Name: Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Lernen Sie die Laser-Capture-Mikrodissektion zur Isolierung von Hippocampus-Neuronen aus gefrorenen Rattenhirnschnitten nach traumatischer Hirnverletzung. Diese Methode ermöglicht präzise Genexpressionsanalysen in spezifischen Zellpopulationen.

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Diese Arbeit wird durch R01 NS052532 (um HLH), der Moody-Stiftung und der Abteilung für Anästhesiologie finanziert. Wir danken Laurie Bolding, Christine Courteau Butler und Christy Perry für ihre redaktionelle Hilfe und Christy Perry für Layout und ausgezeichnete Produktion aller Abbildungen, Tabellen und Grafiken.

Ein. Chirurgische Verfahren und Fluid Percussion TBI <ol><li> Alle Tierexperimente werden zunächst vom Institutional Animal Care und Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas und die National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, National Research Council) genehmigt. </li><li> Rats (erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten, 400-500 g von Anbieter Charles Rivers, Portland erhalten, Maine) sind zwei pro Käfig untergebracht und sofern Futter und Wasser ad libitum in einem Vivarium mit diesen konstanten Bedingungen: Licht-Zyklus (600 h bis 1.800 h), die Temperatur (21 ° C bis 23 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40% bis 50%) eine Woche vor der Verwendung. </li><li> Anesthetize Ratten mit 4% Isofluran, intubieren und mechanisch lüften (NEMI Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) die Ratten mit 1,5-2,0% Isofluran in Sauerstoff: Luft (70:30) und bereiten sie für parasagittal Fluid-Perkussions Verletzungen wie zuvor beschrieben. 8, 10 </li><li> Opfern Ratten im geeigneten Zeitpunkt nach der Verletzung je nach Versuchsanordnung. Schnelles Entfernen Gehirn, frieren sofort auf Trockeneis, und bei -80 ° C in einer 50 ml Tube oder gehen Sie sofort in Oktober für gefrorene Schnitte einbinden. </li></ol> 2. Schneiden und Färben von Rattenhirn <ol><li> Hirngewebe, die nicht sofort benutzt werden können bei -80 ° C für bis zu einen Monat gehalten, wenn bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Brains, die bei -80 ° C sind, dann auf -20 ° C zum Schneiden aufgetaut und dann wieder eingefroren nicht Ertragsqualität RNA nach dem zweiten Auftauen. Sobald das Gehirn wird aufgetaut, montiert in OCT und geschnittene Folien sollte innerhalb von 24 Stunden angefärbt werden und für LCM innerhalb von 30 min bis eine Stunde der Anfärbung. Dadurch wird sichergestellt, gute Qualität RNA. Nach LCM, können erfasst Zellen auf LCM Kappen in Lysepuffer bei -80 ° C werden für bis zu einer Woche gespeichert, sondern RNA sollte in einer angemessenen Weise isoliert werden, um die höchste Qualität zu gewährleisten. &lt;/ Li&gt; <li> Vor dem Schneiden das Gehirn, wischen Sie den Kryostaten mit RNase-Zap und reinigen Sie die Bürsten mit ETOH (ersetzen Sie den Einwegklingenhalter zwischen den einzelnen Gehirn). </li><li> Rufen Sie das Gehirn in der 50 ml Tube aus dem -80 ° C Gefrierschrank; legen Sie es in den Kryostaten bei einer Temperatur von -22 ° C und Tauwetter im Rohr ca. 10 min. Entfernen Sie das Gehirn aus der Tube und Ort auf die Bühne auf Gaze, Bauchseite auf. </li><li> Mit einer Rasierklinge schneiden das Gehirn zu den hinteren Teil des Gehirns nur rostral des Kleinhirns und des vorderen Teils am Chiasma entfernen. Füllen Sie eine cryomold mit Oktober Eindeckmedium (Tissue Tek) und legen das Gehirn in der Form mit der Vorderseite nach unten. Lassen Sie das Hirngewebe in der Eindeckmedium einzufrieren, bis es weiß wird (ca. 10 min). </li><li> Frieren Sie den Probenteller (Tissue Tek) auf das Gehirn mit Oktober Entfernen Sie das Gehirn aus der Form. Legen Sie das Gehirn in der Probe Kopf und die Schrauben festziehen. </li><li> Legen Sie eine Disposalich, low profile Klinge (Fisher Scientific) in den Messerhalter und ziehen Sie die Hebel nach unten. </li><li> Beginnen Aufschneiden des Gehirns auf 20 um, um die äußere Schicht von OCT entfernen. Sobald die Hippocampus-Region erreicht ist, setzen Sie den micron Rad 10. Collect koronalen Schnittserien indem ein Glasträger oder plus-Glasobjektträger auf den Gewebeabschnitt (Fisher Scientific). Objektträger werden bei -20 ° C in einem RNase-free Färbebank erhalten, bis sectioning abgeschlossen ist. </li><li> Um alle RNasen von Glaswaren, wo Gewebeschnitten verarbeitet entfernen, wischen Sie alle Färbung Container und Messzylinder mit Eliminase (Fisher Scientific) und spülen in Milli Q Wasser. Bereiten Sie alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser und filtern die Cresylviolett (Sigma-Aldrich) und Fluoro-Jade (Histo-chem) Fleck mit einem 0,2 um Filter vor dem Gebrauch. </li><li> Auftauen Gehirnschnitte bei RT für 30 sec und fixieren in 75% EtOH (1 min). </li><li> Für LCM einzelner verletzten Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), Mit 1% Cresylviolett (15-20 sec) Gegenfärbung, in RNase-freiem Wasser (2 × 30 sec) Spülen mit Fluoro-Jade (4 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser (3 × 1 min) spülen, dehydratisieren mit 95% ETOH von RNase-freies Wasser (30 sec), 100% EtOH (30 sec) und Xylol (2 x 3 min) hergestellt. </li><li> Für LCM von Schwaden von Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), mit 1% Cresylviolett (1 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser spülen (3 × 1 min), mit 95% entwässert EtOH (2 × 30 s), 100% EtOH (2 × 30 s) und Xylol (2 x 3 min). </li><li> Luft trocknen alle Abschnitte in einem Abzug für 15 min vor dem LCM. Slides können gespeichert, Abschnitt Seiten eingerichtet werden, in eine Folie Box mit Trockenmittel gefüttert, wenn sie von Raum zu Raum übertragen werden müssen. Allerdings sind optimale Ergebnisse erzielt werden, wenn LCM wird unmittelbar nach Abschnitten trocken sind durchgeführt. LCM sollte von 30 min bis 1 h begrenzt. Im nächsten Abschnitt beschreiben wir zunächst, wie die kontinuierliche Schwaden von Zellen, die ea ist zu erfassenSiest für diejenigen, die das Erlernen dieser Technik sind zu meistern. Dann werden wir beschreiben, wie genau erfassen einzelnen Neuronen. In unserem Verfahren identifizieren wir sterben Neuronen durch ihre Affinität für Fluoro-Jade-Marker zu verkommen Neuronen. Fluoro-Jade-negativen Zellen vermutet werden überlebenden Neuronen. </li></ol> 3. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) LCM von Schwaden von bereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus <ol><li> LCM wird unter Verwendung eines Mikroskops PixCell IIe mit einem Infrarot-Diodenlasers (Life Technologies). </li><li> Passen Sie die Mitte des Joysticks, um die vertikale Position. Drehen und verriegeln Sie die 4X Ziel in Position. </li><li> Platzieren einer Folie in der Mitte der dem Mikroskoptisch und manuell einzustellen, bis die Region des Hippocampus in Sicht. Verwenden Grob-und Feintrieb Anpassungen, um das Bild in den Mittelpunkt rücken. </li><li> Aktivieren Sie die Vakuumplatte durch Drücken der Vakuum-Taste auf dem Controller. Drehen und verriegeln Sie die 10X-Objektiv in place. Konzentrieren Sie sich wieder mit Grob-und Feineinstellungen. </li><li> Laden das CapSure Makro LCM Kappen (Life Technologies) in die CapSure Kassettenmodul und Position eine Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement Arm und Position um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. </li><li> Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken den Arm nach unten über den Objektträger, dies wird die Kappe auf der Folie platzieren. Stellen Sie die Fokussierung und bewegen Sie den Joystick, um zu überprüfen, wenn die Zellen im Inneren des schwarzen Kreises befinden sich auf der Kappe. Alle Zellen erfasst sollte in diesem schwarzen Kreises befinden. </li><li> Stellen Sie die Laserparameter. Drücken Sie zunächst den Laser zu aktivieren Taste auf dem Controller. Der Laser Zielpunkt sichtbar als rosa Punkt im Sichtfeld auf dem Computer-Monitor. </li><li> Gesetzt den Fokusdurchmesser um kleine (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Leistung und Dauer auf 65 - 75 mW, für 1,0 bis 2,0 msec für die optimale Zelleinfang benötigt. </li><li> Um test des Lasers, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt zu einem Bereich bewegen, wo es keine Zellen zu holen sind. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt vom geschmolzene Polymer Ort bewegen und prüfen, ob ein sichtbarer dunkler Ring umgibt eine freie Fläche, wo der Laser abgefeuert wurde. </li><li> Um Zellen zu erfassen, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt über den Bereich von Zellen zu erfassen bewegen. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Bewegen Sie den Joystick während des Schießens den Laser auf einen großen Bereich von Zellen zu erfassen. Wenn der Laser gezündet wird es schmilzt das thermoplastische Polymerfilm auf der Kappe auf der Oberfläche der Zielzellen. Das Polymer absorbiert die Laserstrahlung, also nicht Verändern der RNA, DNA oder Proteinen Gewährleistung der Integrität der Probe für zukünftige molekulare Anwendungen. </li><li> Nach dem Brennen alle Zellen von Interesse, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure Kappe. Die restlichen Gewebe und fehlende Zellen wird visIVK im Sichtfeld. Die Zellen an der Kappe kann auch durch Anordnen der Kappe auf einem leeren Abschnitt des Schlittens betrachtet werden. </li><li> Heben Sie den Cap Placement Arm und drehen Sie es um das Cap Unload Station. Senken Sie den Deckel in die Station und drehen Sie das Cap Placement Arm wieder in seine vorherige Position. </li><li> Schieben Sie die CapSure Einsetzwerkzeug den Bahnsteig entlang und auf der Kappe. Heben Sie das Werkzeug aus der Plattform. Die Kappe bleibt angebracht. Leicht berühren die Kappe auf dem CapSure sauber Pad zu reinigen entfernt unerwünschte Gewebe. </li><li> Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 100 ul Lysepuffer aus dem RNAqueous Micro-Isolation Kit erhalten gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. </li></ol> LCM einzelner FJ + Neuronen im Hippocampus <ol start="15"><li> Um einzelne Zellen zu erfassen, laden CapSure HS LCM Mützen in die CapSure Kassettenmodul und positian einer Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement arm und positionieren Sie es um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. </li><li> Stellen Sie den Laserpunkt zu kleinen (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Laserleistung und die Dauer auf 65 -75 mW für 0,45 bis 0,50 ms für eine optimale Zelleinfangbereich von einzelnen Zellen. </li><li> Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken Sie den Arm nach unten in Richtung der Folie. Dadurch wird die Kappe auf dem Objektträger zu platzieren. Die CAPSURE HS cap Oberfläche sitzt der Probe während der LCM erhöht. </li><li> Verwenden Sie den Joystick, um den Laser über einzelne FJ + Zellen zu verschieben. Alle Zellen gefangen müssen in dem kleinen schwarzen Ring auf der Kappe zu sein. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. </li><li> Wenn alle Zellen innerhalb des schwarzen Kreises mit dem Laser gebrannt wurden, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure HS Kappe. </li><li> Legen Sie eine andere Folie auf dem microsbewältigen Bühne und sammeln FJ +-Zellen, bis der HS cap voll ist. Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 40-50 ul Lysepuffer gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. </li></ol> 4. Gesamt-RNA Isolation Von LCM Samples (Dieser Abschnitt wird nur in der Video-Präsentation beschrieben werden) <ol><li> Gesamt-RNA aus Zellen isoliert wird unter Verwendung des Micro RNAqueous-Kit (Ambion) nach den Protokollen des Herstellers. Alle Reagenzien und Waschlösungen sind in diesem Kit zur Verfügung gestellt. Vornässen Mikrofilter Kartuschenanordnung durch Zugabe von 30 ul Lyselösung Puffer in den Filter. Nach 5 min zentrifugieren des Filters für 30 Sekunden bei 10.000 × g zentrifugiert. </li><li> Hinzufügen 3 ul LCM Zusatz zum Probenlysat, um Pipette mischen und Zentrifuge. </li><li> Fügen Sie 52 ul 100% EtOH (1/2 Volumen) auf die Probe Lysat; Pipette zu mischen, und übertragen das Lysat auf den FilterSpalte. </li><li> Zentrifugieren Filtersäule bei 10.000 × g für 1 Minute, um die RNA an die Säule binden. Wenn es mehrere Kappen für ein Probe, drehen jedes Lysat durch die gleichen Spalte getrennt. </li><li> Füllen Sie das RNA-Isolierung Verfahren wie im RNAqueous Micro Kit beschrieben. </li><li> Führen DNase Behandlung und DNase Inaktivierung von LCM-RNA-Proben wie im Kit beschrieben, übertragen die RNA zu einem RNase-freier Schlauch und bei -80 ° C. </li></ol> 5. RNA Quantifizierung und Downstream-Anwendungen Beurteilung der RNA-Qualität und Quantifizierung erfolgt über ein Agilent Bioanalyzer mit Reagenzien aus dem Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. <ol><li> Gesamt-RNA wird auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) analysiert. Die Software wertet die Konzentration und die Integrität der RNA-Probe durch Zuweisen einer RNA Integrity (RIN) zu jeder Probe reicht fROM 1 bis 10 ist. 1-5 zeigt abgebaut RNA und 7-10 zeigt eine gute Qualität RNA. </li><li> Individuelle TaqMan-Assays oder RT2 Profiler Arrays mit SYBR-Green Chemie; nicht abgebaute intakte RNA wird für Real-Time PCR eingesetzt werden. Die RNA kann auch für mRNA Mikroarray-Analyse und microRNA-Microarray-Analyse eingesetzt werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Das LCM-Technik ermöglicht es uns, bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Mechanismen der TBI machen. 8,10,11,12,13 Wir waren die ersten Forscher, um diese Technik zu nutzen, um zu demonstrieren, dass unterschiedliche Teilbereiche des Ratten-Hippocampus Genexpressionsprofile haben, dass korrelieren mit ihrer selektiven Anfälligkeit für Verletzungen. Unsere Studien haben gezeigt, dass wir die Genexpression zu quantifizieren, durch qPCR, von so wenig wie 10 Laser gefangenen Zellen und dass wir genomweiten Microarray-Analyse von so wenig wie 600 eingefangenen Zellen durchzuführen. LCM würde ein wertvolles Werkzeug in ähnlichen Studien von anderen Hirnregionen, die bekanntermaßen in verschiedenen neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt sein werden. Zum Beispiel haben Studien mit LCM Licht in der Pathogenese des Morbus Parkinson in Dopamin-Neuronen der Substantia nigra, 14 Schuppen und half genomweite Profilierung Studien des Nucleus accumbens, die in Lohn-Schaltungen in s verwickelt beteiligt istubstance abuse Störungen. 15 Neuronal Heterogenität am Genomebene 16 reflektiert und zu den mangelnden Erfolg von experimentellen Behandlungen für TBI in klinischen Studien bei. Daher ist es unser Ziel, diese Technik zu nutzen, um die kritischen Elemente beeinflussen neuronale Überleben nach SHT zu untersuchen. Unsere jüngsten genomweite Profilierung Studie zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen nach SHT vorgeschlagen, dass eine zelluläre Rheostaten, der das Verhältnis der Expressionsmengen des Zellüberlebens spiegelt zum Zelltod Genen reguliert Zellschicksals nach SHT. Diese laufenden Studien wird auf die Konzeption und Entwicklung von pharmakotherapeutische Strategien positiv beeinflussen können das Überleben der Zelle Rheostat beitragen. Darüber hinaus verwenden wir derzeit LCM zur Verfolgung und Überwachung der Auswirkungen von potentiellen therapeutischen medikamentöse Behandlungen in Hippocampus-Neuronen nach SHT. So zeigen unsere Studien, dass angesichts sorgfältige RNase-freien Umgang mit Techniken und einigeModifikationen von bestehenden Protokollen, ist es möglich, qualitativ hochwertige RNA-Proben aus LCM für genaue quantitative Genexpressionsanalyse erhalten. Allerdings gibt es ein paar Fallstricke mit LCM Techniken verbunden sind. Zum Beispiel kann nur Sammeln neuronalen Zellen ohne Mikroglia Kontamination nahezu unmöglich. Im pyramidenförmigen Zellschicht des Hippocampus wurde geschätzt, dass 95% der Zellen Neuronen mit 90% dieser Population zu Pyramidenzellen und 10% Interneuronen sein, so dass ein kleiner Prozentsatz von Glia und anderen Zelltypen. 8,17 sind, 18 In unseren Studien verwenden wir Fluoro-Jade einen fluoreszierenden Farbstoff, der spezifisch Etiketten nur verletzten Neuronen im Gehirn. Ein anderer Farbstoff, der ein Marker für GFAP ist notwendig wäre Mikroglia färben. 19 Sammeln nur die Fluoro-jade gebeizt einzigen neuronalen Körpern gewährleistet eine homogene Population von Neuronen. Ein weiteres häufiges Problem, dass erfordern Fehlerbehebung kann, ist, dass ein Kreis nicht istt definiert ist, wenn der Laser abgefeuert. Wenn dies auftritt, ist es notwendig, die Laser-Einstellungen prüfen und einstellen Leistung und Dauer wie nötig. Auch ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kappe gelegt wird und flach auf das Gewebe vollständig in dem Arm sitzt. Unter Bezugnahme auf die LCM technisches Handbuch oder den technischen Support anrufen wird manchmal notwendig sein. Nach LCM und RNA-Isolation, sollte die Qualität der RNA stets anhand einer Bioanalyzer vor jeder Genexpressionsanalyse werden. Es gibt verschiedene Arten von Laser-Capture-Geräte derzeit auf dem Markt einschließlich Laserschneiden (Life Technologies, Leica Microsystems) und Laser katapultiert (Zeiss) Instrumente. Unsere LCM System funktioniert gut für die Erfassung einer kleinen Anzahl von Zellen. Andere hohem Durchsatz und mehr automatisierte Systeme können besser geeignet zur Gewinnung einer größeren Anzahl von Zellen für genomische und besonders Proteomanalyse. Tatsächlich hat LCM mit diesen automatisierten Systemen ein großes Potenzial für die Analyse von protein Expression in identifizierten Zellen angereichert oder Populationen von Zellen. 20 Weiteren kann LCM erleichtern Genexpressionsanalyse immunmarkierten Zellen, 21 ermöglicht es uns, die Genexpression in definierten Zelltypen zu untersuchen unabhängig von der Komplexität in den heterogenen Geweben. So ist LCM ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Spitzenforschung molekulare Untersuchungen von Einzel-oder angereichert Populationen von Zellen.

Genexpressionsanalyse von heterogenen Gewebe ist seit jeher problematisch;. Dies gilt insbesondere im Gehirn von Säugetieren, die etwa 5.000 verschiedene Zelltypen hat 4 Vor der Entwicklung des Laser Mikrodissektion (LCM)-Technik, genomische Untersuchungen der Wirkungen von TBI in vivo wurden auf der Analyse der Genexpression in einer gemischten Population von Gehirnzellen besteht, nicht nur die verschiedenen neuronalen Zelltypen, sondern auch von Gliazellen und immunmodulatorische tragenden Zellen. Die daraus resultierenden komplexen Genexpressionsprofile aus diesen heterogenen Gewebe erhalten, und die oft widersprüchliche Muster von Verletzungen induzierte zelluläre Signale, mag eine Erklärung für das Scheitern in klinischen Studien am Menschen von therapeutischen Strategien bewährt in vorklinischen Studien der TBI. 5 sein Um ein klares Verständnis der Verletzung-induzierte Genexpression in gefährdeten Populationen von Neuronen zu erhalten aus der Ratte hippocampus, haben wir die Technik der LCM, zuerst von Emmert-Buck et al. 3 Anschließend modifiziert wir dieses Mikrodissektion Technik optimiert für effiziente Erfassung von angereichertem Populationen von Neuronen und einzelnen Neuronen für die mRNA-Profiling mittels quantitativer real-time PCR und Mikroarray-Analyse . Um die Integrität der mRNA in Gefrierschnitten von Hirngewebe für genomische Analyse aufrechtzuerhalten, modifizierten wir bestehende Protokolle zum Fixieren, Färben und schnellen Erfassung von Neuronen aus gefrorenen Rattenhirn Abschnitte. Für die Identifizierung und Isolierung von verletzten und sterbenden Neuronen im Hippocampus wir auch optimierte die Fluoro-Jade Färbetechnik für LCM. Fluoro-Jade nicht zwischen apoptotischen und nekrotischen Zelltod zu unterscheiden. So können alle Arten von degenerierten Neuronen dieses Fleck. 6,7 erkannt werden Hier beschreiben wir das Protokoll in unserem Labor verwendet, um Pools von einzelnen sterben oder überleben Neuronen sowie Schwaden von angereichertem populati erhaltenons von unterschiedlichen neuronalen Zelltypen (zB CA1-CA3 Neuronen zur Genexpressionsanalyse nach SHT). Das Verfahren für Fluid Schlagwerk Hirnverletzung in unserem Labor durchgeführt wird ausführlich in Shimamura et al., 8 beschrieben und ist sehr ähnlich zu der lateralen Fluid-Perkussions-Schädigung Protokoll für Mäuse in JoVE von Alder et al. 9 Da die LCM Technik hat wurde gezeigt, dass eine minimale oder keine Auswirkung auf die Unversehrtheit von DNA haben, RNA und Protein in Gewebe, das ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die molekulare und Proteinanalyse von definierten Zelltypen.

<table><tbody><tr><td>PixCell IIe Laser Capture Mikroskop</td><td>Life Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM Verschlüsse</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (histologische Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (histologische Qualität)</td><td>UTMB-Apotheke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free barrier pipettenspitzen</td><td>Fisher</td><td>Scientific 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Arcturus Laser Capture Microdissection System (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Zeiss Laser Microdissection Die PALM-Familie </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

laser capture mikrodissektion von angereichert populationen von neuronen oder single neurons zur genexpressionsanalyse nach traumatic brain injury

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Langfristige kognitive Behinderung nach TBI ist mit Verletzung induzierte Neurodegeneration im Hippocampus-Region in einem mittleren Schläfenlappen, die kritisch für das Lernen, Gedächtnis und leitende Funktion zugeordnet ist. 1,2 Daher unseren Studien zur Genexpressionsanalyse von spezifischen neuronalen konzentrieren Populationen in unterschiedlichen Teilbereichen des Hippocampus. Die Technik der Laser Mikrodissektion (LCM), die 1996 von Emmert-Buck eingeführt, et al., 3 hat für signifikante Fortschritte in der Genexpressionsanalyse einzelner Zellen erlaubt und angereichert Populationen von Zellen aus heterogenen Gewebe wie dem Gehirn von Säugetieren, die enthält Tausende von funktionellen Zelltypen. 4 Wir verwenden LCM und ein gut etabliertes Tiermodell für die Schädel-Hirn-Trauma (SHT), um die molekularen Mechanismen, die die Pathogenese der TBI zugrunde zu untersuchen. Nach Fluid-Perkussions-TBI, sind Gehirn zu vorbestimmten Zeiten nach der Verletzung entfernt, sofort auf Trockeneis eingefroren,und zum Schneiden in einem Kryostaten vorbereitet. Die Rattengehirne in Oktober und geschnitten eingebetteten sofort oder gespeicherte mehrere Monate bei -80 ° C vor dem Schneiden für die Laser Mikrodissektion. Darüber hinaus verwenden wir LCM um die Auswirkungen der TBI auf den Tagesrhythmus zu studieren. Dazu erfassen wir Neuronen aus dem suprachiasmatischen Kerne, die die Master Clock des Gehirns von Säugetieren enthalten. Hier zeigen wir die Verwendung von LCM zu bestimmten einzelnen Neuronen (verletzt und degenerierenden, Fluoro-Jade-positive oder unverletzt, Fluoro-Jade-negativ) und angereicherten Populationen von Neuronen im Hippocampus für nachfolgende Genexpressionsanalyse durch Echtzeit-PCR und / r oder Ganzkörper-Microarrays. Diese LCM-fähigen Studien haben gezeigt, dass die selektive Anfälligkeit von anatomisch verschiedene Regionen des Ratten-Hippocampus in den verschiedenen Genexpressionsprofile von unterschiedlichen Populationen von Neuronen durch LCM aus diesen unterschiedlichen Bereichen erzielt werden reflektiert. Die Ergebnisse unserer Single-Cell-Studien, in denenVergleicht man die Transkriptionsprofile zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen, deuten auf die Existenz eines Zellüberleben Rheostaten, der Zelltod und Überleben reguliert nach SHT.

In unserem ersten LCM Studie konnten wir, dass funktionell unterschiedliche Teilbereiche (CA1 und CA3) des Ratten-Hippocampus zu zeigen Genexpressionsprofile, die ihre Anfälligkeit für TBI. 8 1A-1C reflektieren zeigt Laser-Capture von hippocampalen Pyramidenzellen (CA1- CA3), Gyrus dentatus Neuronen und Neuronen SCN, bevor und nachdem LCM. Saubere Aufnahmen von pyramidal, Granulat oder SCN Neuronen sind jeweils auf die Makro-Kappen gezeigt. 2A-2B veranschaulicht Sterben, Fluoro-Jade positive Pyramidenzellen und Hinterbliebene, Fluoro-Jade negativen Pyramidenzellen vor und nach LCM. Die saubere Erfassung des Sterbens oder überlebenden Neuronen wird durch Betrachten der aufgenommenen Zellen auf den LCM caps gezeigt. Nach LCM, kann die Gesamt-RNA für eine Vielfalt von molekularen Studien einschließlich der quantitativen real-time PCR-Analyse der Genexpression mittels TaqMan-oder SYBR green Chemie (3A), kleine focu verwendet werdensed PCR-Arrays mit SYBR green Sonden (3B) oder Gesamtgenom Mikroarray Studien (3C). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Abbildung 1. Laser Mikrodissektion an Schwaden definierter Zellpopulationen aus dem Rattenhirn. Gefrorene 10 um Kranzschnitte der Rattenhirn werden in Ethanol fixiert, gefärbt mit einem Farbstoff Nissl (Cresylviolett) und vorbereitet LCM. Es zeigen Bilder der Rattenhippokampus und suprachiasmatischen Kern vor und nach LCM und die eingefangenen Zellen visualisiert auf den Makro Kappen. A. Pyramidale Neuronen aus den CA1-CA3 Teilfeldern des Ratten-Hippocampus. B. Granule Zellen in der hippocampalen. C. Bilaterale suprachiasmatischen Kerne zu beiden Seiten des dritten Ventrikelsund oberhalb der Sehnervenkreuzung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Abbildung 2. Laser Mikrodissektion einzelner Neuronen von Ratten Hippocampus. Dargestellt sind A. degenerieren, Fluoro-Jade-positive (gebeizt) hippocampalen CA3 Neuronen und B. Surviving, Fluoro-Jade-negative (ungefärbten) CA3 Neuronen vor und nach LCM. Eingefangenen Zellen visualisiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Genexpressionsanalysen von Gesamt-RNA aus dem Laser erfasst Neuronen isoliert. A. Quantitative real-time PCR Daten circadianen Uhr Genexpression in SCN. B. Heatmap der Genexpression im Sterben und Überleben Hippocampusneuronen zeigt Expression von Apoptose-Gene mit fokussierten PCR-Arrays . C. Agilent gesamten Genoms Mikroarray-Analyse der Genexpression in hippocampalen CA1-CA3 Neuronen von Ratten, die Schein-Verletzung erhalten, TBI oder TBI zuzüglich eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus siRNA zur Knockdown Expression von Genen durch Hirnverletzung (neuronaler Stickstoffmonoxid induzierten Synthase und Glutathionperoxidase-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie angereicherte Populationen von Hippocampus-Neuronen und einzelnen Neuronen aus gefrorenen Gewebeschnitten durch Laser-Capture-Mikrodissektion für die anschließende Genexpressionsanalyse erhalten werden können. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Ratte in einer Narkosekammer betäubt wird. Die Ratte wird dann intubiert, mechanisch beatmet und in einen stereotaktischen Kopfhalter gelegt, um die Ratte auf eine Verletzung des Flüssigkeitsperkussionshirns vorzubereiten.Der zweite Schritt besteht darin, die Flüssigkeit Perkussion Hirnverletzung zu verabreichen. Als nächstes werden koronale Abschnitte des Gehirns auf einem Kryostaten geschnitten und entweder mit Fluro-Hilfsmitteln, einem Marker für degenerierende Neuronen, oder mit echtem Violett, einem Raketenfleck, gefärbt. Der letzte Schritt besteht darin, eine Laser-Capture-Mikrodissektion durchzuführen und einzelne Neuronen oder Neuronenpools zu sammeln.Letztendlich wird die Gesamt-RNA aus den eingefangenen Zellen isoliert, auf ihre Qualität hin analysiert und mit einem Agilent Bioanalyzer quantifiziert und in Downstream-Anwendungen wie quantitativer Echtzeit-PCR und pfadorientierter oder genomweiter Microarray-Analyse eingesetzt. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden wie der manuellen Mikrodissektion besteht darin, dass wir angereicherte Populationen von Neuronen oder anderen Gehirnzelltypen wie Gliazellen oder immunmodulatorischen Zellen oder einzelne Neuronen aus Gewebeschnitten erhalten können. Dies ermöglicht es uns, Genexpressionsanalysen in verschiedenen identifizierten Zelltypen im Gehirn und in anderen heterogenen Geweben, die aus mehreren Zelltypen bestehen, durchzuführen.Debbie Boone, leitende wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor. Zuerst wird das Hirngewebe von Ratten mit Flüssigkeitsperkussion, Schädel-Hirn-Trauma oder Scheinverletzung aus dem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius entnommen und auf minus 22 Grad Celsius übertragen. Kryostat für 10 Minuten, um das Gehirn auf Schnitttemperatur zu bringen, während das Gehirn auftaut.Wischen Sie den Kryostaten mit ethanolhaltigem RNA-Zap ab und reinigen Sie die Bürsten mit Ethanol. Entfernen Sie nach Ablauf der 10 Minuten das Gehirn aus dem Schlauch und legen Sie es mit der Bauchseite nach oben auf ein Stück Gaze auf dem Kryostat-Tisch, verwenden Sie eine frische Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn auf, um den hinteren Teil des Gehirns zu entfernen. Nur rostral zum Kleinhirn und der vordere Teil am Chiasma opticum.Füllen Sie eine Kryoform mit OCT-Eindeckmedium und setzen Sie das Gehirn mit der Frontseite nach unten in die Form ein. Lassen Sie das Hirngewebe im Einbettmedium einfrieren, bis es weiß wird. Dies sollte ca. 10 Minuten dauern.Frieren Sie nun die Probenscheibe mit OCT auf das Gehirn ein. Entfernen Sie dann den Schimmel. Setzen Sie die Scheibe mit dem Gehirn in den Probenkopf ein und ziehen Sie die Schrauben fest.Setzen Sie eine Einwegklinge mit niedrigem Profil in den Messerhalter ein und ziehen Sie den Hebel fest. Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gehirns bei 20 Mikrometern, um die äußere Schicht der OCT zu entfernen. Sobald die Hippocampusregion erreicht ist, stellen Sie den Mikron-Drehknopf auf 10.Sammeln Sie koronale Serienschnitte, indem Sie einen Objektträger oder Plusglas platzieren. Schieben Sie auf den Gewebeschnitt. Legen Sie die Objektträger in ein RNAs-freies Färbegestell bei minus 20 Grad Celsius, bis die Schnittaufnahme abgeschlossen ist.Bevor Sie mit dem Färben der Abschnitte fortfahren, wischen Sie alle Fleckenbehälter und Messzylinder mit Ese ab und spülen Sie es mit Milli Q-Wasser ab. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen mit RNA-freiem Wasser hergestellt wurden und dass der krestale Violett- und Fluorjadefleck zuvor einen 0,2-Mikron-Filter durchlaufen hat. Verwenden Sie Thor-Gehirnschnitte 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur und fixieren Sie sie eine Minute lang mit 75%igem Ethanol.Fahren Sie dann mit der entsprechenden Gegenfärbung für LCM von entweder Neuronenschwaden oder einzelnen Neuronen für LCM von Neuronenschwaden nach der Fixierung fort, spülen Sie die Objektträger eine Minute lang in RNAs, flüssigem Wasser und färben Sie eine Minute lang mit 1 % Kammviolett. Spülen Sie dreimal für jeweils eine Minute in RNAs, freies Wasser und dehydrieren Sie zweimal für jeweils 30 Sekunden mit 95 % Ethanol. Dann zweimal 100% Ethanol für 30 Sekunden und Xylol zweimal für jeweils drei Minuten.Nach dem Färben an der Luft trocknen Sie alle Teile 15 Minuten lang in einem Abzug und fahren Sie dann mit LCM fort. LCM wird durchgeführt. Mit einem P-Zelle-Two-E-Mikroskop mit einem Infrarot-Diodenlaser stellen Sie zunächst den mittleren Joystick in die vertikale Position.Drehen Sie dann und fixieren Sie das Forex-Ziel in Position. Platzieren Sie einen Objektträger mit gefärbten Hippocampus-Schnitten in der Mitte des Mikroskoptisches und stellen Sie ihn manuell ein, bis der Bereich des Hippocampus sichtbar ist. Verwenden Sie den Kurs und finden Sie Fokusanpassungen.Um den Abschnitt in den Fokus zu bringen, aktivieren Sie das Vakuumfutter, indem Sie die Vakuumtaste an der Steuerung drücken. Drehen Sie dann das 10-fach-Objektiv und arretieren Sie es. Wieder fokussieren mit Kurs und Feineinstellungen.Legen Sie die Kappen Ihrer Makro-LCM-Kappen in die Kappen und das Kassettenmodul ein und positionieren Sie eine Kappe an der Position der Ladelinie. Drehen Sie den Kappenaufsetzarm und positionieren Sie ihn um die Kappe. Heben Sie dann den Kappenaufsetzarm an, um die Kappen Ihrer Kappe vom Kassettenmodul zu entfernen.Drehen Sie den Kappenaufsetzarm über den Schlitten und senken Sie ihn dann über den Schlitten ab, um die Kappe auf den Schlitten zu setzen. Stellen Sie den Feinfokus ein und bewegen Sie den Joystick, um zu überprüfen, ob sich Zellen innerhalb des schwarzen Kreises auf der Kappe befinden. Alle Zellen, die erfasst werden sollen, sollten sich innerhalb dieses schwarzen Kreises befinden.Stellen Sie nun die Laserparameter ein. Drücken Sie zunächst die Laseraktivierungstaste am Controller. Der Laserzielpunkt ist als Rosa sichtbar.im Sichtfeld auf dem Computermonitor. Stellen Sie die Laserpunktgröße auf klein ein, um den Laser zu fokussieren, und stellen Sie die Leistung und Dauer je nach Bedarf für ein bis zwei Millisekunden auf 65 bis 75 Milliwatt ein, um eine optimale Zellerfassung zu erzielen. Um den Laser zu testen, bewegen Sie den Laserpunkt mit dem Joystick in einen Bereich, in dem keine Zellen zum Aufnehmen vorhanden sind.Zünden Sie den Laser mit dem Daumenschalter ab. Bewegen Sie dann mit dem Joystick den Laserpunkt vom geschmolzenen Polymerpunkt weg und prüfen Sie, ob sich ein sichtbarer dunkler Ring um einen klaren Bereich befindet, in dem der Laser abgefeuert wurde. Um Zellen zu erfassen, bewegen Sie den Laserpunkt mit dem Joystick über den Bereich der Zellen, um den Laser zu erfassen und abzufeuern.Bewegen Sie mit dem Daumenschalter den Joystick, während Sie den Laser abfeuern, um einen großen Bereich von Zellen zu erfassen. Nachdem Sie alle interessierenden Zellen abgefeuert haben, heben Sie den Kappenaufsetzarm an. Die eingefangenen Zellen lösen sich vom Gewebeschnitt und haften an der Kappe.Ihre Kappe, das restliche Gewebe und die fehlenden Zellen werden im Sichtfeld sichtbar sein. Die Zellen auf der Kappe können auch angezeigt werden, indem die Kappe auf einen leeren Teil der Folie gelegt wird. Heben Sie den Kappenaufsetzarm an und drehen Sie ihn zur Kappenentladestation.Senken Sie die Kappe in die Station ab und drehen Sie den Kappenaufsetzarm wieder in die vorherige Position. Schieben Sie die Kappe mit Ihrem Einführwerkzeug über die Plattform und auf die Kappe. Heben Sie das Werkzeug mit der Kappe von der Plattform an.Berühren Sie die Kappe leicht mit dem selbstklebenden Teil eines Post-it-Zettels, um unerwünschtes Taschentuch zu entfernen. Setzen Sie die Kappe in ein 0,5 Milliliter RNA-freies Röhrchen ein, das mit 100 Mikrolitern Lysepuffer aus dem wässrigen RN-Mikroisolationskit gefüllt ist. Wirbeln Sie die Kappe sofort für 30 Sekunden zu Lügen.Die Zellen inkubieren die Proben bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten und frieren bei minus 80 Grad Celsius ein, bis die RNA isoliert ist. Das Färbeverfahren für LCM von einzelnen verletzten Neuronen nach der Fixation ist ähnlich wie das Verfahren für Neuronenschwaden. Einige Inkubationszeiten unterscheiden sich jedoch, und die Abschnitte, die vor dem Spülen und Dehydrieren vier Minuten lang mit Fluorid behandelt wurden, finden Sie im Textteil des Protokolls für Details nach der Färbung.Trocknen Sie auch hier alle Teile 15 Minuten lang in einem Abzug an der Luft. Bevor Sie mit dem LCM fortfahren, um einzelne Zellen zu erfassen, laden Sie die HS LCM-Kappen in die Kappe oder das Kassettenmodul, wobei das gleiche Verfahren wie bei der Makro-LCM-Kappe verwendet wird. Stellen Sie auch hier die Laserpunktgröße auf klein ein, um den Laser zu fokussieren, aber stellen Sie diesmal die Laserleistung und -dauer für 0,45 bis 0,5 Millisekunden auf 65 bis 75 Milliwatt ein, um eine optimale Zellerfassung einzelner Zellen zu gewährleisten.Drehen Sie den Kappenaufsetzarm über den Schlitten und senken Sie den Arm in Richtung des Schiebers. Um die Kappe über dem Objektträger zu platzieren, sitzt die Oberfläche der HS-Kappe des Captures erhöht von der Probe. Verwenden Sie während des LCM den Joystick, um den Laser über einzelne positive Zellen mit Fluorhilfe zu bewegen.Alle Zellen, die eingefangen werden sollen, müssen sich in dem kleinen schwarzen Ring auf der Kappe befinden. Zünden Sie den Laser mit dem Daumenschalter ab. Wenn alle Zellen innerhalb des schwarzen Kreisbereichs mit dem Laserlift, dem Kappenplatzierungsarm, abgefeuert wurden, trennen sich die gefangenen Zellen vom Gewebeschnitt und haften an der Capture-hs-Kappe. Legen Sie nun einen weiteren Objektträger auf den Mikroskoptisch und sammeln Sie die positiven Zellen der Flurohilfe, bis die HS-Kappe voll ist.Legen Sie dann die Kappe in ein 0,5 Milliliter RNA-freies Röhrchen, das mit 40 bis 50 Mikrolitern Lyse, Puffer, Vortex und Inkubatoren gefüllt ist, bevor Sie sie erneut bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Wenn dies nicht sofort der Fall ist, führen Sie die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen im Textteil des Protokolls durch. Die folgenden Bilder zeigen die Laser-Capture-Mikrodissektion von Schwaden bestimmter Zellpopulationen aus dem Rattengehirn in gefrorenen 10-Mikrometer-Koronalschnitten des Rattengehirns.Wurden nach diesem Protokoll hergestellt und mit krestalem Violett und Raketenfleck gebeizt. Dieses Bild zeigt Parametall-Neuronen aus den ca. 1 bis ca. drei Unterfeldern des Hippocampus der Ratte. Hier wurden Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus eingefangen.Schließlich zeigen wir Schwaden von Neuronen, die von den bilateralen Supra-Chiasma-Kernen eingefangen wurden, die sich auf beiden Seiten des dritten Ventrikels und oberhalb des Chiasmas opticus befinden. Das SCN enthält die zirkadiane Hauptuhr, die den zirkadianen Rhythmus im gesamten Körper steuert. Die folgenden Bilder zeigen die Laser-Capture-Mikrodissektion einzelner Neuronen aus dem Hippocampus von Ratten.Hier gezeigt sind degenerierende fluoridpositive hippokampale ca drei Neuronen, hier überlebende fluro aid negative ca drei Neuronen vor und nach LCM sind zu sehen, gefangene Zellen werden auf der LCM-Kappe visualisiert. Die folgenden Bilder zeigen die Genexpressionsanalyse von Gesamt-RNA, die aus lasereingefangenen Neuronen isoliert wurde. Dieses Bild zeigt quantitative real-time PCR-Daten der Genexpression der zirkadianen Uhr im SCN.Diese Heatmap der Genexpression in sterbenden und überlebenden Hippocampus-Neuronen zeigt die Erstellung von Expressionsprofilen von Apoptose-bezogenen Genen unter Verwendung fokussierter PCR-Arrays. Schließlich zeigen wir ein Beispiel für eine Heatmap, die aus einer HNO-Microarray-Analyse des gesamten Genoms der Genexpression in etwa einem bis drei Neuronen von Ratten erstellt wurde, die eine Scheinverletzung SHT oder TBI erlitten haben, plus ein liegendes Adeno-assoziiertes siRNA-Virus, das entwickelt wurde, um die Expression von neuronalem Stickstoffmonoxid, Syntase oder Glutathionperoxidase eins zu unterdrücken. beides sind Gene, die durch Hirnverletzungen nach seiner Entwicklung induziert werden. Diese Techniken ebneten den Weg für Wissenschaftler in vielen Forschungsbereichen, einschließlich Hirnverletzungen und Krebs, die Tiermodelle dieser Erkrankungen verwenden, um genomische, proteomische und metabolische Profilerstellung spezifischer Zellpopulationen durchzuführen.Zum Beispiel verwenden wir diese Techniken derzeit, um bestimmte Zellpopulationen aus dem präfrontalen Kortex und dem Nucleus accumbens im Gehirn zu erfassen, von denen bekannt ist, dass sie an der Sucht beteiligt sind.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

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