Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie angereicherte Populationen von Hippocampus-Neuronen und einzelnen Neuronen aus gefrorenen Gewebeschnitten durch Laser-Capture-Mikrodissektion für die anschließende Genexpressionsanalyse erhalten werden können. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Ratte in einer Narkosekammer betäubt wird. Die Ratte wird dann intubiert, mechanisch beatmet und in einen stereotaktischen Kopfhalter gelegt, um die Ratte auf eine Verletzung des Flüssigkeitsperkussionshirns vorzubereiten.

Der zweite Schritt besteht darin, die Flüssigkeit Perkussion Hirnverletzung zu verabreichen. Als nächstes werden koronale Abschnitte des Gehirns auf einem Kryostaten geschnitten und entweder mit Fluro-Hilfsmitteln, einem Marker für degenerierende Neuronen, oder mit echtem Violett, einem Raketenfleck, gefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, eine Laser-Capture-Mikrodissektion durchzuführen und einzelne Neuronen oder Neuronenpools zu sammeln.

Letztendlich wird die Gesamt-RNA aus den eingefangenen Zellen isoliert, auf ihre Qualität hin analysiert und mit einem Agilent Bioanalyzer quantifiziert und in Downstream-Anwendungen wie quantitativer Echtzeit-PCR und pfadorientierter oder genomweiter Microarray-Analyse eingesetzt. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie der manuellen Mikrodissektion besteht darin, dass wir angereicherte Populationen von Neuronen oder anderen Gehirnzelltypen wie Gliazellen oder immunmodulatorischen Zellen oder einzelne Neuronen aus Gewebeschnitten erhalten können. Dies ermöglicht es uns, Genexpressionsanalysen in verschiedenen identifizierten Zelltypen im Gehirn und in anderen heterogenen Geweben, die aus mehreren Zelltypen bestehen, durchzuführen.

Debbie Boone, leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor. Zuerst wird das Hirngewebe von Ratten mit Flüssigkeitsperkussion, Schädel-Hirn-Trauma oder Scheinverletzung aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius entnommen und auf minus 22 Grad Celsius übertragen. Kryostat für 10 Minuten, um das Gehirn auf Schnitttemperatur zu bringen, während das Gehirn auftaut.

Wischen Sie den Kryostaten mit ethanolhaltigem RNA-Zap ab und reinigen Sie die Bürsten mit Ethanol. Entfernen Sie nach Ablauf der 10 Minuten das Gehirn aus dem Schlauch und legen Sie es mit der Bauchseite nach oben auf ein Stück Gaze auf dem Kryostat-Tisch, verwenden Sie eine frische Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn auf, um den hinteren Teil des Gehirns zu entfernen. Nur rostral zum Kleinhirn und der vordere Teil am Chiasma opticum.

Füllen Sie eine Kryoform mit OCT-Eindeckmedium und setzen Sie das Gehirn mit der Frontseite nach unten in die Form ein. Lassen Sie das Hirngewebe im Einbettmedium einfrieren, bis es weiß wird. Dies sollte ca. 10 Minuten dauern.

Frieren Sie nun die Probenscheibe mit OCT auf das Gehirn ein. Entfernen Sie dann den Schimmel. Setzen Sie die Scheibe mit dem Gehirn in den Probenkopf ein und ziehen Sie die Schrauben fest.

Setzen Sie eine Einwegklinge mit niedrigem Profil in den Messerhalter ein und ziehen Sie den Hebel fest. Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gehirns bei 20 Mikrometern, um die äußere Schicht der OCT zu entfernen. Sobald die Hippocampusregion erreicht ist, stellen Sie den Mikron-Drehknopf auf 10.

Sammeln Sie koronale Serienschnitte, indem Sie einen Objektträger oder Plusglas platzieren. Schieben Sie auf den Gewebeschnitt. Legen Sie die Objektträger in ein RNAs-freies Färbegestell bei minus 20 Grad Celsius, bis die Schnittaufnahme abgeschlossen ist.

Bevor Sie mit dem Färben der Abschnitte fortfahren, wischen Sie alle Fleckenbehälter und Messzylinder mit Ese ab und spülen Sie es mit Milli Q-Wasser ab. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen mit RNA-freiem Wasser hergestellt wurden und dass der krestale Violett- und Fluorjadefleck zuvor einen 0,2-Mikron-Filter durchlaufen hat. Verwenden Sie Thor-Gehirnschnitte 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur und fixieren Sie sie eine Minute lang mit 75%igem Ethanol.

Fahren Sie dann mit der entsprechenden Gegenfärbung für LCM von entweder Neuronenschwaden oder einzelnen Neuronen für LCM von Neuronenschwaden nach der Fixierung fort, spülen Sie die Objektträger eine Minute lang in RNAs, flüssigem Wasser und färben Sie eine Minute lang mit 1 % Kammviolett. Spülen Sie dreimal für jeweils eine Minute in RNAs, freies Wasser und dehydrieren Sie zweimal für jeweils 30 Sekunden mit 95 % Ethanol. Dann zweimal 100% Ethanol für 30 Sekunden und Xylol zweimal für jeweils drei Minuten.

Nach dem Färben an der Luft trocknen Sie alle Teile 15 Minuten lang in einem Abzug und fahren Sie dann mit LCM fort. LCM wird durchgeführt. Mit einem P-Zelle-Two-E-Mikroskop mit einem Infrarot-Diodenlaser stellen Sie zunächst den mittleren Joystick in die vertikale Position.

Drehen Sie dann und fixieren Sie das Forex-Ziel in Position. Platzieren Sie einen Objektträger mit gefärbten Hippocampus-Schnitten in der Mitte des Mikroskoptisches und stellen Sie ihn manuell ein, bis der Bereich des Hippocampus sichtbar ist. Verwenden Sie den Kurs und finden Sie Fokusanpassungen.

Um den Abschnitt in den Fokus zu bringen, aktivieren Sie das Vakuumfutter, indem Sie die Vakuumtaste an der Steuerung drücken. Drehen Sie dann das 10-fach-Objektiv und arretieren Sie es. Wieder fokussieren mit Kurs und Feineinstellungen.

Legen Sie die Kappen Ihrer Makro-LCM-Kappen in die Kappen und das Kassettenmodul ein und positionieren Sie eine Kappe an der Position der Ladelinie. Drehen Sie den Kappenaufsetzarm und positionieren Sie ihn um die Kappe. Heben Sie dann den Kappenaufsetzarm an, um die Kappen Ihrer Kappe vom Kassettenmodul zu entfernen.

Drehen Sie den Kappenaufsetzarm über den Schlitten und senken Sie ihn dann über den Schlitten ab, um die Kappe auf den Schlitten zu setzen. Stellen Sie den Feinfokus ein und bewegen Sie den Joystick, um zu überprüfen, ob sich Zellen innerhalb des schwarzen Kreises auf der Kappe befinden. Alle Zellen, die erfasst werden sollen, sollten sich innerhalb dieses schwarzen Kreises befinden.

Stellen Sie nun die Laserparameter ein. Drücken Sie zunächst die Laseraktivierungstaste am Controller. Der Laserzielpunkt ist als Rosa sichtbar.

im Sichtfeld auf dem Computermonitor. Stellen Sie die Laserpunktgröße auf klein ein, um den Laser zu fokussieren, und stellen Sie die Leistung und Dauer je nach Bedarf für ein bis zwei Millisekunden auf 65 bis 75 Milliwatt ein, um eine optimale Zellerfassung zu erzielen. Um den Laser zu testen, bewegen Sie den Laserpunkt mit dem Joystick in einen Bereich, in dem keine Zellen zum Aufnehmen vorhanden sind.

Zünden Sie den Laser mit dem Daumenschalter ab. Bewegen Sie dann mit dem Joystick den Laserpunkt vom geschmolzenen Polymerpunkt weg und prüfen Sie, ob sich ein sichtbarer dunkler Ring um einen klaren Bereich befindet, in dem der Laser abgefeuert wurde. Um Zellen zu erfassen, bewegen Sie den Laserpunkt mit dem Joystick über den Bereich der Zellen, um den Laser zu erfassen und abzufeuern.

Bewegen Sie mit dem Daumenschalter den Joystick, während Sie den Laser abfeuern, um einen großen Bereich von Zellen zu erfassen. Nachdem Sie alle interessierenden Zellen abgefeuert haben, heben Sie den Kappenaufsetzarm an. Die eingefangenen Zellen lösen sich vom Gewebeschnitt und haften an der Kappe.

Ihre Kappe, das restliche Gewebe und die fehlenden Zellen werden im Sichtfeld sichtbar sein. Die Zellen auf der Kappe können auch angezeigt werden, indem die Kappe auf einen leeren Teil der Folie gelegt wird. Heben Sie den Kappenaufsetzarm an und drehen Sie ihn zur Kappenentladestation.

Senken Sie die Kappe in die Station ab und drehen Sie den Kappenaufsetzarm wieder in die vorherige Position. Schieben Sie die Kappe mit Ihrem Einführwerkzeug über die Plattform und auf die Kappe. Heben Sie das Werkzeug mit der Kappe von der Plattform an.

Berühren Sie die Kappe leicht mit dem selbstklebenden Teil eines Post-it-Zettels, um unerwünschtes Taschentuch zu entfernen. Setzen Sie die Kappe in ein 0,5 Milliliter RNA-freies Röhrchen ein, das mit 100 Mikrolitern Lysepuffer aus dem wässrigen RN-Mikroisolationskit gefüllt ist. Wirbeln Sie die Kappe sofort für 30 Sekunden zu Lügen.

Die Zellen inkubieren die Proben bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten und frieren bei minus 80 Grad Celsius ein, bis die RNA isoliert ist. Das Färbeverfahren für LCM von einzelnen verletzten Neuronen nach der Fixation ist ähnlich wie das Verfahren für Neuronenschwaden. Einige Inkubationszeiten unterscheiden sich jedoch, und die Abschnitte, die vor dem Spülen und Dehydrieren vier Minuten lang mit Fluorid behandelt wurden, finden Sie im Textteil des Protokolls für Details nach der Färbung.

Trocknen Sie auch hier alle Teile 15 Minuten lang in einem Abzug an der Luft. Bevor Sie mit dem LCM fortfahren, um einzelne Zellen zu erfassen, laden Sie die HS LCM-Kappen in die Kappe oder das Kassettenmodul, wobei das gleiche Verfahren wie bei der Makro-LCM-Kappe verwendet wird. Stellen Sie auch hier die Laserpunktgröße auf klein ein, um den Laser zu fokussieren, aber stellen Sie diesmal die Laserleistung und -dauer für 0,45 bis 0,5 Millisekunden auf 65 bis 75 Milliwatt ein, um eine optimale Zellerfassung einzelner Zellen zu gewährleisten.

Drehen Sie den Kappenaufsetzarm über den Schlitten und senken Sie den Arm in Richtung des Schiebers. Um die Kappe über dem Objektträger zu platzieren, sitzt die Oberfläche der HS-Kappe des Captures erhöht von der Probe. Verwenden Sie während des LCM den Joystick, um den Laser über einzelne positive Zellen mit Fluorhilfe zu bewegen.

Alle Zellen, die eingefangen werden sollen, müssen sich in dem kleinen schwarzen Ring auf der Kappe befinden. Zünden Sie den Laser mit dem Daumenschalter ab. Wenn alle Zellen innerhalb des schwarzen Kreisbereichs mit dem Laserlift, dem Kappenplatzierungsarm, abgefeuert wurden, trennen sich die gefangenen Zellen vom Gewebeschnitt und haften an der Capture-hs-Kappe. Legen Sie nun einen weiteren Objektträger auf den Mikroskoptisch und sammeln Sie die positiven Zellen der Flurohilfe, bis die HS-Kappe voll ist.

Legen Sie dann die Kappe in ein 0,5 Milliliter RNA-freies Röhrchen, das mit 40 bis 50 Mikrolitern Lyse, Puffer, Vortex und Inkubatoren gefüllt ist, bevor Sie sie erneut bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Wenn dies nicht sofort der Fall ist, führen Sie die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen im Textteil des Protokolls durch. Die folgenden Bilder zeigen die Laser-Capture-Mikrodissektion von Schwaden bestimmter Zellpopulationen aus dem Rattengehirn in gefrorenen 10-Mikrometer-Koronalschnitten des Rattengehirns.

Wurden nach diesem Protokoll hergestellt und mit krestalem Violett und Raketenfleck gebeizt. Dieses Bild zeigt Parametall-Neuronen aus den ca. 1 bis ca. drei Unterfeldern des Hippocampus der Ratte. Hier wurden Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus eingefangen.

Schließlich zeigen wir Schwaden von Neuronen, die von den bilateralen Supra-Chiasma-Kernen eingefangen wurden, die sich auf beiden Seiten des dritten Ventrikels und oberhalb des Chiasmas opticus befinden. Das SCN enthält die zirkadiane Hauptuhr, die den zirkadianen Rhythmus im gesamten Körper steuert. Die folgenden Bilder zeigen die Laser-Capture-Mikrodissektion einzelner Neuronen aus dem Hippocampus von Ratten.

Hier gezeigt sind degenerierende fluoridpositive hippokampale ca drei Neuronen, hier überlebende fluro aid negative ca drei Neuronen vor und nach LCM sind zu sehen, gefangene Zellen werden auf der LCM-Kappe visualisiert. Die folgenden Bilder zeigen die Genexpressionsanalyse von Gesamt-RNA, die aus lasereingefangenen Neuronen isoliert wurde. Dieses Bild zeigt quantitative real-time PCR-Daten der Genexpression der zirkadianen Uhr im SCN.

Diese Heatmap der Genexpression in sterbenden und überlebenden Hippocampus-Neuronen zeigt die Erstellung von Expressionsprofilen von Apoptose-bezogenen Genen unter Verwendung fokussierter PCR-Arrays. Schließlich zeigen wir ein Beispiel für eine Heatmap, die aus einer HNO-Microarray-Analyse des gesamten Genoms der Genexpression in etwa einem bis drei Neuronen von Ratten erstellt wurde, die eine Scheinverletzung SHT oder TBI erlitten haben, plus ein liegendes Adeno-assoziiertes siRNA-Virus, das entwickelt wurde, um die Expression von neuronalem Stickstoffmonoxid, Syntase oder Glutathionperoxidase eins zu unterdrücken. beides sind Gene, die durch Hirnverletzungen nach seiner Entwicklung induziert werden. Diese Techniken ebneten den Weg für Wissenschaftler in vielen Forschungsbereichen, einschließlich Hirnverletzungen und Krebs, die Tiermodelle dieser Erkrankungen verwenden, um genomische, proteomische und metabolische Profilerstellung spezifischer Zellpopulationen durchzuführen.

Zum Beispiel verwenden wir diese Techniken derzeit, um bestimmte Zellpopulationen aus dem präfrontalen Kortex und dem Nucleus accumbens im Gehirn zu erfassen, von denen bekannt ist, dass sie an der Sucht beteiligt sind.