Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen einer langfristigen Herunterregulation der Expression von Intersectin 1S auf Struktur und Funktion der Mauslunge zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst spezifische INA-Duplex-Liposomenkomplexe hergestellt werden, um die Lungengefäßstruktur der Maus gezielt anzusteuern. In einem zweiten Schritt werden die INA-Liposomenkomplexe retroorbital injiziert, wobei die Applikation alle 72 Stunden über einen Zeitraum von 24 Tagen hinweg wiederholt wird, um eine effiziente Hemmung der Expression von Intersectin 1S zu erzielen.

Als Nächstes wird das Lungen­gewebe injizierter Mäuse für bio­chemische Analysen und EM-Untersuchungen entnommen, um die Expression des intersect in one-Proteins und dessen mRNA-Spiegel zu bewerten sowie umfangreiche morphologische Analysen der Lunge durchzuführen. Die mittels Western Blot von Lysaten der Lunge unter Verwendung spezifischer intersect in one-Antikörper und mittels Q-R-T-P-C-R-Analysen erhaltenen Ergebnisse zeigen einen spezifischen und effizienten Knockdown von intersect in one über 24 aufeinanderfolgende Tage. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Rymern oder Lentiviren besteht darin, dass die Applikation von onischen Liposomen in die Lunge reproduzierbar, sicher, nicht-toxisch und äußerst effektiv in der Lungen­endothelzelle ist.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir uns entschlossen, die Effekte der Intersektion von N nach unten in vivo zu evaluieren, und andere Methoden der sRNA-Abgabe nicht funktionierten. Um onische Liposomen herzustellen, geben Sie 315 Mikroliter einer Stammlösung von Dimethyldioctadecylammoniumbromid oder DOAB zu einem Rundkolben, gefolgt von 200 Mikrolitern Cholesterin-Stammlösung und 9,5 Milliliter Chloroform, die durch Schwenken gemischt werden. Befestigen Sie den Kolben am Rotationsverdampfer, der auf 37 Grad Celsius und 100 oder mehr Umdrehungen pro Minute eingestellt ist.

Öffnen Sie das erste Ventil für Argon vollständig, indem Sie es im Uhrzeigersinn drehen. Öffnen und schließen Sie immer zuerst dieses Ventil. Das zweite Ventil reguliert den Argondruck, der in den Kolben strömt.

Öffnen Sie es teilweise, um einen sanften Druck sicherzustellen. Sobald trockenes Eis anfängt, über das Rohr, das den Argon-Gastank mit dem Rotationsverdampfer verbindet, zu tropfen, senken Sie den Rotationsverdampfer in das Wasserbad, bis das Kolben das Wasser berührt, ohne vollständig eingetaucht zu sein. Drehen Sie den Drehzahlregler auf 100 bis 120 U/min. Wenn das gesamte Chloroform im Kolben verdampft ist, schalten Sie das Gerät aus.

Stellen Sie die Drehgeschwindigkeit des Rotationsverdampfers auf null ein und schließen Sie die Argonflaschenventile. Entfernen Sie den Kolben. Geben Sie zwei Milliliter einer 5 %igen Glucoselösung hinzu, um die Lipide erneut in Lösung zu bringen.

Unter Verwendung einer 1 ml-Pipettenspitze den Boden des Kolbens gründlich abkratzen, um alle Lipide aufzulösen. Die erhaltene Lösung eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius inkubieren, wobei der Kolben langsam verwirbelt wird. Die Lösung 20 bis 30 Minuten lang sonizieren, wobei der Kolben aufrecht gehalten wird und sein Boden gerade eben das kalte Wasser im Ultraschallbad berührt.

Erhitzen Sie anschließend das Kolben im Wasserbad des Rotationsverdampfers 20 Minuten lang bei 42 Grad Celsius und einer Drehzahl von null, wobei der Rundkolben im Wasser eingetaucht ist. Filtern Sie die Liposomen nacheinander durch einen 0,47-Mikron-Spritzenfilter und einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Filtern Sie die Liposomen mithilfe eines kleinen Extruders durch eine 50 Nanometer-Membran, um eine homogene Population einkammeriger Liposomenvesikel zu erzeugen.

Überführen Sie die Liposomen in ein Eppendorf-Gefäß und stellen Sie es auf Eis. Bereiten Sie die Liposomen-RNA-ITSN-Komplexe im Verhältnis von acht Mol Liposomen zu zwei Mikrogramm RNA vor. In diesem Beispiel 50 Mikroliter I-A-I-T-S-N.

Aus einer 50 Mikromolar-Stammlösung werden 100 Mikroliter frisch hergestellter Liposomen unter Verwendung einer A-R-N-A-D-N-A-freien EOR-Röhre zugegeben. Die Mischung bis zur Injektion in die Mäuse auf Eis lagern. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse sind etwa vier bis sechs Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm.

Überprüfen Sie durch einen Zehenzwicktest, ob das Tier vor der Injektion vollständig anästhesiert ist. Verwenden Sie Ein-Milliliter-Tuberkulinspritzen, bei denen die Nadel mit einer Hand befestigt wird. Halten Sie die Ohren der Maus fest und drehen Sie die Maus auf die Seite, um den inneren Augenwinkel freizulegen.

Das Ziel befindet sich medial zu den PIKA-Semi-Lunars; vermeiden Sie es, den Augapfel zu berühren. Nähern Sie sich mit der geladenen Spritze im Winkel von 45 Grad in allen drei Achsen der Tränendrüse des Auges. Spritzen Sie die Mischung langsam ein, bringen Sie die Maus danach in ihren Käfig zurück und lassen Sie sie auf der injizierten Seite auskurieren.

Nach oben. Die Maus wird alle 72 Stunden über einen Zeitraum von 24 Tagen hinweg mit SIR-NA behandelt, die gezielt gegen das ITSN1-Gen gerichtet ist. Um diesen Vorgang zu beginnen, überprüfen Sie, ob die Maus vollständig anästhesiert ist, indem Sie das Fehlen des Withdrawal-Reflexes feststellen. Beginnen Sie mit einer Laparotomie und entfernen Sie das Zwerchfell.

Führen Sie dann eine Thorakotomie durch, um die Lunge und das Herz freizulegen. Entfernen Sie den Thymus mithilfe eines StereoZoom-Mikroskops, um eine höhere Genauigkeit zu erzielen. Katheterisieren Sie die Lungenarterie.

Führen Sie anschließend eine Tracheotomie durch und intubieren Sie die Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Beatmungsgerät auf eine Frequenz von 150 Zügen pro Minute und ein Schlagvolumen von 150 Mikrolitern ein. Als Ausfluss öffnen Sie den linken Vorhof mithilfe einer peristaltischen Pumpe, die auf 1,5 Milliliter pro Minute eingestellt ist, und Hank's Lösung, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde.

Spülen Sie das Mauslungen-Gefäßsystem fünf Minuten lang blutfrei, gefolgt von einer 10-minütigen Perfusionsgabe des Tracers. Nachdem der ungebundene Tracer ausgespült wurde, führen Sie die In-situ-Fixierung der Lungen mittels 10-minütiger Perfusionsgabe von 4 % Formaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 1 % Tanninsäure durch. Sammeln Sie die Lungen ein und entfernen Sie überschüssiges Gewebe.

Schneiden Sie die Lungen in kleine Stücke und überführen Sie sie in ein beschriftetes Szintillationsfläschchen, das zwei Milliliter einer Fixiermittel-Mischung enthält. Um die Lungenprobe für die Elektronenmikroskopie vorzubereiten, waschen Sie die Lungenstücke zunächst kurz dreimal in 0,1 molarer Natrium-Cate-Pufferlösung.

Als Nächstes fixieren Sie die Proben in 4% Aldehyd 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur, nachfixieren Sie mit 1% Osmiumtetroxid für eine Stunde im Dunkeln im Abzug auf Eis nach einmaligem Spülen mit Cale­n­ber­ger Puffer. Inkubieren Sie die Proben im Cale­n­ber­ger Puffer für zwei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur. Spülen Sie einmal mit 50% Ethanol und dehydrieren Sie anschließend mit einer abgestuften Reihe von Ethanol.

70 % Ethanol für fünf Minuten, 95 % Ethanol für fünf Minuten und anschließend zweimal in 100 % Ethanol je 15 Minuten. Danach auf 100 % Propylenoxid umstellen. Zwei Inkubationen zu je 15 Minuten.

Entfernen Sie das Propylenoxid und geben Sie eine Mischung aus 50 % Propylenoxid und 50 % Epon hinzu. Inkubieren Sie über Nacht unter Drehung am Rotationsgerät bei Raumtemperatur. Am folgenden Morgen entfernen Sie die Mischung und geben frisches Epon hinzu. Inkubieren Sie für mindestens vier bis fünf Stunden am Rotationsgerät.

Fügen Sie ausgewählte Proben in doppelt konische Formen ein, die zu etwa der Hälfte mit frischem 100% Epon acht 12 gefüllt sind. Platzieren Sie sie an den Rändern, stellen Sie die Formen in einen Inkubator mit 60 Grad Celsius und lassen Sie sie 48 bis 72 Stunden aushärten. Eine chronische Hemmung der Expression von ITSN eins s über 21 aufeinanderfolgende Tage durch wiederholte Applikation von ITSN eins s siRNA-Liposomen-Komplexen führt zu signifikant niedrigeren Konzentrationen des ITSN eins-Proteins in den Lungen von Mäusen, wie es in diesen repräsentativen Ergebnissen gezeigt wird. Lysate aus der Lunge einer unbehandelten Kontrollgruppe und behandelten Mäusen wurden zu mehreren Zeitpunkten nach der siRNA-Applikation, wie angegeben, mit Antikörpern gegen ITSN eins und Actin geblottet.

Die dichtometrische Analyse repräsentativer hochbelichteter CL-Filme und die quantitative R-T-P-C-R von I TSN one s mRNA bestätigen weiterhin, dass die Behandlung mit I TSN one s siRNA-Liposomenkomplexen die I TSN one s-Proteinexpression in der Mauslunge effizient herunterreguliert. Die Abnahme der Intersectin-1-Spiegel führt zu einer defizienten Endozytose und einer Störung des endothelialen Transports, der interendothelialen Barriere sowie zu Lungenödemen. Diese repräsentativen Elektronenmikroskopieaufnahmen von Lungenmaterial zeigen offene interendotheliale Junctions (IJs), die über ihre gesamte Länge hinweg mit acht Nanometer großen Gold-Albumin-Partikeln markiert sind.

Panel A eins ist eine Vergrößerung von Panel A, die Pfeilspitzen zeigen drei bis vier Gold-Albumin-Partikel, die nahe beieinander in derselben Ebene liegen. Dies weist auf eine weite Öffnung des IEJ hin. Goldpartikel sind außerdem mit dem abluminalen Austritt der IJs assoziiert, wie durch die Pfeile in den Panels A eins und B angezeigt. Beachten Sie auch die begrenzte Anzahl an CVE A und die Dilatation des perikapillären Raums, gekennzeichnet durch das Sternchen im Panel, eine akute Downregulation der Expression von Intersectin 1, die alternative Transportwege hochreguliert, um eine defiziente Endozytose auszugleichen.

Diese EM-Aufnahmen zeigen membranöse Ringe in den Feldern A und A', pleomorphe Tubuli im Feld B sowie vergrößerte Endosomen, die mit typischen cve LA fusioniert sind, im Feld C, die aktiv am Aufnahme- und Transportvorgang von Goldalbumin beteiligt sind. Ebenfalls beobachtet werden eine starke Erweiterung des perivaskulären Raums und eine eiweißreiche Ödembildung. Eine verlängerte Hemmung der Intersectin-1-Expression über 24 Tage verringert das Lungenödem bei Mäusen, indem die Integrität der interendothelialen Barriere teilweise wiederhergestellt wird.

EM-morphologische Untersuchungen zeigten, dass der acht Nanometer große Gold-Albumin-Tracer zu diesem Zeitpunkt die IEJ nicht durchdringen konnte und stattdessen Filtrationsrückstände im luminalen Eingang der Verbindung bildete, wie durch den Pfeil angezeigt. Die perivaskulären Räume oder PVS wiesen jedoch eine gewisse Dilatation und leichte Ödeme auf, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen für Partikel dieser Größe undurchlässig sind, aber dennoch lecken multivesikuläre Körper oder MVB in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran, wobei einige ihrer inneren kleinen Vesikel durch acht Nanometer große Gold-Albumin-Partikel markiert sind. Diese Tabelle zeigt die Anzahl endozytotischer transzytotischer Strukturen in der Lungendothelzelle von Kontroll- und defizienten Mäusen.

Eine bedeutende Beobachtung ist die Abnahme der Kalvi-Zahl im endothelialen Lungengewebe von ITSN1-defizienten Mäusen. Eine chronische Hemmung der Expression von Intersectin 1 führte zur Aktivierung alternativer endozytotischer Signalwege und verursachte eine teilweise Verringerung der Anzahl membranöser Ringe oder Tubuli, die mit Gold-Albumin-Partikeln markiert waren. In den Lungengefäßen von Mäusen mit chronischer ITS1-Defizienz war die Zahl zudem im Vergleich zu Kontrollen um das 14-Fache erhöht.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie beispielsweise die Anwendung von Maus-Lungen-Lysaten durchgeführt werden, um den transendothelialen Transport verschiedener hnic-Tracer quantitativ zu bestimmen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Komplexe aus onischen Liposomen und SRNA gezielt in das Lungendothel der Maus abgeben kann, um das Protein der gewünschten Zielstruktur herunterzuregulieren und dessen Funktion zu bewerten.