Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch stereotaktische Injektion eines viralen Vektors in das lumbale Hinterhorn eine räumlich eingeschränkte Genexpression im Rückenmark der Maus zu erreichen. Der erste Schritt des Eingriffs besteht darin, den Lendenwirbel zu lokalisieren und freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, den dorsalen Teil des Wirbels zu entfernen, um das Rückenmark freizulegen.

Ein Verfahren, das als Laminektomie bezeichnet wird. Anschließend wird eine Glaspipette, die mit einer Mikrospritzenpumpe verbunden ist, über dem Hinterhorn positioniert und in das Rückenmark abgesenkt. Der letzte Schritt besteht darin, die Vektorsuspension langsam zu injizieren.

Zwei Wochen später wird die Transfektion von Neuronen des Hinterhorns durch die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins demonstriert, das es ermöglicht, die Verteilung des Virus zu verfolgen. Diese Methode hilft, die Funktion von Neuronen in einem Teil der sensorischen Bahn aufzuklären. Wir verwenden es in Studien, die sich speziell auf die Entstehung von entzündlichen oder neuropathischen Schmerzen konzentrieren.

Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um zu lernen, wie die Maus im stereotaktischen Rahmen positioniert wird. Für den Erfolg des Eingriffs ist es unerlässlich, dass die Wirbelsäule richtig fixiert wird, da die Laminektomie eine so heikle Technik ist. Martin Mole, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.

John Wang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter, wird ihm ein bis zwei Tage vor dem Eingriff helfen. Pul-Glaspipetten, um einen Spitzendurchmesser von 40 Mikrometern zu erhalten und die Spitze am Tag der Operation in einem Winkel von 20 Grad abzuschrägen. Beginnen Sie den Eingriff mit der Desinfektion der chirurgischen Geräte und der Vorbereitung der sterilen chirurgischen Instrumente, um den stereotaktischen Rahmen einzurichten.

Montieren Sie den Mikrospritzeninjektor auf den Manipulator und schließen Sie das Gerät an. Befestigen Sie eine der Glaspipetten mit der Klemmverschraubung an der Mikrospritze. Entfernen Sie nun den Kolben von der Mikrospritze.

Füllen Sie die Spritze mit dem Mineralöl, setzen Sie dann den Kolben wieder ein und schieben Sie ihn bis zur Spitze. Vermeiden Sie sorgfältig die Bildung von Luftblasen. Führen Sie dann die Mikrospritze in die Halterung am Injektor ein.

Nehmen Sie anschließend das Virus aus dem Gefrierschrank und bereiten Sie die Viruspartikelsuspension kurz vor der Verwendung vor, indem Sie sie mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf die gewünschte Partikelkonzentration verdünnen. Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Virussuspension auf ein kleines Stück Param. Senken Sie dann die Glaspipettenspitze in den Tropfen und ziehen Sie am Kolben, um die Mikrospritze zu füllen.

am Ende. Erzeugen Sie eine kleine Luftblase an der Pipettenspitze, um ein Verstopfen zu verhindern. Bereiten Sie in diesem Schritt den Operationsbereich vor, indem Sie die Bank im Heizkissen mit Desinfektionsmittel abwischen.

Dann betäuben Sie die Maus durch Inhalation von Fluor. Tragen Sie anschließend Gleitmittel auf jedes Auge auf, um es während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen. Rasieren Sie anschließend das Fell vom unteren Rücken bis zum Hals der Maus. Desinfizieren Sie die Haut abwechselnd mit Tüchern eines topischen Antiseptikums wie Chlorhexidin oder Povidon-Jod und 70%igem Ethanol.

Dann infiltrieren Sie die Inzisionsstelle mit 0,25 % Bupivacain, das eins bis 10 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt ist. Anschließend wird die Haut am verhätschelten Ende des Brustkorbs eingeschnitten, zwei bis drei Zentimeter entlang der Mittellinie und die Faszie, die die Wirbelsäule bedeckt, getrennt. Identifizieren Sie den Wirbel L eins, der sich mit dem Wirbel verhätschelt befindet und das letzte Rippenpaar hält, und legen Sie ihn frei, indem Sie die kleinen Wirbelsäulenmuskeln und Bänder entfernen, die an seiner Rückenfläche befestigt sind.

Heben und halten Sie dann den Wirbel L eins leicht mit einem Paar Addies und einer Pinzette. Verwenden Sie anschließend eine spezielle Laminektomie-Pinzette, um den dorsalen Teil des Wirbels zu entfernen, einschließlich des Dornfortsatzes und der Lamina, um das Rückenmark freizulegen. Vermeiden Sie bei diesem Eingriff eine Beschädigung der Dura mater oder des Rückenmarks.

Übertragen Sie dann die Maus auf eine Heizplatte im stereotaktischen Rahmen und überwachen Sie die Temperatur der Maus während des nachfolgenden Betriebs. Verwende nun die V-Kerben-Spikes, um die Wirbelsäule zu stabilisieren, damit sich der Wirbel beim Atmen nicht bewegt. Bringen Sie als Nächstes die Mikrospritze näher heran, so dass sich die Pipettenspitze über der Laminektomiestelle befindet.

Senken Sie den Kolben, bis Sie sehen, dass die Virussuspension aus der Pipette austritt. Entfernen Sie das Tröpfchen mit steriler Gaze. Positionieren Sie dann die Pipettenspitze am rostralen äußersten Teil des freiliegenden Rückenmarks.

Zentrieren Sie die Pipette über dem hinteren Sulcus medianus und bewegen Sie die Spitze 500 Mikrometer seitlich. Senken Sie danach die Spitze auf die Oberfläche der Nabelschnur ab und stechen Sie in die Dura mater. Senken Sie anschließend die Spitze des Glases ab und pipettieren Sie 300 Mikrometer in das Rückenmark.

Injizieren Sie einen Mikroliter Virussuspension mit einer Geschwindigkeit von 200 Nanolitern pro Minute. Warten Sie am Ende der Injektion mindestens zwei Minuten, bevor Sie die Pipette langsam zurückziehen. Wiederholen Sie den Injektionsvorgang am hätschelten größten Teil des freiliegenden Rückenmarks, um eine vollständige Verteilung des viralen Vektors im Wirbelsäulensegment L vier zu erreichen.

Die beiden Injektionsstellen befinden sich rostral und kuscheln an das L-Vier-Segment. Um Gewebeschäden in der Zielregion nach der Injektionsfreigabe zu vermeiden, wird der Wirbel L eins aus der V-Kerbe geklemmt und die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen entfernt. Als nächstes nähen Sie die Faszie mit fünf oh Vicryl.

Die geschlossene Faszie bietet eine Abdeckung für die Laminektomiestelle. Verschließen Sie dann die Haut mit Nylonnähten oder chirurgischen Klammern. Führen Sie eine postoperative Analgesie für 72 Stunden mit täglichen subkutanen Injektionen von Carprofen in einer Menge von fünf Milligramm pro Kilogramm durch.

Bringen Sie die Maus in einen Auffangkäfig mit weicher, nicht besonderer Einstreu. Platzieren Sie die Maus zur Seite, um bequem zu atmen. Überwachen Sie dann das Tier, bis es vollständig wach ist.

Krankenwagen und fängt an zu trinken. Überwachen Sie die postoperative Genesung durch tägliche Inspektion in den ersten drei Tagen. Dann jeden zweiten Tag oder drei Tage pro Woche, bis das Experiment abgeschlossen ist.

Sieben bis 10 Tage nach der Operation, wenn die Wundheilung abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Hautnähte oder Klammern. Diese Abbildung zeigt die Expression des verstärkten grün fluoreszierenden Reporterproteins (EGFP) im linken Hinterhorn des L-4-Rückenmarks.

Zwei Wochen nach der stereotaktischen Injektion von R-A-A-V-E-G-F-P Neuronen wurden Immunfärbungen für neuronale Kerne Protein in roter Pfeilspitze dargestellt. Zeigen Sie auf verstreute transfizierte Gliazellen in der dorsalen Säule. Ungefähr 80% der Neuronen im medialen Hinterhorn wurden mit Übung infiziert.

Der Eingriff kann in 30 bis 40 Minuten abgeschlossen werden, und bitte denken Sie daran, während des Eingriffs sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie intra-pinen-chimale Injektionen in die Dosis ho des Rückenmarks der Maus durchgeführt werden. Wir verwenden die Technik zur Genmanipulation, aber Sie können sie für andere Zwecke anpassen, z. B. für die intraspinale Anwendung von Medikamenten.