einer EM-Gewinn von 85. Außerdem Pre-Amp Gain und Auslesegeschwindigkeit aus der Kamera sind auch wichtig, um das Signal über Lärm zu maximieren. </li><li> Mit dem Durchlichtkanal, wählen Sie Felder von Zellen für die Zeitraffer-Akquisition. </li><li> Führen Zeitraffer-Akquisition-Protokoll für die gewünschte Länge der Zeit. <ol><li> Erwerben Sie ein Durchlicht-und Fluoreszenzbild einer pro Feld. HINWEIS: Stellen Sie ein Intervall zwischen den Anschaffungs rounds, die zeitliche Dynamik ohne Foto-Bleichen über erweiterte Bildgebung oder Induktion Toxizität in den Zellen erfassen wird. Dieses Protokoll verwendet eine 2 Minuten-Intervall. </li></ol></li><li> Überprüfen Zeitraffer-Set-up gelegentlich während der Aufnahme, um sicherzustellen, dass die Zellen im Fokus bleiben, keine Software-oder Hardware-Fehler, etc. </li></ol> 4. Image Processing der erworbenen Zeitraffer-Filme <ol><li> Offen für eine Filmdatei erworben Feld in einer Bildverarbeitungs-Software. HINWEIS: Fidschi wurde für die gesamte Verarbeitung in diesem Protokoll verwendet. <ol><li> Split Durchlicht-und Fluoreszenzbilder von einem Feld in zwei Stapeln von Bildern. </li></ol></li><li> Track eine einzelne Zelle in der Durchlichtkanal. <ol><li> Legen einen kreis ROI (Region von Interesse), die um die ausgewählte Zelle in dem ersten Rahmen in der übertragenen Lichtkanal. HINWEIS:.. Nur Zellen, die ein gesund sind am Ende der Aufnahme, zwei haben nicht bewegen außerhalb des Feldes, und 3 nicht in Kontakt mit anderen ce kommen.lls werden nachverfolgt. </li><li> Speichern Sie eine ROI alle paar Frames an den ROI-Manager. Verfolgen Zelle, bis zum letzten Frame. </li></ol></li><li> Messen Intensität über die gespeicherten ROIs auf die Fluoreszenz-Kanal. <ol><li> Wählen Sie das Fluoreszenz-Stack und mit dem gespeicherten ROIs, verwenden Sie die benutzerdefinierte Kreis Interpolator-Plug-in-und Makro, um die Intensität des Raupen Zelle über die Zeit zu messen. </li><li> Überprüfen Sie die Ausgabe Spur von der Makro. Wenn die Spur qualitativ erfasst Merkmale der Fluoreszenz Zeitraffer, exportieren Sie die Werte in eine Excel-Arbeitsblatt. </li><li> Speichern Sie die ROI-Liste für die Zelle. </li></ol></li><li> Wiederholen Verfolgung in tragenen Kanal und Messen der Fluoreszenzkanal für andere Zellen in dem Feld. </li><li> Wiederholen Sie alle Schritte für weitere Felder aus dem Experiment. </li></ol>

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Autor Beiträge: ABW entwickelt und verfeinert, die Verbreitung, Kultur-, Imaging-und Zell Tracking-Protokolle. DS erzeugt der transgenen Linien und überwachte die Gestaltung der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskop in diesem Protokoll verwendet. AO Pionier ersten Proof-of-principle Experimente zu distanzieren und Bild PSM-Zellen in der Kultur. JS schrieb den Kreis Interpolator Plugin-Tool verwendet werden, um in Fidschi Fluoreszenzintensität von Zeitraffer-Filmen messen. ABW und ACO schrieb das Manuskript.

Um einen zellulären Prozess, der im Laufe der embryonalen Entwicklung stattfindet, zu studieren, Biologen verwenden typischerweise einen Ansatz im Kontext des gesamten Embryos. Jedoch zu verstehen, wie eine einzelne Zelle in einem Entwicklungszeitrahmen verhält, ist eine Methode, zu prüfen und zu stören einzelnen Zellen isoliert auch sehr nützlich. Durch die Erzeugung verteilt PSM Zellkulturen unter Verwendung von transgenen Zebrafischembryonen haben wir jetzt ein Werkzeug, um die Zelle autonome Natur des genetischen Schwingungen im Segmentierung Uhr in einer quantitativ direkt studieren. Es ist möglich, die Dynamik der Schwingungen im Fluoreszenzreporter in Hunderten von Zellen, die unter einer Vielzahl von Bedingungen zu messen. Der Beobachtungszeitraum von Einzelzellen in Kultur ist länger als die Periode Somitogenese im intakten Embryo. Wir beobachten, dass eine intakte PSM Explantat in Kultur zeigt auch langsamer Schwingungen als das intakte Embryo (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet that die in isolierten Zellen beobachtet längeren Zeitraum ist nicht einfach bei einem Schaden aus Zerstreuung. Eine variable Periode und Amplitude wird in den meisten unserer Single-Cell-Zeitreihen beobachtet. Die Quelle dieser Variabilität ist nicht bekannt, sollte aber wichtige Details über Tempo-Schaltungen machen die Segmentierung der Uhr zeigen. Mit dieser Methode können wir die genetischen Komponenten der Segmentierung auf der zellulären Ebene, und Fragen, die herausfordernd sind, um in der ganzen Embryo untersuchen zu studieren. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von bekannten Signalmoleküle in den sich entwickelnden Embryo in unseren Kulturen zu finden, können wir ihre Auswirkungen auf die einzelnen PSM zellulären Oszillators in einer robusten und reproduzierbaren Assay zu prüfen. Unsere PSM Kultursystem öffnet die Tür zu einer strengen Bewertung, welche Faktoren allein oder in Kombination zu fördern Schwingungen in diesen Zellen, welche Faktoren diese Schwingungen zu verhindern, und um das Zusammenspiel zwischen solchen Molekülen zu testen. Mit diesen Werkzeugen in der Hand, wollen wirbewerten bestehenden Modelle der Somitogenese veröffentlicht, die auf Gewebe-Level-Daten, sowie die Nutzung Ergebnisse in einzelnen Zellen basieren, um Vorhersagen, die in der ganzen Embryo getestet werden können, zu erzeugen. Nach unserem Wissen ist dies der erste Zebrafisch primären Zellkultur-Protokoll für akute Zeitraffer-Aufnahme der Fluoreszenz in Einzelzellen; Weiterentwicklung und Verfeinerung dieses Protokolls ist kein Zweifel möglich ist. Andere Protokolle verwenden oft Zebrafischembryonen in stabilen Zelllinien, die mit Reporter transfiziert und für die Langzeitabbildungs ​​27-29 verwendet werden kann, zu erzeugen. Während stabile Linien sind nützlich für die Abbildung ein Prozess, der nicht für die Entwicklung Timing, wie der circadianen Uhr gebunden ist, ist die Frage der embryonalen Segmentierung erfordert sofortige Bildgebung während Zellen noch in den oszillierenden, Stammvater Staat. Sobald Zellen stoppen Schwing, nehmen sie eine differenzierte Zelle Schicksal, und als im Gewebe, würde sich in ein Somiten integriert werden. Es ist possible dass mit dem richtigen Faktor oder in vitro vorhanden Faktoren, die wir PSM-wie Zebrafisch-Zellkulturlinien, die Schwingungs bleiben würde, so dass deutlich mehr Zeitbeobachtungen, mehrere aufeinander folgende Störungen oder Hochdurchsatz-Screening erzeugen könnte. Wir erwarten, dass diese Verfahren zur Herstellung von Primärkulturen von dispergierten Zellen für Zeitabbildungs ​​ist gut geeignet für die Untersuchung von jedem zellulären Prozess, der in einer Entwicklungszeitrahmen, die nicht zugänglich Zebrafisch unter Verwendung stabiler Zelllinien auftritt. Die Isolierung der verschiedenen Zelltypen auf unterschiedliche Entwicklungsstadien aus den entsprechenden transgenen Linien Reporter, entweder über Dissektion oder über FACS nach embryonalen Dissoziation, könnte die Ausgangszellen zu liefern. Einige Optimierung der Kulturbedingungen, die embryonalen Ursprungs der Zellen geführt wird, kann erforderlich sein. Durch die Kombination dieser flexiblen und sensiblen Protokoll mit der schnell wachsenden Sammlung von transgenen ZebrafischLinien, hoffen wir, ein in vitro-Ansatz der Entwicklungsbiologie, die komplementär zu klassischen genetischen und embryologischen Methoden ist, zu erleichtern.

Die periodische Bildung von Segmenten entlang der Wirbeltierkörperachse oder Somitogenese, ist ein Beweis für eine räumliche und zeitliche Oszillator im sich entwickelnden Embryo. Die bevorzugte Mechanismus Steuerung Somitogenese ist konzeptionell von einem &quot;Takt-und Wellenfront&quot;-Modell ein, bei dem die &quot;Uhr&quot;, bestehend aus zellulären Oszillatoren jetzt vermutlich intrazellulär durch die rhythmische Expression einer Reihe von Genen zyklischen 2 angetrieben werden, hakt die Bildung beschrieben Somiten von präsomitischen Mesoderm (PSM). Da der Embryo entwickelt, eine Reifung &quot;Wellenfront&quot; in der PSM bewegt sich zusammen mit der Geweberückschritte in Richtung der hinteren, Verlangsamung und verhaften zellulären Oszillatoren, wie es geht 3. Gemeinsam wird diese raumzeitlich dynamischen System die Segmentierung Uhr bezeichnet. Aktuelle Ansätze zur Segmentierung Uhr Spannweite drei zunehmenden Organisation der genetischen Oszillator in einzelnen Zellen auf lokale Kopplung th studierenan tritt zwischen Zellen und schließlich die weltweite Regulierung der Positionsinformationen in der kollektiven PSM Gewebe 4. Frühere Studien legen nahe, die zellautonome Segmentierung Oszillator im Zebrafisch besteht aus Genen und Proteinprodukte aus der ihr / hes factorfamily Transkription, die gedacht werden, um eine negative Rückkopplungsschleife über Transkriptionsrepression 5-7 bilden. Die Delta / Notch-Signalwegs synchronisiert Schwingungen zwischen Nachbarzellen und reguliert die Tarifperiode der Bevölkerung 10.8. In der Schwanzknospe erzeugt Fgf Signalmoleküle scheinen einen Gradienten über die Zebrafisch-PSM zu bauen, und dabei die Hypothese aufgestellt, um zu verlangsamen und zu verhaften oszillierenden Zellen in der vorderen 11 beitragen. Bis jetzt haben die funktionellen Rollen jedes dieser Moleküle in Somitogenese durch genetische Mutation, Morpholino-Injektion, Hitzeschock-Überexpression und-Antagonist Medikament TREA suchttment Uhr von Komponenten und Signalisierung zwischen Zellen 5,7,10,12. Mit Hilfe dieser Störungen hat Segmentierung Uhr-Funktion von Gewebe-Level-Beschreibungen der Somitendefekten und den Verlust der gleichmäßigen Schwingungen in der Expression von Genen wie zyklische her1, her7 und Delta abgeleitet worden C. Doch fast alle diese Daten sind von Embryonen fixiert und nicht zu Veränderungen, was für das dynamische Funktion der Segmentierung Uhr sind genau zu erfassen. In jüngerer Zeit hat mehr Embryo Zeitraffer-Bildgebung die ersten Mutanten mit veränderter Oszillatorperiode offenbart, sondern diese Beobachtungen wurden auch bei der Gewebeniveau 7,13 gemacht. So wurde die Hypothese aufgestellt Verhalten der Zelle autonomen Oszillators während Somitogenese nicht beobachtet. Statische Schnappschüsse von Somitogenese ein unvollständiges Bild, denn von Natur aus, wird der Prozess durch ein schwingfähiges System angetrieben. Frühere Arbeiten in Maus-und Küken-Zellen zeigten, dass das Niveau der Niederschriftund Protein-Aufstieg und Fall, aber Abtasten eines ca. 2 h Schwingung alle 30 oder 45 min beschränkt notwendigerweise die gesammelten Daten und damit die Schlussfolgerungen, die gezogen werden können 14,15. Studium der anderen biologischen Oszillatoren, vor allem, circadiane Uhren, hat sich von inszenierten Messungen von Gen-und Proteinexpression um Echtzeit-Überwachung mit Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter 16,17 bewegt. Diese Instrumente sind wichtig für den Nachweis Uhr Eigenschaften von Einzelzellen 18. Ein Reporter der Biolumineszenz Hes1 zyklischen Gen wurde entwickelt und kurz in einzelnen Zellen der Maus PSM 19 aus. Die Durchschnittsperiode und der Varianz wurden für eine kleine Anzahl von Zellen berechnet wird, zeigt, dass Schwingungen bestehen für mehrere Zyklen in vitro. Allerdings haben diese Studien nicht quantitativ anzugehen, die Stabilität und Robustheit der Oszillator-Frequenz und Amplitude, ob Zellen können spontan betreten oder verlassen Schwingungen,und wie die Zellen behalten ihre Phasenbeziehungen. Zusätzlich können die Effekte von Signalmolekülen in der Embryos auf dem Zell-autonome Uhr wurden nicht direkt getestet. Folglich sind diese grundlegenden Eigenschaften der einzelnen Zelle Oszillator bleiben völlig unbekannt. Wir haben vor kurzem transgene Fische Linien mit BAC Rekombination 20 bis Venus (YFP) Fluoreszenz-Reporter von 30 her1 Ausdruck fahren entwickelt. Solche Leitungen nutzen die regulatorischen Signale des intakten chromosomalen Locus in die sie eingebettet sind, und wiederholen die zeitliche Dynamik und räumlichen Muster der HER1. Dieser Durchbruch ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Gen-Expression in sich entwickelnden Zebrafischembryos in vivo. Um die grundlegenden Eigenschaften von Zell-autonome Schwingungen und wie solche Ausdruck wird über die Zeit geregelt zu studieren, haben wir vor kurzem eine zuverlässige Methode, um von PSM-Zellen in vitro zu isolieren und zu Rekord. Diese Protocol beschreibt, wie wir unsere Reporter transgenen Linien verwendet werden, um verteilte Zellkulturen, aus denen wir die Schwingungen des Zebrafisch-Segmentierung Uhr in einzelne Zellen zu charakterisieren generieren. Wir können damit noch offenen Fragen anzugehen in dem Feld, das nicht zugänglich mit statischen oder Gewebe-Level-Analyse waren, als auch direkt manipulieren die Segmentierung Uhr auf Einzelzellebene mit Signalmolekülen und Inhibitoren.

<table><tbody><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>Modell: SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>X-cite Illumination</td><td>Serie: 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Dissektionsmikroskop</td><td>Olympus</td><td>Modell: SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette Nr. 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Glastransferpipetten</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen aus Kunststoff</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischalen aus Kunststoff</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Polymer</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>Manipulationswerkzeuge</td><td>Made in house</td><td></td><td>Zur Beschreibung von Manipulationswerkzeugen Ref. 22</td></tr><tr><td>Mikrochirurgisches Messer</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15 mittel</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomyocin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin / 0,02 % EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladespitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten-Set</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch Fibronektin1 70 kD Fragment</td><td>MPI-CBG-Proteinanlage</td><td></td><td>Inhouse generiert aus Konstrukt basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten Ref. 23-25</td></tr><tr><td>Glasboden-Bildgebungsschalen</td><td>Mattek (Single Well)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glasboden-Bildgebungsschalen</td><td>Greiner (CellView -Multi-Well)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>E3 medium ohne Methylenblau</td><td>Made in-house</td><td></td><td>Aus The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td></tr><tr><td>Kunststoff-Transferpipetten</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>Warner Heiz-/Kühlkammer</td><td>Warner</td><td>Instruments TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Modell: iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Venusfilter-Set</td><td>Zeiss</td><td>Modell: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Venusfilter-Set</td><td></td><td>NeoFluor 40x, NA 0,75</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Venus-Filter-Set</td><td>Lumencor Light Engine</td><td>Modell: Spectra X</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Venus-Filter-Set</td><td>BrightLine HC 575/15</td><td>F39-575</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von dispersed präsomitischen mesoderm zellkulturen für imaging der zebrafisch-segmentierung uhr in einzelzellen

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentierung ist ein periodischer und sequentielle morphogenetischen Prozess bei Wirbeltieren. Diese rhythmische Bildung von Blöcken aus Gewebe genannt Somiten entlang der Körperachse ist Nachweis einer genetischen Oszillator Strukturieren des sich entwickelnden Embryos. Im Zebrafisch wird die intrazelluläre Uhr fahren Segmentierung der Mitglieder des Her / Hes Transkriptionsfaktor-Familie in den negativen Rückkopplungsschleifen organisiert zusammen. Wir haben kürzlich erzeugten transgenen fluoreszierenden Reporterlinien für die zyklische Gen HER1, die die räumlich-zeitliche Muster der Schwingungen in präsomitischen Mesoderm (PSM) zu rekapitulieren. Mit diesen Zeilen, ein in vitro-Kultursystem, die Echtzeit-Analyse der Segmentierung Uhr Schwingungen innerhalb einzelner, isolierter PSM Zellen erlaubt entwickelten wir. Durch das Entfernen von PSM Gewebe von transgenen Embryos und dann Dispergieren Zellen aus schwing Regionen auf Glasboden Gerichte erzielten wir Kulturen geeignet für Zeitraffer-Bildgebung der Fluoreszenzsignal voneinzelnen Taktzellen. Dieser Ansatz bietet eine experimentelle und konzeptuelle Rahmen für die direkte Manipulation der Segmentierung Uhr mit beispiellosen Einzelzellen-Auflösung, so dass seine zellautonome und Tissue Level-Eigenschaften zu unterscheiden und seziert werden.

Dieses Protokoll produziert von lebensfähigen Kulturen, verteilt, einzelne PSM Zellen für Zeitraffer-Bildgebung der Fluoreszenzsignal (Abbildung 2). Unsere Transgen erzeugt einen Reporter, dessen Kreislauf von Produktion und Abbau erfolgt mit ähnlicher Dynamik zu dem endogenen Gen-und Protein im Embryo, in der Größenordnung von einer halben Stunde. Aufgrund seiner schnellen Umsatz, sollte die YFP-Signal in Einzelzellen schnell erkannt, um die Bleich zu minimieren und mit hoher Zeitauflösung, um die Funktionen der einzelnen Schwingungszyklus zu erfassen. Auch angesichts der relativen Dunkelheit des Signals, Kultur-und Erwerbsbedingungen sind sorgfältig abgestimmt, um empfindliche und robuste Ergebnisse zu gewährleisten. . 1 Ein ECM-Substrat für die Beschichtung der Glasbodenkulturschalen verwendet: Wir haben die folgenden Faktoren bei der Erzeugung optimal PSM Zellkulturen für die Bildgebung wichtig gefunden. 2. Zugabe von Serum auf die Präparation und Abbildungsmedium. 3. Präparation von PSM identifiziert Embryonen nach der Paarung hete genommenrozygous Paare, deren Nachkommen zwei Kopien des Transgens potenziell tragen. 4. Bilderfassung in einem optimalen Vergrößerungsbereich, mit einer höheren NA Ziel, effiziente Erfassung des Fluoreszenzsignals zu gewährleisten. 5. Beleuchtung mit einem Festkörperlichtquelle, um Intensitätsschwankungen, die Hintergrundgeräusche beitragen könnten, minimiert. 6. Signaldetektion mit einem hochempfindlichen EM-CCD-Kamera, um die Signalauslese maximieren. Suboptimale Kulturen Zellen, die nicht in der gesamten Aufnahme bleiben Sie gesund gerundet und enthalten. Wir vermuten, dass unsere ECM-Substrat, ein Fragment von Zebrafisch fibronectin1 hält Zellen in einem undifferenzierten PSM-ähnlichen Zustand, im Vergleich zu anderen häufig verwendeten Substraten wie Poly-Lysin oder Laminin. Andere Substrate, die wir getestet verursacht Zellen auf dem Glas und der Verlust von Schwingungsfluoreszenzsignal im Verlauf der Aufzeichnung zu glätten. Wir fanden auch, dass die Zugabe von Serum in dem Medium während der Dissektion Streuung,und die Aufnahme war nicht nur wichtig, um das Trypsin für die Dissoziation verwendet zu stillen, sondern auch erhöhte Fluoreszenzintensität über Hintergrund, wahrscheinlich aufgrund der verbesserten Zelllebensfähigkeit. Um eine optimale Signalerfassung von einzelnen Zellen zu gewährleisten verwendeten wir eine 40x-Objektiv speziell für Fluoreszenz-Bildgebung (Zeiss-Plan NeoFluor Serie) entwickelt mit einer hohen NA. Wir fanden auch, dass ein Festkörper-Lichtquelle stabiler als herkömmliche Beleuchtung Quecksilberlampen, die kritisch zu Hintergrundschwankungen, die zu verrauschten Bildern beitragen minimieren. Diese Modifikationen sind wichtig, um robuste Ergebnisse zu gewährleisten. Unter Verwendung dieses Protokolls erwarten wir Kulturen, in denen die Mehrzahl der Zellen in einem bestimmten Bereich an einem gewissen Punkt während der Aufzeichnung fluoreszierend. Wir finden, dass fluoreszierende Zellen typischerweise während der Aufnahmen bleiben gerundet und sind manchmal ziemlich beweglich. Einige Zellen, einschließlich fluoreszierenden Zellen können während der Aufnahme apoptotisch. Diese Zellen werden von jedem ein ausgeschlossennalyse. Wir Zellen, die in Kontakt mit anderen Zellen kommen auch ausschließen oder verschieben außerhalb des Sichtfeld. Im Durchschnitt sehen wir eine Reduktion von 12% der Zellzahl pro Halbbild bis zum Ende der 10 h nach Aufnahme durch Zählen der Anzahl von gesunden Zellen in der übertragenen Lichtkanal gemessen. Dieser Verlust beinhaltet sowohl Zelltod und Zellen, die aus dem Feld bewegt haben. Angesichts dieser Vorbehalte können wir im Durchschnitt, Track 5 fluoreszierenden Zellen pro Feld, das lebensfähig und sichtbar bleiben, und in der Regel erfassen 6 Felder pro Zustand. Zum Beispiel wird ein Experiment mit vier Bedingungen haben insgesamt 24 Feldern erworben und in der Regel etwa 30 verfolgt Zellen pro Zustand. Unter Standardaufnahmebedingungen mit L15-Medium mit 10% fötalem Rinderserum, finden wir, daß PSM-Zellen (n = 101 Zellen aus 4 Experimentwiederholungen) zwischen 2 und 7 Spitzen erzeugen, wobei der Mittelwert und Standardabweichung von 3 ± 1 Spitzen (2 -3 Zyklen). Die mittlere Spitzenzahl, sowie die 25%-Perzentil, 2 Spitzen und das 75%-Perzentil is drei Spitzen. Mit unserem semi-automatische Nachverfolgung und Analyse können wir schnell Fluoreszenzintensität über die Zeit zu generieren Spuren für einzelne PSM-Zellen mit einem in 2C gezeigt Vertreter Zelle Spur. Diese Ausgangs Spuren können dann verwendet werden, um quantitative Messungen der Eigenschaften der Schwingungs PSM Zellen, wie Frequenz, Amplitude, Anzahl der Zyklen und Zeitsteuerung von Spitzen herzustellen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Abbildung 1. Identifizierung von transgenen Embryos und Schaltpläne der Dissektion. (A) Seitenansicht eines transgenen Zebrafischembryo YFP Fluoreszenz ausdrücken bei ~ 5-Somiten-Stadium. Bild ist eine Überlagerung von Durchlicht-und Fluoreszenzkanal. Pfeile zeigen Bereiche des Signals ausgehend von der Spitze der Schwanzknospen, während PSM Richtung l<html> ast Somiten gebildet. Inset zeigt eine schematische Darstellung des Reporter-Transgen (für weitere Informationen über die Entwicklung und in-vivo-Verhalten finden Sie Soroldoni et al. 30. (B) Schematische Darstellung der Seitenansicht eines Embryos vor der ersten bei der Präparation geschnitten. Punktierte rote Linie zeigt den ersten Schnitt über die Hinterhirn gemacht, obwohl das Eigelb Zelle direkt hinter der Schwanzknospe. (C) Schematische Darstellung der abgeflachten PSM nach der Entfernung des Dotterkörnchen und Epidermis, entlang der anterior-posterioren Achse ausgerichtet. punktierte rote Linie zeigt den zweiten Schnitt, um die Spitze zu entfernen der Schwanzknospe für Zerstreuung und Kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Repräsentative Bilder und Spuren aus einer Einzelzelle in einem verteilten PSM Kultur. (A) Montage von Durchlichtbilder aus einer einzigen Zelle PSM in einem 6-h Zeitraffer-Aufnahme. Beachten Sie, dass die Zelle weiterhin gerundet und gesund im Verlauf der Aufzeichnung. (B) entsprechende Montage der Fluoreszenzbilder von einer einzelnen Zelle PSM. Intensitätsspitzen der Zelle im Verlauf der Aufzeichnung gezählt. (C) Durchschnittsintensität über die Zeit von einem ROI auf dieser Zelle angeordnet gemessen. Die Werte werden von jedem Bild aus einem Video mit einer Bildrate von einem pro 2 min mit dem Kreis Interpolator-Plug-in und benutzerdefinierte Makros in Fidschi geschrieben übernommen. Peaks in der Intensität sind wieder in der gesamten Spur nummeriert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Somitogenese ist eine rhythmische Entwicklungsprozess, die räumlich Muster die Körperachse von Wirbeltierembryonen. Bisher haben wir transgenen Zebrafischlinien, die fluoreszierenden Reporter nutzen, um die zyklischen Gene, die dieser Prozess vorangetrieben beobachten. Hier wir Kultur verteilt Zellen aus diesen Linien und Bild ihre Schwingungen über die Zeit in vitro.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dispergierte Kulturen für die Langzeit-Aufnahme von Oszillationen in Fluoreszenzreportern der zyklischen Genexpression in einzelnen isolierten Zellen der Zebrafisch-Segmentationsuhr zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Präsomitenmesoderm oder PSM-Gewebe aus transgenen Zebrafischembryonen präpariert wird. Anschließend wird aus mehreren Embryonen das jeweils hinterste Stück des PSM, die Tailbud-Region, präpariert und die Gewebestücke in Trypsin gesammelt.Anschließend werden die Schwanzknospenstücke manuell mit einer Pipette dispersiert, um eine Zellsuspension zu erzeugen. Schließlich wird die Zellsuspension auf mit Fibronectin beschichteten Kulturschalen zur Langzeit-Aufnahme ausplattiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mehrere zeitliche Intensitätsschwankungen einzelner PSM-Zellen mittels fluoreszenzbasierten Zeitraffer-Mikroskopie zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der in-situ-Hybridisierung der Genexpression im PSM-Gewebe, besteht darin, dass unser Fluoreszenzreporter eine Echtzeitüberwachung der Dynamik der Oszillationen der Segmentierungsuhr auf Einzelzell-Ebene ermöglicht. Diese Methode kann einzigartige Informationen über die Segmentierungsuhr liefern, ist aber auch in anderen Systemen anwendbar, wie beispielsweise bei der Organogenese oder in Krankheitsmodellen, wo sie Einblicke in das Verhalten auf Einzelzellebene ermöglicht, sofern geeignete transgene Linien verfügbar sind. Am Tag vor der Dissektion gewinnen Sie Embryonen aus einer Kreuzung von Zebrafischen, die heterozygot für das transgene Allel sind.Züchten Sie die Embryonen in E3-Medium ohne Methylenblau bei 28 Grad Celsius bis zum Schild-Entwicklungsstadium, etwa sechs Stunden nach der Befruchtung (hpf). Überführen Sie die Embryonen danach in E3-Medium ohne Methylenblau bei 20 Grad Celsius über Nacht. Die Embryonen bilden ab dem Schwanzkeim-Stadium jeweils eine Somiten pro Stunde. Zu Beginn des Dissektionsprotokolls am folgenden Morgen sollten die Embryonen im Fünf-bis-Acht-Somiten-Stadium sein. Nachdem die Werkzeuge für die Dissektion zusammengestellt wurden, überziehen Sie eine Glasboden-Abbildungs-Schale mit Fibronectin als Substrat.Lassen Sie die Schale auf dem Pult, um während der Dissektion unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop zu beschichten. Identifizieren Sie transgene Embryonen durch Untersuchung des Präsomiten-Mesoderms oder PSM. Bei YFP-Expression.Die Fluoreszenz sollte im Bereich vom zuletzt gebildeten Somit bis zur Schwanzanlage sichtbar sein. Wählen Sie Embryonen mit dem stärksten Signal aus. 25 % der Nachkommen sollten homozygote Embryonen sein, die zwei Kopien des Transgens tragen, wobei durchgehendes Licht als Positionsreferenz verwendet wird.Um eine Autofluoreszenz zu vermeiden, überführen Sie positive Embryonen in eine separate Kunststoff-Petri-Schale mit E3-Medium ohne Methylenblau. Um die Embryonen für die Dissektion unter einem Stereomikroskop vorzubereiten, entfernen Sie vorsichtig mit feinen Pinzetten die Korionhülle jedes Embryos im E3-Medium. Achten Sie darauf, den Embryo nicht zu beschädigen oder die Eizelle zu stören.Füllen Sie eine mit Zyl-Guard beschichtete Petrischale mit L-15-Medium mit Serum unter Verwendung einer Pinzette oder eines anderen flachen Werkzeugs. Entfernen Sie alle Luftblasen von der Oberfläche des S-Guards mithilfe einer flammenglasierten Glaspipette. Überführen Sie die beschichteten Embryonen in die Dissektionsschale und schieben Sie mit Hilfe der Drahtwerkzeuge alle Embryonen auf eine Seite.Als Nächstes ein einzelnes Embryo in der kleinen Vertiefung, die in der Sard-Schicht innerhalb der Petrischale angelegt wurde, seitlich ausrichten. Dann mit dem Mikroskalpell direkt vor dem Hinterhirn durch den Embryo und die Dotterzelle sowie durch den ventralen Pol des Embryos schneiden. Das vordere Stück des Embryos aus der Vertiefung entfernen und zur Seite der Schale bewegen.Verwenden Sie anschließend die Drahtwerkzeuge, um verbliebene Dotterzellen-Granula aus dem hinteren Bereich, einschließlich des PSM, abzukratzen. Danach wird das PSM abgeflacht und so ausgerichtet, dass das vordere Ende nach hinten und das hintere Ende nach vorne zeigt. Falls die dünne Ektoderm-Schicht zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgelöst wurde, entfernen Sie sie mit den Drahtwerkzeugen von der Oberseite des PSM-Gewebes, wobei Sie das Mikroskalpell verwenden. Schneiden Sie anschließend die hinterste Spitze des PSM hinter dem Ende des Neurolstrangs oder des Schwanzknospen vom restlichen Gewebe ab.Bewegen Sie das Schwanzknospenstück in eine Ecke der Schale, weg vom Präparationsbereich, und verwenden Sie die Drahtwerkzeuge, um Ablagerungen und unerwünschtes Embryogewebe aus dem Präparationsfeld zu entfernen. Schwanzknospenstücke von mehreren Embryonen, abhängig davon, wie viele Zellen für das Experiment benötigt werden. Im Durchschnitt liefert ein einzelnes Stück Schwanzknospen-Gewebe 1000 Zellen.Füllen Sie eine leere 35 Millimeter Kunststoffschale mit einer kleinen Menge Trypsin-EDTA unter Verwendung der feuerpolierten Glaspipette. Überführen Sie die Schwanzknospenteile in die Schale. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Während das Gewebe in Trypsin inkubiert wird, geben Sie Milli-Q-Wasser zur Fibronectin-Ein-Lösung in der Glasboden-Kulturschale hinzu.Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie dreimal mit Milli-Q-Wasser aus dem Glas. Verwenden Sie eine Vakuumpumpe, um jede Waschlösung zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass die Schale vollständig trocken ist. Um die Schwanzknospenstücke abzubilden, pipettieren Sie 100 Mikroliter L-15 mit Serum in eine Imaging-Schale.Überführen Sie die Schwanzknospenstücke unter Verwendung einer beschichteten Gel-Spitze in einem möglichst geringen Volumen an Trypsin-EDTA in die Imaging-Schale. Pipettieren Sie die Stücke mehrmals auf und ab, um sie zu zerlegen und die Zellen im Medium zu suspendieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.Lassen Sie die Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur auf das fibronectinbeschichtete Glas absinken. Nach der Inkubation geben Sie eine kleine Menge zusätzliches L-15-Medium mit Serum zu den Zellen hinzu. Vor Beginn der Bildaufnahme.Achten Sie darauf, die angesiedelten Zellen nicht zu stören. Um die Zellen abzubilden, stellen Sie zunächst die Schale in die Temperaturkammer am Zeitraffermikroskop.Stellen Sie die gewünschte Temperatur ein und lassen Sie die Petrischale mindestens 30 Minuten lang akklimatisieren, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen. Eine stabile Temperatur ist entscheidend für genaue Periodenmessungen. Erwerben Sie bei einzelnen PSM-Zellen Test-Fluoreszenzbilder, um die Belichtung zu überprüfen.Zeit und Verstärkung. Stellen Sie einen großen dynamischen Bereich an Intensitäten ohne Sättigung bereit, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis sicherzustellen. Ein typisches Fluoreszenzbild, aufgenommen von dispergierten Zellen, die aus unseren Zelllinien stammen.Die Durchführung dieses Protokolls erfordert 400 Millisekunden und 40 Millisekunden für ein Durchlichtbild mit einer E-M-C-C-D-Kamera, die mit einem EM-Verstärkungsfaktor von 85 arbeitet. Darüber hinaus sind Vervorstärker-Verstärkung und Auslesegeschwindigkeit der Kamera entscheidend, um das Signal-Rausch-Verhältnis über den Durchlichtkanal zu maximieren. Wählen Sie ein Zellfeld für die zeitraffende Aufnahme. Führen Sie ein Zeitraffer-Aufnahmeprotokoll durch, indem Sie pro Feld jeweils ein Durchlichtbild und ein Fluoreszenzbild mit einem Intervall von beispielsweise zwei Minuten aufnehmen, um zeitliche Dynamiken zu erfassen, ohne Photobleichen oder zelluläre Toxizität zu verursachen.Um Zeitrafferaufnahmen zu bearbeiten, öffnen Sie eine Datei und trennen die durchtransmittierten Licht- und die Fluoreszenzbilder, um zwei Bildstapel zu erstellen. Um eine einzelne Zelle im durchtransmittierten Lichtkanal zu verfolgen, wählen Sie einen kreisförmigen interessierenden Bereich oder ROI um eine Zelle aus, die am Ende der Aufnahme noch gesund war, sich nicht außerhalb des Sichtfelds bewegt und keinen Kontakt mit anderen Zellen hat.Speichern Sie alle paar Bilder einen ROI im ROI-Manager und verfolgen Sie die Zelle bis zum letzten Bild. Wählen Sie den Fluoreszenz-Bildstapel aus und verwenden Sie mit den gespeicherten ROIs das benutzerdefinierte Kreis-INTERPOLATOR-Plugin und Makro, um die Intensität der verfolgten Zelle über die Zeit zu messen. Überprüfen Sie die Ausgabekurve des Makros daraufhin, ob sie qualitativ die Merkmale der Fluoreszenz-Zeitrafferaufnahme wiedergibt.Exportieren Sie die Werte in ein Excel-Arbeitsblatt. Speichern Sie die ROI-Liste für die Zelle. Gezeigt sind repräsentative Bilder einer einzelnen PSM-Zelle aus einer 10-Stunden-Zeitrafferaufnahme.Das hier verwendete Transgen erzeugt einen Reporter, dessen Produktions- und Abbaudynamik sowie Expressionsniveaus unter Standard-Bildgebungsbedingungen mit L-15-Medium, das 10 % fetalen Rinderserum enthält, vergleichbar mit denen des endogenen Gens und Proteins im Embryo sind. Wir finden, dass PSM-Zellen zwischen zwei und sieben Peaks erzeugen können, wobei der Mittelwert und die Standardabweichung bei drei ± einem Peak liegt. Die Anzahl der medianen Peaks sowie das 25.-Perzentil betragen zwei Peaks, und das 75.-Perzentil beträgt drei Peaks.Mithilfe unserer halbautomatischen Verfolgung und Analyse können wir schnell zeitliche Spuren der Fluoreszenzintensität für einzelne PSM-Zellen erzeugen. Diese Rohdaten-Spuren können anschließend verwendet werden, um quantitative Messungen von Eigenschaften der oszillierenden PSM-Zellen vorzunehmen, wie beispielsweise Frequenzamplitude, Anzahl der Zyklen und Zeitpunkt der Peaks. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Methoden wie die Zugabe von Signalmolekülen oder Inhibitoren angewendet werden, um die Frage zu beantworten, wie der Einzelzell-Oszillator auf Faktoren reagiert, die außerhalb der Zelle im Embryo vorkommen. Wir hoffen, dass diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zementogenese ermöglichen wird, das Verhalten einzelner Zellen der Segmentierungsuhr auf einfache Weise zu untersuchen, wodurch die Zellen von der Komplexität der Zell-Zell-Interaktionen und gewebeebenen Faktoren entkoppelt werden, die diese Untersuchung im intakten Embryo zu einer äußerst schwierigen Aufgabe machen.

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Hier stellen wir das Protokoll für die 3D-Gewebekultur der hinteren Körperachse des Zebrafischs vor, das eine Live-Untersuchung der Wirbeltiersegmentierung ermöglicht. Dieses Explant-Modell bietet Kontrolle über die Achsenverlängerung, die Veränderung von Morphogenquellen und die Subzellularauflösung auf Gewebeebene.

Eine 3D-Schwanz-Explant-Kultur zur Untersuchung der Wirbeltiersegmentierung bei Zebrafischen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Erzeugung disperser Zellkulturen aus präsomitischem Mesoderm von Danio rerio für die Einzelzell-Imaging der Segmentierungsuhr. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung zyklischer Genexpressionsoszillationen.

Generierung von Dispersed präsomitischen Mesoderm Zellkulturen für Imaging der Zebrafisch-Segmentierung Uhr in Einzelzellen

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