Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrische Aktivitäten von Neuronen in einem intakten Fischgehirn zu registrieren. Dazu wird zunächst ein vier bis sechs Monate alter transgener meca-Fisch in MS 222 anästhesiert und anschließend das Gehirn präpariert. Danach wird mittels einer Ableitelektrode auf ein mittels GFP markiertes Neuron von Interesse kontaktiert und dessen elektrische Aktivitäten mittels Loose-Patch- oder Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie aufgezeichnet.

Letztlich können die Ergebnisse Änderungen in der Feuerrate von Aktionspotentialen oder Änderungen im Membranpotential als Reaktion auf verschiedene Behandlungen im intakten Gehirn zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Elektrophysiologie von Zellen in Kultur oder Schnittpräparationen des Gehirns, besteht darin, dass wir die elektrischen Eigenschaften von Neuronen in einer Ganzgehirn-Präparation mit intakten neuronalen Schaltkreisen charakterisieren können. Obwohl diese Messung Einblicke in die reprodunktive Neuroendokrinologie bietet, kann sie auch auf andere neuronale Systeme angewandt werden, indem beispielsweise Zebranieren verwendet werden, da Neuronen die Motivation und affektive Verhaltensweisen steuern.

Diese Demonstration verwendet transgene meca-Fische, bei denen die GnRH-Drei-Neuronen genetisch mit GFP markiert sind. Betäuben Sie zunächst einen adulten maka, indem Sie ihn in fünf Milliliter MS 222 eintauchen. Einige Minuten, nachdem die Kiemenbewegungen aufgehört haben, überführen Sie ihn in eine 60 Millimeter große Petrischale mit Fischsaline. Schneiden Sie nun mit einer Schere den Fisch am hinteren Ende des Alums ab.

Überführen Sie den Kopf in eine 35 Millimeter durchmessende Petrischale, die zur Hälfte mit Fischsalin gefüllt und mit yl-Schutz ausgekleidet ist. Die Schale benötigt eine zentrale Vertiefung, in der der Kopf mit der dorsalen Seite nach oben mithilfe feiner Insektennadeln fixiert wird. Schneiden Sie vorsichtig den dorsalen Teil des Schädels entlang des Umfangs auf.

Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pinzette den Schädel, wodurch der dorsale Teil des Gehirns einschließlich des vorderen Teils des Rückenmarks freigelegt wird. Heben Sie nun mit einer feinen Pinzette das Rückenmark leicht an und durchtrennen Sie die beidseitigen Verbindungsnerven mit einer feinen Schere. Dazu gehört auch das Durchtrennen der Hirnnerven, der Spinalnerven, der optischen Nerven an der ventralen Seite sowie der vorderen Riechnerven.

Legen Sie das vollständig präparierte Gehirn unter dem Mikroskop in eine neue Petrischale, die mit frischer Fischsalzlösung gefüllt ist. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das gesamte Gehirn und die Hypophyse intakt sind und nicht durchtrennt oder durchbohrt wurden. Entsorgen Sie beschädigte Gehirne und beginnen Sie erneut mit einer Nadel.

Platzieren Sie einen kleinen Tropfen eines schnell härtenden Klebstoffs wie Cyanacrylat in die Mitte der Ableitungskammer. Verteilen Sie den Klebstofftropfen auf einer Fläche von einem Quadratzentimeter. Übertragen Sie das Gehirn dann schnell auf den Klebstoff.

Befestigen Sie es mit der Bauchseite nach oben. Füllen Sie nun die Ableitungskammer mit etwa einem Milliliter Fischsalzlösung, um das Gehirn zu bedecken. Entfernen Sie mit der feinen Pinzette vorsichtig die Hirnhäute von der Oberfläche des Ableitungsgebiets des Gehirns in Richtung vorn.

Perfudieren Sie das Gehirn kontinuierlich mit belüfteter Fischsalzlösung mit einer Rate von mindestens 200 Mikrolitern pro Minute. Stellen Sie sechs bis zehn Glas-Mikroelektroden mit einem Widerstand von etwa sechs bis zehn Megaohm her und füllen Sie diese etwa zur Hälfte mit loser Patch-Aufzeichnungslösung auf. Suchen Sie mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop und einer gekühlten CCD-Kamera die GFP-exprimierenden Neuronen des terminalen Nervs gnRH3, beginnend mit dem 10×-Objektiv.

Wechseln Sie dann zum 40x-Objektiv und lokalisieren Sie die Neuronen an oder nahe der ventralen Oberfläche der Riechkugeln direkt kaudal des Cephalons. Schalten Sie nun auf einen Videomonitor um, der Echtzeitbilder vom Mikroskop liefert. Der Neuronenverbund enthält acht bis zehn GnRH-Neuronen.

Platzieren Sie die Mikroelektrode in die Badkammer der Aufzeichnungseinrichtung, wobei die Elektrodenpitze über dem Zielneuron positioniert ist. Üben Sie kontinuierlich einen geringen positiven Druck aus, damit die Mikroelektrode nicht verstopft. Nähern Sie sich vorsichtig dem Zielneuron mit der Elektrodenpitze, überprüfen und überwachen Sie dabei den Elektrodenwiderstand mit der Axo-Graft-Software.

Bei Verwendung des Dichtungstests im Spannungs-Klemm-Modus ändert sich, wenn die Elektrodenpit auf der Oberfläche des Neurons liegt, der Elektrodenwiderstand an dieser Stelle geringfügig. Lösen Sie den positiven Druck, um gegebenenfalls einen Dichtung mit niedrigem Widerstand zu erzeugen, indem Sie leichten negativen Druck anwenden. Der kritischste Schritt für eine gute Aufnahme besteht darin, einen sauberen Neuriten auszuwählen, was Ihnen helfen kann, eine ideale Dichtung zwischen der Elektrode und der gleichen Membran herzustellen.

Wechseln Sie nun in den Strom-Klemm-Modus. Öffnen Sie Chart, ein PowerLab-Programm, und beginnen Sie mit der kontinuierlichen Aufzeichnung der Membranspannung ohne jeglichen Stromzusatz. Passen Sie gegebenenfalls die Spannungsverstärkung und die Aufzeichnungsgeschwindigkeit an. Nehmen Sie die elektrische Basisaktivität in normalem Fischsalin etwa fünf Minuten lang auf, bevor Sie Behandlungen durchführen. Bad-Perfusionen mit Wirkstoffen, Hormonen, Peptiden usw. sollten der Hirnpräparation zugeführt werden, wobei ein Durchfluss von 200 Mikrolitern pro Minute eingehalten wird.

Verwenden Sie anschließend normales Fischsalin zur Spülphase. Nach dem Auffinden einer Zelle überprüfen und überwachen Sie den Elektrodenwiderstand im Spannungs-Klemm-Modus. Wenn sich die Elektrodenspitze auf der Oberfläche des Neurons befindet und sich der Elektrodenwiderstand leicht verändert, lösen Sie den positiven Druck und geben Sie leichteren negativen Druck an, um eine Hochwiderstandsabdichtung am Neuron zu erzeugen.

Sanften Mundabsaugdruck ausüben. Die Membran der gepatchten Zelle durchbrechen. Der Widerstand sinkt sofort auf etwa 120 bis 250 Megaohm, sobald die Membran bricht.

Wechseln Sie nun in den Strom-Klemm-Modus und nehmen Sie die Membranspannung kontinuierlich mittels Diagramm ohne jeglichen Stromzufuhr auf. Passen Sie erneut die Skalierung der Spannung und die Aufzeichnungsrate nach Bedarf an. Nach einer Basislinienaufzeichnung der elektrischen Aktivität in normaler Fischsalzlösung für etwa fünf Minuten wenden Sie Behandlungen an, gefolgt von einer Auswaschphase. Die spontanen elektrischen Aktivitäten der moca-Terminale-Nerven-GnRH3-Neurone wurden im Strom-Klemm-Modus aufgezeichnet.

Die typische Feuerrate liegt bei 0,5 bis sechs Hertz. Die Aktionspotenziale feuern typischerweise in einem tonischen oder schlagenden Muster mit einem ziemlich regelmäßigen Interspike-Intervall; das durchschnittliche Interspike-Membranpotenzial beträgt etwa minus 48 Millivolt. Dieser experimentelle Ansatz ist ebenfalls erfolgreich bei der Aufnahme von GFP-markierten GNRH-Neuronen, die sich im Vorderhirn erwachsener transgener Tiere befinden.

Die elektrische Aktivität von Zebrafisch-Neuronen im ausgeschnittenen, intakten Gehirn von transgenen Zebrafischen wurde auf ähnliche Weise wie für eine DACA mittels Loose-Patch-Aufnahme aufgezeichnet. Mit denselben Techniken konnten ebenfalls Ganzzell-Aufnahmen durchgeführt werden.

Im Gegensatz zu den mekazerebralen Nervus-GnRH-Neuronen weist das Muster der spontanen Aktionspotenzial-Feuerung von Zebrafisch-GnRH-Neuronen im präoptischen Bereich, im ventralen Zerebrum und im Hypothalamus oft eine unregelmäßige Form auf. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Stunde bei einer Aufzeichnungsdauer von 15 Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird. Viel Erfolg.