Name: Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Lernen Sie die Elektrophysiologie identifizierter Neuronen im intakten Gehirn transgener Fische. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung elektrischer Aktivitäten in erhaltenen neuronalen Schaltkreisen.

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Wir danken Herrn Dr. Meng-Chin Lin und Frau Yuan Dong für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health HD053767 (Unterauftrag NLW) und durch Mittel aus dem Institut für Physiologie und Büro des Vizekanzlers für Forschung, University of California-Los Angeles (NLW) unterstützt.

1. Präparation der Gehirne von Adult Medaka <ol><li> Anesthetize erwachsenen männlichen oder weiblichen (Abbildung 1A) durch Eintauchen in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4); warten Sie ein paar Minuten nach der Kiemen Bewegungen vor enthaupten aufgehört. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of California-Los Angeles genehmigt. </li><li> Enthaupte den Fisch in Fisch Kochsalzlösung am kaudalen Ende des Verschlusses mit einer Schere in einer 60-mm-Petrischale. </li><li> Übertragen Fischkopf zu einer 35-mm-Durchmesser Petrischale, halb Fisch mit Kochsalzlösung gefüllt und innen mit Sylgard, die eine Vertiefung in sie zu positionieren und sichern den Kopf für Gehirnsezierung hat. Position und sichern Sie den Kopf dorsal-Seite mit Insekten Pins. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die dorsale Teil des Schädels um ihren Umfang mit einer feinen Schere und entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette, Aussetzen der dorsale Teil des Gehirns vollständig einschließlich der vordere Teil des Rückenmarks. </li> &lt;li&gt; Heben Sie das Rückenmark vorsichtig mit feinen Spitze Zange durchtrennen und die bilateralen Binde Nerven mit spitzen Schere: Hirnnerven, Spinalnerven und Sehnerven an der Bauchseite des Gehirns, und die olfaktorischen Nerven am vorderen Teil des das Gehirn. </li><li> Setzen Sie den vollständig seziert Gehirn in einer frischen Petrischale mit Fisch Kochsalzlösung gefüllt, und überprüfen Sie sorgfältig unter die Lupe, um sicherzustellen, das ganze Gehirn intakt ist (einschließlich der Hypophyse) ohne Schnitte oder Einstiche. Beschädigte Gehirne sind nicht für Experimente verwendet. </li></ol> 2. Montage des Gehirn in einem Recording Kammer <ol><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber oder andere schnell wirkende Kleber mit einer Nadel in der Mitte der Aufnahme Kammer und verteilt den Kleber etwa 1 cm 2. </li><li> Schnell das Gehirn übertragen und kleben Sie es in einem ventral-Seite nach oben. </li><li> 1 ml Kochsalzlösung Fisch so dass sie die Aufnahme Kammer füllt und deckt das Gehirn. Kontinuierlich perfundierendas Gehirn mit belüfteten Fisch Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von mindestens 200 ml / min. </li><li> Mit der feinen Spitze-Pinzette vorsichtig die Hirnhäute über die Oberfläche der Aufnahme Bereich des Gehirns. </li></ol> 3. Elektrophysiologie <ol><li> Lose Patch Aufnahme von Aktionspotential Brennen <ol><li> Glas-Mikroelektroden (6-10 MQ) werden aus Borosilikatglas Pipetten (1B150F-4, World Precision Instruments) unter Verwendung einer Elektrode Abzieher (z. B. Sutter P-87) gebaut, und zurück mit dem losen-patch Recording-Lösung auf halber Höhe der gefüllte Elektrode. </li><li> Verwendung eines aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit einem gekühlten charge-coupled device (CCD)-Kamera, um den GFP-exprimierenden TN-GnRH3 Neuronen durch 10x (1B), dann 40x Wasserimmersionsobjektiven (Abbildung 1C). Sie werden an oder nahe der ventralen Oberfläche der Riechkolben, knapp vor dem telencephalon entfernt. </li><li> Wechseln Sie zu einem Video-Monitor, bietetEchtzeit-Bilder aus dem Mikroskop, um den TN-GnRH3 Neuron Cluster (Abbildung 1C) zu lokalisieren. </li><li> Positionieren der Mikroelektrode in das Bad, so daß die Spitze der Elektrode über dem Neuron Ziel ist. Bewerben konstanten leichten Überdruck der Mikroelektroden, so dass sie nicht verstopft werden, und sanft nähern sich dem Ziel Neuron mit der Spitze der Elektrode. </li><li> Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus mit AxoGraph Software und Verstärker Axoclamp 200B mit Axograph Software (Axon Instruments). Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der AxoGraph Anzeige, dass der Widerstand leicht ändert, lassen Sie die Überdruck und mit leichtem Unterdruck, wenn notwendig, einen niedrigen Widerstand Siegel machen das Neuron (&lt;100 M). </li><li> Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Strom-Eingang, Einstellung der Waageder Spannung und der Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig. Die Daten werden gesammelt und durch Powerlab Software (ADInstruments Inc.) analysiert. </li><li> Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung (Abbildung 2A). Bath Perfusion von Arzneimitteln, Hormonen, Peptiden, etc. zugegeben, um Fisch Kochsalzlösung weiterhin mit einer Rate von 200 ml / min, durch eine Auswaschung in normale Fische Kochsalzlösung 5, 6, 11 gefolgt. </li></ol></li><li> Whole cell recording des Membranpotentials Die gesamte Patch-Clamp-Elektrophysiologie Verfahren ist das gleiche wie das der extrazellulären lose Patch Aufnahme oben beschriebenen Verfahren aus den Schritten 3.1.1 - 3.1.4. Dann werden die Verfahren entsprechend abweichen: <ol><li> Überprüfen und überwachen die Elektrode Widerstand in Voltage-Clamp-Modus. Wenn man von dem Videomonitor, dass die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons und der auf dem Oszilloskop ist, dass sich der Widerstand leicht freigeben positiveDruck und gelten ein wenig Unterdruck auf einen hohen Widerstand Siegel auf dem Neuron (~ 3 Giga Ω) zu machen. Bewerben sanfte Saugwirkung durch den Mund zu zerreißen die gepatchte Membran, du wirst einen plötzlichen Abfall des Widerstandes auf etwa 120-250 MOhm sehen. </li><li> Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus, und notieren Sie die Membran Spannung kontinuierlich ohne Stromaufnahme, die Anpassung der Skala von Spannung und Geschwindigkeit der Aufnahme, wenn nötig. </li><li> Nimm Baseline elektrische Aktivität in normalen Fisch Kochsalzlösung für ca. 5 min vor jeder Behandlung, wie oben in 3.1.7 (2B) beschrieben. </li></ol></li></ol>

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<li>Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+cues+from+conspecifics+alter+electrical+activity+of+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+the+terminal+nerve+via+visual+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).</li>
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<li>Ramakrishnan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+spontaneous+electrical+activity+during+embryonic+development+of+gonadotropin-releasing+hormone-3+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).</li>
<li>Abraham, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gonadotropin-releasing+hormone-3+neuron+ablation+in+zebrafish%3A+effects+on+neurogenesis%2C+neuronal+migration%2C+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction.</a> Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).</li>
<li>Wayne, N. L., Kuwahara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-endorphin+alters+electrical+activity+of+gonadotropin+releasing+hormone+neurons+located+in+the+terminal+nerve+of+the+teleost+medaka+%28Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).</li>
<li>Oka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+gonadotrophin-releasing+hormone+neurones+and+steroid-sensitive+sexually+dimorphic+kisspeptin+neurones+in+teleosts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts.</a> J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

GnRH 3: GFP transgenen Fische bieten einzigartige Modelle, die neurophysiologischen Mechanismen neuronaler Integration und Regulierung in zentralen Steuerung von Verhaltensweisen, die sowohl direkt als auch indirekt in der Reproduktion 3, 8-10 beteiligt sind studieren. Einer der wesentlichen Vorteile dieses Modells besteht darin, dass viele GnRH3 Neuronen, die GFP in der Nähe der ventralen Oberfläche des Gehirns sind, so dass für relativ einfachen Zugang zu den Neuronen für elektrophysiologische Aufz...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>BX50W (aufrecht)</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axoclamp 200B </td></tr><tr><td>A-D-Wandler</td><td>Computer Interference Corp.</td><td></td><td>Digidata ITC-18 </td></tr><tr><td>Gekühlte CCD-Kamera</td><td>PCO Computer Optics</td><td></td><td>Sensicam</td></tr><tr><td>Xenonlampe</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-Filterset</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>Slidebook-Software </td></tr><tr><td>Elektrophysiologie-Datenerfassungssoftware</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Axograph-Software </td></tr><tr><td>Elektrophysiologie-Datenerfassungssoftware</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td>PowerLab </td></tr><tr><td>Headstage für Elektrophysiologie</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>CV 203BU </td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber Platform</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>P1 </td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td></td><td>RC-26G </td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>P87 </td></tr><tr><td>Filament für Elektrodenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>FB330B</td><td>3,0 mm breites Trogfilament</td></tr><tr><td>1,5 mm Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>Micr&#8211; Lektrode zur Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309586</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>MS-222 </td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat Salz</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung Fisch Kochsalzlösung</td><td></td><td></td><td>mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES </td></tr><tr><td>Elektrodenlösung (Loose-Patch) </td><td></td><td></td><td>mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 Glukose </td></tr><tr><td>Elektrodenlösung (Ganzzellpflaster) </td><td></td><td></td><td>mM: 112,5 K-Gluconat; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 Leupeptin; 10 Phospho-Kreatin </td></tr></tbody></table>

aufzeichnung der elektrischen aktivität von identifizierten neuronen im intakten gehirn von transgenen fischen

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Das Verständnis der Zellphysiologie von neuronalen Schaltkreise, die komplexe Verhalten regulieren stark verbessert, indem Modellsystemen in denen diese Arbeiten in einer intakten Zubereitung bei der neuronalen Schaltkreise des ZNS intakt durchgeführt werden kann. Wir verwenden transgene Fische in dem Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit dem grün fluoreszierenden Protein für die Identifizierung im intakten Gehirn sind verschlagwortet. Fische haben mehrere Populationen von GnRH Neuronen und ihre Funktionen sind abhängig von ihrer Lage im Gehirn und dem GnRH-Gen, dass sie 1 auszudrücken. Wir haben unsere Demonstration am GnRH3 Neuronen in den Terminal Nerven (TN) mit den Riechkolben mit dem intakten Gehirn von transgenen Medaka Fisch (Abbildung 1B und C) verbunden befindet konzentriert. Studien zeigen, dass Medaka TN-GnRH3 Neuronen neuromodulatory sind, als ein Sender von der externen Umgebung des zentralen Nervensystems; they spielen keine direkte Rolle bei der Regulierung der Hypophysen-Gonaden-Funktionen, wie auch die bekannte Hypothalamus GNRH1 Neuronen 2, 3. Das Tonikum Muster der spontanen Aktionspotentiale Abfeuern von TN-GnRH3 Neuronen eine intrinsische Eigenschaft 4-6, die Frequenz von denen durch visuelle Hinweise von Artgenossen 2 und dem Neuropeptid kisspeptin 1 5 moduliert. In diesem Video, verwenden wir eine stabile Linie von transgenen Medaka in dem TN-GnRH3 Neuronen exprimieren ein Transgen enthält die Promotor-Region des Gnrh3 verknüpft enhanced green fluorescent protein 7, Ihnen zu zeigen, wie man Neuronen identifizieren und überwachen ihre elektrische Aktivität im gesamten Gehirns Zubereitung 6.

Ein Beispiel für bilaterale Cluster von GFP-markierten TN-GnRH3 Neuronen aus dem Gehirn herausgeschnitten Medakafisches sind in den 1B und 1C gezeigt. Jeder Cluster enthält etwa 8-10 GnRH Neuronen. Die spontanen neuronalen Aktivitäten des Ziel-TN-GnRH3 wurden in Current-Clamp-Modus (I = 0) mit typischen Feuerraten von 0,5-6 Hz aufgezeichnet. Das Muster der Aktionspotential Brennen ist typischerweise ein Tonic oder gegen Muster, mit einer ziemlich regelmäßigen Interspike Intervall. Probe...

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrische Aktivitäten von Neuronen in einem intakten Fischgehirn zu registrieren. Dazu wird zunächst ein vier bis sechs Monate alter transgener meca-Fisch in MS 222 anästhesiert und anschließend das Gehirn präpariert. Danach wird mittels einer Ableitelektrode auf ein mittels GFP markiertes Neuron von Interesse kontaktiert und dessen elektrische Aktivitäten mittels Loose-Patch- oder Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie aufgezeichnet. Letztlich können die Ergebnisse Änderungen in der Feuerrate von Aktionspotentialen oder Änderungen im Membranpotential als Reaktion auf verschiedene Behandlungen im intakten Gehirn zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Elektrophysiologie von Zellen in Kultur oder Schnittpräparationen des Gehirns, besteht darin, dass wir die elektrischen Eigenschaften von Neuronen in einer Ganzgehirn-Präparation mit intakten neuronalen Schaltkreisen charakterisieren können. Obwohl diese Messung Einblicke in die reprodunktive Neuroendokrinologie bietet, kann sie auch auf andere neuronale Systeme angewandt werden, indem beispielsweise Zebranieren verwendet werden, da Neur

recording-electrical-activity-from-identified-neurons-intact-brain

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In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet...

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

Das Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der Elektrophysiologie bei erwachsenen Zebrafischen. Diese Methode kann zur Messung der neuronalen Aktivität in vivo verwendet werden.

Elektrophysiologie adulter Zebrafische: Eine Methode zur Messung der extrazellulären elektrischen Aktivität von Neuronen in vivo

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von elektrischen Signalen von den afferenten Neuronen in einer gelähmten Zebrafischlarve, indem eine Mikropipette in der Nähe des Ganglions der Seitenlinie positioniert und eine lose Dichtung für die Signalerfassung gebildet wird. Die extrazelluläre Lösung erhält während dieses Prozesses die neuronale Lebensfähigkeit.

Überwachung der elektrischen Signale der afferenten Neuronen in einer immobilisierten Zebrafischlarve

Eine einfache Methode, um extrazelluläre Feldpotentiale in der larvalen Zebrafisch Vorderhirn aufnehmen beschrieben. Das Verfahren bietet eine...

Vorderhirn Elektrophysiologische Aufzeichnung im Larven Zebrafisch

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Eine neuartige drahtlose Technik zur Aufzeichnung extrazellulärer neuronaler Signale aus dem Gehirn frei schwimmender Goldfische wird vorgestellt. Das Aufnahmegerät besteht aus zwei Tetrodes, einem Microdrive, einem neuronalen Datenlogger und einem wasserdichten Gehäuse. Alle Teile sind mit Ausnahme des Datenloggers und seines Anschlusses maßgeschneidert.

Drahtlose elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen durch bewegliche Tetrodes in frei schwimmenden Fischen

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

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Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

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