Name: Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Erfahren Sie die langfristige Gen-Silencing-Methode für ITSN-1s in Mäusen mittels kationischer Liposomen und retroorbitaler Injektion. Diese Technik ermöglicht sichere und effiziente Knockdown-Studien in der Lungenendothelforschung.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants R01HL089462 SP unterstützt.

1. Kationische Liposomen Vorbereitung <ol><li> Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden. </li><li> Bereiten Stammlösungen: <ol class="lalpha"><li> - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren. </li></ol></li><li> Spülen Sie den Rundkolben mit Chloroform. In 5-10 ml in den Kolben, Wirbel, und lassen Sie es sich für ein paar Minuten. Halten Sie den Kolben mit Aluminiumfolie jederzeit gesichert. Leeren Sie das Chloroform aus dem Kolben. </li><li> Herstellung von Liposomen: <ol class="lalpha"><li> - In 315 ul DOAB Stammlösung der Rundkolben. </li><li> - In 200 ul Cholesterin stock Lösung in den Kolben. </li><li> - Fügen Sie 9,5 ml Chloroform in den Kolben einnd mischen durch schwenken. </li></ol></li><li> Stellen Sie den Rotationsverdampfer bei 37 ° C, 100 Umdrehungen pro Minute (rpm) oder mehr (100-120 rpm). Der Rotationsverdampfer sollte zu einem Wasserstrahlvakuum Steuerung mit einem Saugrohr richtig befestigt angeschlossen werden. </li><li> Schließen Sie das Argon-Gas-Tank und die Rotavapors. </li><li> Bringen Sie den Kolben an die Rotavapors und passen Sie die optimalen Einstellungen vor dem Absenken es im Wasserbad. Öffnen Sie das erste Ventil für den Argon vollständig durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn. Immer öffnen und schließen dieses Ventil zuerst. Das zweite Ventil steuert den Argondruck Einblasen in den Kolben gegeben. Der Druck sollte immer sanft. </li><li> Senken Sie den Rotationsverdampfer im Wasserbad, genug für den Kolben, um das Wasser vollständig untergetaucht, ohne zu berühren, und schalten Sie die Geschwindigkeit. </li><li> Warten Sie, bis alle Chloroform verdunstet, ca. 10 min. Dann die Maschine stoppen. </li><li> Schalten Sie die Geschwindigkeit und die Rotavapors Argontank Ventile. Jetzt wird der Kolben entfernt werden sollte. </li><li> 2 ml 5% Glucose zu the Kolben zu lösen die Lipide. </li><li> Rubbeln Sie an der Unterseite des Kolbens gründlich mit 1 ml Pipettenspitze alle Lipide aufzulösen. Nach Kratzen, entfernen Sie alle verbleibenden Lipid aus der 1 ml-Spitze in den Kolben, wenn nötig, mit einer zweiten Spitze. </li><li> Inkubation der erhaltenen Lösung in 42 ° C Wasserbad während langsam Vortexen (15 rpm) die Flasche. </li><li> Füllen Sie das Ultraschallgerät Bottich mit kaltem Wasser. Beschallen die Lösung für mindestens 20-30 min mit dem Kolben gehalten und der Boden gerade noch das Wasser zu berühren. </li><li> Der Kolben in der Rotavapors die Wasserbad für 20 min bei 42 ° C, bei Drehzahl Null mit rundem Boden in Wasser getaucht, diesmal. </li><li> Filtern Sie die Liposomen durch einen 0,47 Mikron und anschließend 0,22-Mikron-Filter Spritze. </li><li> Mit einem kleinen Extruder, filtern die Liposomen durch einen 50 nm Membran, um eine homogene Population von unilamellaren Liposomen Bläschen zu erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Liposomen zu einem Eppendorf-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. </li></ol><html> 2. Bereiten Sie die Liposomen: siRNA-ITSN-1-Komplexe <ol><li> Resuspendieren Sie das On-Target-Maus siRNA ITSN in siRNA-Puffer mit 20 mM HEPES und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4, auf eine Endkonzentration von 2 pg / pl. Halten Sie es vor dem Mischen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Liposomen: siRNA ITSN Komplexe in einem Verhältnis von 8 nmol Liposomen: 2 ug RNA (oder 400 nmol Liposomen: 100 ug siRNA ITSN). In der vorliegenden Studie haben wir 50 ul siRNA ITSN aus der Stammlösung (50 &amp;mgr; M) zu 100 ul frisch zubereitet Liposomen mit einem RNA / DNA-ase kostenlos Eppendorf-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Konzentration von siRNA ITSN sehr wichtig ist, weil ein Maximum von 150 ul Mischung bilateral und retroorbitalen injizierten in der Maus sein kann, auf einmal. </li><li> Halten Sie die Mischung auf Eis während der Wartezeit, um die Mäuse zu injizieren. </li></ol> 3. Maus Retro-Orbital-Injektion (Internal Winkel der Augenhöhle) jove_content &quot;&gt; Alle Mausexperimenten genehmigt wurden und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Rush University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt. <ol><li> Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion einer 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht Xylazin (im Handel erhältlich Mischung). Je nach Gewicht des Tieres und das Alter, passen Sie die Lautstärke Anästhetika und Konzentration. Die Mäuse in der Studie verwendeten Mäuse sind CD1 männliche Mäuse, 6-8 Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm. Die Spritzen sind Tuberkulin 1 ml Typ mit der Nadel. </li><li> Halten Maus Ohren mit einer Hand und drehen Sie die Maus nach unten auf einer Seite, um die interne Augenwinkel freizulegen. Richten medial der Plica semilunaris; berühren den Augapfel. </li><li> Nähern der Tränenflüssigkeit des Auges caruncle Halten der Spritze, die das Gemisch in einem 45 Grad Winkel in allen drei Achsen. </li><li> Langsam spritzen die Mischung und lassen Sie die Maus, um mit dem injizierten Seite erholen sich. Wenn eine große FlüssigkeitTröpfchen bildet sich an der Nadeleinführung Platz einfahren Nadel-, Saug-back der Tropfen in die Spritze und versuchen Sie es erneut. Wiederholte Injektionen werden am besten durch abwechselnd die Augen getan, um eine perfekte Erholung zu ermöglichen. Wenn Sie unsicher sind, kann diese Technik durch die Injektion von blauem Farbstoff (50 ul, 0,5% Kristallviolett in Methanol) und das Aussetzen der Maus Lunge, um den blauen Gefäßsystem beobachten überprüft werden. </li><li> Die Mäuse wurden in dieser Studie injiziert wird jeden 3. Tag für 3 Wochen ohne Todesfälle oder unerwünschte Nebenwirkungen. </li></ol> 4. Maus Lung Perfusion und Tissue Collection für biochemische Studien <ol start="0"><li> Stellen Sie die Schlauchpumpe auf 1,5 ml / min laufen. </li><li> Bereiten Sie die Einstellung: Ventilator, OP-Tisch, Instrumente, sterile Wattestäbchen, Q-Tips, Strings, Bechern, destilliertes Wasser, Hanks balanced salt, Tracer. </li><li> Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injektion des Narkosemittels Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin). </li&gt; <li> An der Höhe des Halses, entfernen Sie die Speicheldrüsen und setzen die Luftröhre. </li><li> Beginnen Sie mit Bauchschnitt, Verbrauchssteuern das Zwerchfell, und folgen mit Thorakotomie, Aussetzen der Lunge und das Herz. </li><li> Entfernen Sie die Thymus. </li><li> Mit der Lichtmikroskopie für eine bessere Genauigkeit, catheterize die Lungenarterie. </li><li> Haben Tracheotomie und Intubation mit der Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Ventilator zu einer Geschwindigkeit von 150 Hüben / min und Hubvolumen von 150 ul. </li><li> Als Abgang, öffnen Sie die linke Atrium. </li><li> Perfundieren die Maus Lungengefäße frei von Blut für 5 min, mit der Schlauchpumpe und Hank-Lösung erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Perfundieren den Tracer (8 nm Gold-Albumin 16) für weitere 10 min bei der gleichen Fließgeschwindigkeit. </li><li> Spülen Sie die ungebundenen Tracer von 5 min Lungenperfusion mit Hanks-Lösung. </li><li> Folgen Sie mit in situ Fixierung der Lunge, die durch 10 min Perfusion von 4% (wt / vol) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 1% Gerbsäure in 0,1 PIPESPuffer, pH 7,2. </li><li> Sammeln Sie die Lungen, entfernen Sie den übermäßigen Gewebe, schneiden kleine Blöcke (3/3 mm), und legen Sie sie in einem markierten Szintillationsfläschchen mit 2 ml Fixativ Mischung. </li></ol> Die Mäuse erlischt vollständig betäubt während des Verfahrens. 5. Maus Lung Gewebeeinbettsystem für EM <ol><li> Bereiten Stammlösungen: 1% OsO 4 Palade, Acetat veronal und Kellenberger Puffer. <ol class="lalpha"><li> - 1% OsO 4 Palade-Puffer enthält: 1 ml Acetat veronal Lager, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml 0,1 N Salzsäure und destilliertem Wasser bis zu 5 ml Endvolumen. </li><li> - Acetate veronal Lager wird durch Auflösen von 1,15 g Natriumacetat und 2,94 g andydrous Barbital in 100 ml destilliertem Wasser erhalten. </li><li> Kellenberger-Lösung enthält 2 ml Acetat veronal Lager, 2,8 ml 0,1 N Salzsäure, 0,05 g Uranylacetat und 5,1 mldestilliertes Wasser, pH = 6. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Lunge Blöcke in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH = 7,4, 3 mal kurz. </li><li> Befestigen der Proben in die 4% (w / v) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 PIPES-Puffer, pH 7,2, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Mit 1% Palade-Osmium Post-fix für 1 Stunde in der Motorhaube, auf Eis, in der Dunkelheit. </li><li> Spülen Sie einmal mit Puffer Kellenberger. </li><li> Inkubieren Proben in Kellenberger Puffer für 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen einmal in 50% Ethanol. </li><li> Entwässern mit abgestuften Reihe von Ethanol, 5 min / Stück: 70%, 95%, dann 2 x 15 min 100% Ethanol. </li><li> Wechseln Sie zu 100% Propylenoxid, 2 x 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Propylenoxid und dann eine Mischung aus 50% Propylenoxid und 50% Epon 812, über Nacht inkubieren, Drehen eines Rades, bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Mischung und fügen Sie frisches Epon 812, wenigstens für 4-5 Stunden auf dem Rad. </li><li> Mit verdoppelt sich verjüngenden Formen gefülltauf halbem Weg mit frischen 100% Epon 812, fügen ausgewählten Proben und legen Sie sie an den Kanten. </li><li> Bewegen Sie die Formen in den Inkubator auf 60 ° C und lassen Sie sie für 48-72 Stunden aushärten. </li><li> Wenn polymerisiert, senden Sie die Blöcke, dünn zu sein (60-70 nm dick) geschnitten. </li></ol>

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<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Basierend auf früheren Studien von anderen 9 und uns 1, 18 haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler Endothel...

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug 5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau 6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die Zellen 2. In jüngerer Zeit Liposomen wurden angewendet, um Impfstoffe und niedrigem Molekulargewicht Drogen 7 liefern. Liposomal Lieferung microRNA-7-exprimierenden Plasmid überwindet epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz in Lungenkrebszellen 8. Bei der Ausrichtung dervaskulären Endothel ist die intravenöse Verabreichung notwendig, weil die Komplexe unwahrscheinlich, dass die endotheliale Schranke und extravasieren in dem Interstitium 9 sind. Im Vergleich zu anderen Organen, ECS vom Mikrovaskulatur der Lunge haben die größte Aufnahme und eifrig verinnerlichen kationische Liposomen und DNA / RNA-Komplexen, die Lymphknoten und Peyer-Plaques 9 gefolgt. Intravenöse Lieferung in Tiermodellen der siRNA über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektionen ist erwiesen, auch in hohen Konzentrationen, wie 50 mg / kg 10 harmlos. In der Literatur die Zusammensetzung Liposomen, unterscheidet, basierend auf der Formulierung, Lipide und deren äquimolaren Verhältnis 11, 12. Es gibt eine breite Palette von möglichen Anwendungen, die kationische Liposomen für den Gentransfer in vivo, ob Targeting down-regulation/over-expression der Proteine, die Lieferung von Impfstoffen oder Anti-Tumor-Therapien 13-15. Wichtig zu merkenist, dass die Effizienz der DNA / RNA-Zellmembran Wechselwirkung durch die Form Kopplung zwischen erzeugten Komplexe und Membranlipiden geregelt wird. Dies legt nahe, dass Anpassung der Lipide Zusammensetzung auf die gezielte Zellmembran Profilen von Vorteil sein kann und zu einer hohen Transfektionseffizienz in einem bestimmten Zelltyp 6.

<table><tbody><tr><td>Dimethyldioctadecyl-Ammoniumbromid (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast-Stabilisator (Mini-Extruder)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membran, 19 mm Durchmesser, 50 nm Poren</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Hank's ausgewogene Salze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Rundkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Maus siRNAITSN - on target </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF digital mit RHOO Pumpenkopf</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungsgerät</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td> Vom <td>Hersteller abgekündigt</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungsformen</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm Gold-Albumin-Tracer</td><td></td><td>Im Labor hergestellt wie in16<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Ausgestattet mit 2 Avestin 1 ml gasdichte Spritzen (Kat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Modifizierte siRNA, in vivo<</td></tr><tr>td colspan="4">Teil von IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 März, Deutschland</td></tr><tr><td colspan="4">Ersetzt durch Embed812, Kat. # 14120</td></tr></tbody></table>

langfristige silencing von intersectin-1s in mauslungen von wiederkehrenden lieferung eines spezifischen sirna durch kationische liposomen. auswertung der knockdown effects electron microscopy

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung 1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu 2 zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung 3 Hier eine effiziente und spezifische KD ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD ITSN während der Studie 4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in 4 überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Caveola...

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen einer langfristigen Herunterregulation der Expression von Intersectin 1S auf Struktur und Funktion der Mauslunge zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst spezifische INA-Duplex-Liposomenkomplexe hergestellt werden, um die Lungengefäßstruktur der Maus gezielt anzusteuern. In einem zweiten Schritt werden die INA-Liposomenkomplexe retroorbital injiziert, wobei die Applikation alle 72 Stunden über einen Zeitraum von 24 Tagen hinweg wiederholt wird, um eine effiziente Hemmung der Expression von Intersectin 1S zu erzielen.Als Nächstes wird das Lungen­gewebe injizierter Mäuse für bio­chemische Analysen und EM-Untersuchungen entnommen, um die Expression des intersect in one-Proteins und dessen mRNA-Spiegel zu bewerten sowie umfangreiche morphologische Analysen der Lunge durchzuführen. Die mittels Western Blot von Lysaten der Lunge unter Verwendung spezifischer intersect in one-Antikörper und mittels Q-R-T-P-C-R-Analysen erhaltenen Ergebnisse zeigen einen spezifischen und effizienten Knockdown von intersect in one über 24 aufeinanderfolgende Tage. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Rymern oder Lentiviren besteht darin, dass die Applikation von onischen Liposomen in die Lunge reproduzierbar, sicher, nicht-toxisch und äußerst effektiv in der Lungen­endothelzelle ist.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir uns entschlossen, die Effekte der Intersektion von N nach unten in vivo zu evaluieren, und andere Methoden der sRNA-Abgabe nicht funktionierten. Um onische Liposomen herzustellen, geben Sie 315 Mikroliter einer Stammlösung von Dimethyldioctadecylammoniumbromid oder DOAB zu einem Rundkolben, gefolgt von 200 Mikrolitern Cholesterin-Stammlösung und 9,5 Milliliter Chloroform, die durch Schwenken gemischt werden. Befestigen Sie den Kolben am Rotationsverdampfer, der auf 37 Grad Celsius und 100 oder mehr Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.Öffnen Sie das erste Ventil für Argon vollständig, indem Sie es im Uhrzeigersinn drehen. Öffnen und schließen Sie immer zuerst dieses Ventil. Das zweite Ventil reguliert den Argondruck, der in den Kolben strömt.Öffnen Sie es teilweise, um einen sanften Druck sicherzustellen. Sobald trockenes Eis anfängt, über das Rohr, das den Argon-Gastank mit dem Rotationsverdampfer verbindet, zu tropfen, senken Sie den Rotationsverdampfer in das Wasserbad, bis das Kolben das Wasser berührt, ohne vollständig eingetaucht zu sein. Drehen Sie den Drehzahlregler auf 100 bis 120 U/min. Wenn das gesamte Chloroform im Kolben verdampft ist, schalten Sie das Gerät aus.Stellen Sie die Drehgeschwindigkeit des Rotationsverdampfers auf null ein und schließen Sie die Argonflaschenventile. Entfernen Sie den Kolben. Geben Sie zwei Milliliter einer 5 %igen Glucoselösung hinzu, um die Lipide erneut in Lösung zu bringen.Unter Verwendung einer 1 ml-Pipettenspitze den Boden des Kolbens gründlich abkratzen, um alle Lipide aufzulösen. Die erhaltene Lösung eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius inkubieren, wobei der Kolben langsam verwirbelt wird. Die Lösung 20 bis 30 Minuten lang sonizieren, wobei der Kolben aufrecht gehalten wird und sein Boden gerade eben das kalte Wasser im Ultraschallbad berührt.Erhitzen Sie anschließend das Kolben im Wasserbad des Rotationsverdampfers 20 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und einer Drehzahl von null, wobei der Rundkolben im Wasser eingetaucht ist. Filtern Sie die Liposomen nacheinander durch einen 0,47-Mikron-Spritzenfilter und einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Filtern Sie die Liposomen mithilfe eines kleinen Extruders durch eine 50 Nanometer-Membran, um eine homogene Population einkammeriger Liposomenvesikel zu erzeugen.Überführen Sie die Liposomen in ein Eppendorf-Gefäß und stellen Sie es auf Eis. Bereiten Sie die Liposomen-RNA-ITSN-Komplexe im Verhältnis von acht Mol Liposomen zu zwei Mikrogramm RNA vor. In diesem Beispiel 50 Mikroliter I-A-I-T-S-N.Aus einer 50 Mikromolar-Stammlösung werden 100 Mikroliter frisch hergestellter Liposomen unter Verwendung einer A-R-N-A-D-N-A-freien EOR-Röhre zugegeben. Die Mischung bis zur Injektion in die Mäuse auf Eis lagern. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse sind etwa vier bis sechs Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm.Überprüfen Sie durch einen Zehenzwicktest, ob das Tier vor der Injektion vollständig anästhesiert ist. Verwenden Sie Ein-Milliliter-Tuberkulinspritzen, bei denen die Nadel mit einer Hand befestigt wird. Halten Sie die Ohren der Maus fest und drehen Sie die Maus auf die Seite, um den inneren Augenwinkel freizulegen.Das Ziel befindet sich medial zu den PIKA-Semi-Lunars; vermeiden Sie es, den Augapfel zu berühren. Nähern Sie sich mit der geladenen Spritze im Winkel von 45 Grad in allen drei Achsen der Tränendrüse des Auges. Spritzen Sie die Mischung langsam ein, bringen Sie die Maus danach in ihren Käfig zurück und lassen Sie sie auf der injizierten Seite auskurieren.Nach oben. Die Maus wird alle 72 Stunden über einen Zeitraum von 24 Tagen hinweg mit SIR-NA behandelt, die gezielt gegen das ITSN1-Gen gerichtet ist. Um diesen Vorgang zu beginnen, überprüfen Sie, ob die Maus vollständig anästhesiert ist, indem Sie das Fehlen des Withdrawal-Reflexes feststellen. Beginnen Sie mit einer Laparotomie und entfernen Sie das Zwerchfell.Führen Sie dann eine Thorakotomie durch, um die Lunge und das Herz freizulegen. Entfernen Sie den Thymus mithilfe eines StereoZoom-Mikroskops, um eine höhere Genauigkeit zu erzielen. Katheterisieren Sie die Lungenarterie.Führen Sie anschließend eine Tracheotomie durch und intubieren Sie die Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Beatmungsgerät auf eine Frequenz von 150 Zügen pro Minute und ein Schlagvolumen von 150 Mikrolitern ein. Als Ausfluss öffnen Sie den linken Vorhof mithilfe einer peristaltischen Pumpe, die auf 1,5 Milliliter pro Minute eingestellt ist, und Hank's Lösung, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.Spülen Sie das Mauslungen-Gefäßsystem fünf Minuten lang blutfrei, gefolgt von einer 10-minütigen Perfusionsgabe des Tracers. Nachdem der ungebundene Tracer ausgespült wurde, führen Sie die In-situ-Fixierung der Lungen mittels 10-minütiger Perfusionsgabe von 4 % Formaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 1 % Tanninsäure durch. Sammeln Sie die Lungen ein und entfernen Sie überschüssiges Gewebe.Schneiden Sie die Lungen in kleine Stücke und überführen Sie sie in ein beschriftetes Szintillationsfläschchen, das zwei Milliliter einer Fixiermittel-Mischung enthält. Um die Lungenprobe für die Elektronenmikroskopie vorzubereiten, waschen Sie die Lungenstücke zunächst kurz dreimal in 0,1 molarer Natrium-Cate-Pufferlösung.Als Nächstes fixieren Sie die Proben in 4% Aldehyd 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur, nachfixieren Sie mit 1% Osmiumtetroxid für eine Stunde im Dunkeln im Abzug auf Eis nach einmaligem Spülen mit Cale­n­ber­ger Puffer. Inkubieren Sie die Proben im Cale­n­ber­ger Puffer für zwei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur. Spülen Sie einmal mit 50% Ethanol und dehydrieren Sie anschließend mit einer abgestuften Reihe von Ethanol. 70 % Ethanol für fünf Minuten, 95 % Ethanol für fünf Minuten und anschließend zweimal in 100 % Ethanol je 15 Minuten. Danach auf 100 % Propylenoxid umstellen. Zwei Inkubationen zu je 15 Minuten.Entfernen Sie das Propylenoxid und geben Sie eine Mischung aus 50 % Propylenoxid und 50 % Epon hinzu. Inkubieren Sie über Nacht unter Drehung am Rotationsgerät bei Raumtemperatur. Am folgenden Morgen entfernen Sie die Mischung und geben frisches Epon hinzu. Inkubieren Sie für mindestens vier bis fünf Stunden am Rotationsgerät.Fügen Sie ausgewählte Proben in doppelt konische Formen ein, die zu etwa der Hälfte mit frischem 100% Epon acht 12 gefüllt sind. Platzieren Sie sie an den Rändern, stellen Sie die Formen in einen Inkubator mit 60 Grad Celsius und lassen Sie sie 48 bis 72 Stunden aushärten. Eine chronische Hemmung der Expression von ITSN eins s über 21 aufeinanderfolgende Tage durch wiederholte Applikation von ITSN eins s siRNA-Liposomen-Komplexen führt zu signifikant niedrigeren Konzentrationen des ITSN eins-Proteins in den Lungen von Mäusen, wie es in diesen repräsentativen Ergebnissen gezeigt wird. Lysate aus der Lunge einer unbehandelten Kontrollgruppe und behandelten Mäusen wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der siRNA-Applikation, wie angegeben, mit Antikörpern gegen ITSN eins und Actin geblottet.Die dichtometrische Analyse repräsentativer hochbelichteter CL-Filme und die quantitative R-T-P-C-R von I TSN one s mRNA bestätigen weiterhin, dass die Behandlung mit I TSN one s siRNA-Liposomenkomplexen die I TSN one s-Proteinexpression in der Mauslunge effizient herunterreguliert. Die Abnahme der Intersectin-1-Spiegel führt zu einer defizienten Endozytose und einer Störung des endothelialen Transports, der interendothelialen Barriere sowie zu Lungenödemen. Diese repräsentativen Elektronenmikroskopieaufnahmen von Lungenmaterial zeigen offene interendotheliale Junctions (IJs), die über ihre gesamte Länge hinweg mit acht Nanometer großen Gold-Albumin-Partikeln markiert sind.Panel A eins ist eine Vergrößerung von Panel A, die Pfeilspitzen zeigen drei bis vier Gold-Albumin-Partikel, die nahe beieinander in derselben Ebene liegen. Dies weist auf eine weite Öffnung des IEJ hin. Goldpartikel sind außerdem mit dem abluminalen Austritt der IJs assoziiert, wie durch die Pfeile in den Panels A eins und B angezeigt. Beachten Sie auch die begrenzte Anzahl an CVE A und die Dilatation des perikapillären Raums, gekennzeichnet durch das Sternchen im Panel, eine akute Downregulation der Expression von Intersectin 1, die alternative Transportwege hochreguliert, um eine defiziente Endozytose auszugleichen.Diese EM-Aufnahmen zeigen membranöse Ringe in den Feldern A und A', pleomorphe Tubuli im Feld B sowie vergrößerte Endosomen, die mit typischen cve LA fusioniert sind, im Feld C, die aktiv am Aufnahme- und Transportvorgang von Goldalbumin beteiligt sind. Ebenfalls beobachtet werden eine starke Erweiterung des perivaskulären Raums und eine eiweißreiche Ödembildung. Eine verlängerte Hemmung der Intersectin-1-Expression über 24 Tage verringert das Lungenödem bei Mäusen, indem die Integrität der interendothelialen Barriere teilweise wiederhergestellt wird.EM-morphologische Untersuchungen zeigten, dass der acht Nanometer große Gold-Albumin-Tracer zu diesem Zeitpunkt die IEJ nicht durchdringen konnte und stattdessen Filtrationsrückstände im luminalen Eingang der Verbindung bildete, wie durch den Pfeil angezeigt. Die perivaskulären Räume oder PVS wiesen jedoch eine gewisse Dilatation und leichte Ödeme auf, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen für Partikel dieser Größe undurchlässig sind, aber dennoch lecken multivesikuläre Körper oder MVB in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran, wobei einige ihrer inneren kleinen Vesikel durch acht Nanometer große Gold-Albumin-Partikel markiert sind. Diese Tabelle zeigt die Anzahl endozytotischer transzytotischer Strukturen in der Lungendothelzelle von Kontroll- und defizienten Mäusen.Eine bedeutende Beobachtung ist die Abnahme der Kalvi-Zahl im endothelialen Lungengewebe von ITSN1-defizienten Mäusen. Eine chronische Hemmung der Expression von Intersectin 1 führte zur Aktivierung alternativer endozytotischer Signalwege und verursachte eine teilweise Verringerung der Anzahl membranöser Ringe oder Tubuli, die mit Gold-Albumin-Partikeln markiert waren. In den Lungengefäßen von Mäusen mit chronischer ITS1-Defizienz war die Zahl zudem im Vergleich zu Kontrollen um das 14-Fache erhöht.Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie beispielsweise die Anwendung von Maus-Lungen-Lysaten durchgeführt werden, um den transendothelialen Transport verschiedener hnic-Tracer quantitativ zu bestimmen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Komplexe aus onischen Liposomen und SRNA gezielt in das Lungendothel der Maus abgeben kann, um das Protein der gewünschten Zielstruktur herunterzuregulieren und dessen Funktion zu bewerten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

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