Name: Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Erfahren Sie die langfristige Gen-Silencing-Methode für ITSN-1s in Mäusen mittels kationischer Liposomen und retroorbitaler Injektion. Diese Technik ermöglicht sichere und effiziente Knockdown-Studien in der Lungenendothelforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grants R01HL089462 SP unterstützt.

1. Kationische Liposomen Vorbereitung <ol><li> Autoklav eine saubere Rundkolben für lipososmes Zubereitung verwendet werden. </li><li> Bereiten Stammlösungen: <ol class="lalpha"><li> - Man löst 200 mg Dimethyl-dioctadecyl Ammoniumbromid (DOAB) in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Lösen Sie 200 mg Cholesterin in 10 ml Chloroform mit einer kleinen Glasflasche. </li><li> - Vorbereitung und Autoklaven auf 5% Glucose in 100 ml RNA / DNA-ase kostenlos destilliertem Wasser zu sterilisieren. </li></ol></li><li> Spülen Sie den Rundkolben mit Chloroform. In 5-10 ml in den Kolben, Wirbel, und lassen Sie es sich für ein paar Minuten. Halten Sie den Kolben mit Aluminiumfolie jederzeit gesichert. Leeren Sie das Chloroform aus dem Kolben. </li><li> Herstellung von Liposomen: <ol class="lalpha"><li> - In 315 ul DOAB Stammlösung der Rundkolben. </li><li> - In 200 ul Cholesterin stock Lösung in den Kolben. </li><li> - Fügen Sie 9,5 ml Chloroform in den Kolben einnd mischen durch schwenken. </li></ol></li><li> Stellen Sie den Rotationsverdampfer bei 37 ° C, 100 Umdrehungen pro Minute (rpm) oder mehr (100-120 rpm). Der Rotationsverdampfer sollte zu einem Wasserstrahlvakuum Steuerung mit einem Saugrohr richtig befestigt angeschlossen werden. </li><li> Schließen Sie das Argon-Gas-Tank und die Rotavapors. </li><li> Bringen Sie den Kolben an die Rotavapors und passen Sie die optimalen Einstellungen vor dem Absenken es im Wasserbad. Öffnen Sie das erste Ventil für den Argon vollständig durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn. Immer öffnen und schließen dieses Ventil zuerst. Das zweite Ventil steuert den Argondruck Einblasen in den Kolben gegeben. Der Druck sollte immer sanft. </li><li> Senken Sie den Rotationsverdampfer im Wasserbad, genug für den Kolben, um das Wasser vollständig untergetaucht, ohne zu berühren, und schalten Sie die Geschwindigkeit. </li><li> Warten Sie, bis alle Chloroform verdunstet, ca. 10 min. Dann die Maschine stoppen. </li><li> Schalten Sie die Geschwindigkeit und die Rotavapors Argontank Ventile. Jetzt wird der Kolben entfernt werden sollte. </li><li> 2 ml 5% Glucose zu the Kolben zu lösen die Lipide. </li><li> Rubbeln Sie an der Unterseite des Kolbens gründlich mit 1 ml Pipettenspitze alle Lipide aufzulösen. Nach Kratzen, entfernen Sie alle verbleibenden Lipid aus der 1 ml-Spitze in den Kolben, wenn nötig, mit einer zweiten Spitze. </li><li> Inkubation der erhaltenen Lösung in 42 ° C Wasserbad während langsam Vortexen (15 rpm) die Flasche. </li><li> Füllen Sie das Ultraschallgerät Bottich mit kaltem Wasser. Beschallen die Lösung für mindestens 20-30 min mit dem Kolben gehalten und der Boden gerade noch das Wasser zu berühren. </li><li> Der Kolben in der Rotavapors die Wasserbad für 20 min bei 42 ° C, bei Drehzahl Null mit rundem Boden in Wasser getaucht, diesmal. </li><li> Filtern Sie die Liposomen durch einen 0,47 Mikron und anschließend 0,22-Mikron-Filter Spritze. </li><li> Mit einem kleinen Extruder, filtern die Liposomen durch einen 50 nm Membran, um eine homogene Population von unilamellaren Liposomen Bläschen zu erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Liposomen zu einem Eppendorf-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. </li></ol><html> 2. Bereiten Sie die Liposomen: siRNA-ITSN-1-Komplexe <ol><li> Resuspendieren Sie das On-Target-Maus siRNA ITSN in siRNA-Puffer mit 20 mM HEPES und 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4, auf eine Endkonzentration von 2 pg / pl. Halten Sie es vor dem Mischen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Liposomen: siRNA ITSN Komplexe in einem Verhältnis von 8 nmol Liposomen: 2 ug RNA (oder 400 nmol Liposomen: 100 ug siRNA ITSN). In der vorliegenden Studie haben wir 50 ul siRNA ITSN aus der Stammlösung (50 &amp;mgr; M) zu 100 ul frisch zubereitet Liposomen mit einem RNA / DNA-ase kostenlos Eppendorf-Röhrchen. Beachten Sie, dass die Konzentration von siRNA ITSN sehr wichtig ist, weil ein Maximum von 150 ul Mischung bilateral und retroorbitalen injizierten in der Maus sein kann, auf einmal. </li><li> Halten Sie die Mischung auf Eis während der Wartezeit, um die Mäuse zu injizieren. </li></ol> 3. Maus Retro-Orbital-Injektion (Internal Winkel der Augenhöhle) jove_content &quot;&gt; Alle Mausexperimenten genehmigt wurden und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Rush University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss durchgeführt. <ol><li> Anesthetize der Maus durch intraperitoneale Injektion einer 50 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg / kg Körpergewicht Xylazin (im Handel erhältlich Mischung). Je nach Gewicht des Tieres und das Alter, passen Sie die Lautstärke Anästhetika und Konzentration. Die Mäuse in der Studie verwendeten Mäuse sind CD1 männliche Mäuse, 6-8 Wochen alt und wiegen rund 25 Gramm. Die Spritzen sind Tuberkulin 1 ml Typ mit der Nadel. </li><li> Halten Maus Ohren mit einer Hand und drehen Sie die Maus nach unten auf einer Seite, um die interne Augenwinkel freizulegen. Richten medial der Plica semilunaris; berühren den Augapfel. </li><li> Nähern der Tränenflüssigkeit des Auges caruncle Halten der Spritze, die das Gemisch in einem 45 Grad Winkel in allen drei Achsen. </li><li> Langsam spritzen die Mischung und lassen Sie die Maus, um mit dem injizierten Seite erholen sich. Wenn eine große FlüssigkeitTröpfchen bildet sich an der Nadeleinführung Platz einfahren Nadel-, Saug-back der Tropfen in die Spritze und versuchen Sie es erneut. Wiederholte Injektionen werden am besten durch abwechselnd die Augen getan, um eine perfekte Erholung zu ermöglichen. Wenn Sie unsicher sind, kann diese Technik durch die Injektion von blauem Farbstoff (50 ul, 0,5% Kristallviolett in Methanol) und das Aussetzen der Maus Lunge, um den blauen Gefäßsystem beobachten überprüft werden. </li><li> Die Mäuse wurden in dieser Studie injiziert wird jeden 3. Tag für 3 Wochen ohne Todesfälle oder unerwünschte Nebenwirkungen. </li></ol> 4. Maus Lung Perfusion und Tissue Collection für biochemische Studien <ol start="0"><li> Stellen Sie die Schlauchpumpe auf 1,5 ml / min laufen. </li><li> Bereiten Sie die Einstellung: Ventilator, OP-Tisch, Instrumente, sterile Wattestäbchen, Q-Tips, Strings, Bechern, destilliertes Wasser, Hanks balanced salt, Tracer. </li><li> Anesthetize die Maus durch intraperitoneale Injektion des Narkosemittels Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin). </li&gt; <li> An der Höhe des Halses, entfernen Sie die Speicheldrüsen und setzen die Luftröhre. </li><li> Beginnen Sie mit Bauchschnitt, Verbrauchssteuern das Zwerchfell, und folgen mit Thorakotomie, Aussetzen der Lunge und das Herz. </li><li> Entfernen Sie die Thymus. </li><li> Mit der Lichtmikroskopie für eine bessere Genauigkeit, catheterize die Lungenarterie. </li><li> Haben Tracheotomie und Intubation mit der Maus über das Tracheostoma. Stellen Sie den Ventilator zu einer Geschwindigkeit von 150 Hüben / min und Hubvolumen von 150 ul. </li><li> Als Abgang, öffnen Sie die linke Atrium. </li><li> Perfundieren die Maus Lungengefäße frei von Blut für 5 min, mit der Schlauchpumpe und Hank-Lösung erwärmt auf 37 ° C. </li><li> Perfundieren den Tracer (8 nm Gold-Albumin 16) für weitere 10 min bei der gleichen Fließgeschwindigkeit. </li><li> Spülen Sie die ungebundenen Tracer von 5 min Lungenperfusion mit Hanks-Lösung. </li><li> Folgen Sie mit in situ Fixierung der Lunge, die durch 10 min Perfusion von 4% (wt / vol) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 1% Gerbsäure in 0,1 PIPESPuffer, pH 7,2. </li><li> Sammeln Sie die Lungen, entfernen Sie den übermäßigen Gewebe, schneiden kleine Blöcke (3/3 mm), und legen Sie sie in einem markierten Szintillationsfläschchen mit 2 ml Fixativ Mischung. </li></ol> Die Mäuse erlischt vollständig betäubt während des Verfahrens. 5. Maus Lung Gewebeeinbettsystem für EM <ol><li> Bereiten Stammlösungen: 1% OsO 4 Palade, Acetat veronal und Kellenberger Puffer. <ol class="lalpha"><li> - 1% OsO 4 Palade-Puffer enthält: 1 ml Acetat veronal Lager, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml 0,1 N Salzsäure und destilliertem Wasser bis zu 5 ml Endvolumen. </li><li> - Acetate veronal Lager wird durch Auflösen von 1,15 g Natriumacetat und 2,94 g andydrous Barbital in 100 ml destilliertem Wasser erhalten. </li><li> Kellenberger-Lösung enthält 2 ml Acetat veronal Lager, 2,8 ml 0,1 N Salzsäure, 0,05 g Uranylacetat und 5,1 mldestilliertes Wasser, pH = 6. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Lunge Blöcke in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH = 7,4, 3 mal kurz. </li><li> Befestigen der Proben in die 4% (w / v) Formaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 PIPES-Puffer, pH 7,2, für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Mit 1% Palade-Osmium Post-fix für 1 Stunde in der Motorhaube, auf Eis, in der Dunkelheit. </li><li> Spülen Sie einmal mit Puffer Kellenberger. </li><li> Inkubieren Proben in Kellenberger Puffer für 2 h bis über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen einmal in 50% Ethanol. </li><li> Entwässern mit abgestuften Reihe von Ethanol, 5 min / Stück: 70%, 95%, dann 2 x 15 min 100% Ethanol. </li><li> Wechseln Sie zu 100% Propylenoxid, 2 x 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Propylenoxid und dann eine Mischung aus 50% Propylenoxid und 50% Epon 812, über Nacht inkubieren, Drehen eines Rades, bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Mischung und fügen Sie frisches Epon 812, wenigstens für 4-5 Stunden auf dem Rad. </li><li> Mit verdoppelt sich verjüngenden Formen gefülltauf halbem Weg mit frischen 100% Epon 812, fügen ausgewählten Proben und legen Sie sie an den Kanten. </li><li> Bewegen Sie die Formen in den Inkubator auf 60 ° C und lassen Sie sie für 48-72 Stunden aushärten. </li><li> Wenn polymerisiert, senden Sie die Blöcke, dünn zu sein (60-70 nm dick) geschnitten. </li></ol>

<ol><li>Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin-1s+regulates+the+mitochondrial+apoptotic+pathway+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells.</a> J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).</li>
<li>Uddin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+used+in+non-viral+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems.</a> Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+lipid+composition+on+the+thermotropic+behavior+and+size+distribution+of+mixed+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes.</a> J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).</li>
<li>Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+caveolae+function+and+upregulation+of+alternative+endocytic+pathways+induced+by+experimental+modulation+of+intersectin-1s+expression+in+mouse+lung+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Res.+Int.%22%5BJournal%5D)">Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium.</a> Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).</li>
<li>Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+in+vivo+delivery+of+siRNAs%3A+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress.</a> BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).</li>
<li>Caracciolo, G., Amenitsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome%2FDNA+complexes%3A+from+structure+to+interactions+with+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes.</a> Eur. Biophys. J. , (2012).</li>
<li>Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposomes+as+adjuvants+for+influenza+hemagglutinin%3A+more+than+charge+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).</li>
<li>Rai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+MicroRNA-7-expressing+plasmid+overcomes+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor-resistance+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells.</a> Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).</li>
<li>McLean, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+endothelial+cell+uptake+of+cationic+liposome-DNA+complexes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice.</a> Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).</li>
<li>Soutschek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+silencing+of+an+endogenous+gene+by+systemic+administration+of+modified+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.</a> Nature. (432), 173-178 (2004).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+enhance+bioremediation+of+oil-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil.</a> J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).</li>
<li>Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal%2C+nanoparticle%2C+and+conjugated+formulations+of+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents.</a> Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).</li>
<li>Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacokinetics%2C+tissue+distribution%2C+and+therapeutic+effectiveness+of+cisplatin+encapsulated+in+long-circulating%2C+pegylated+liposomes+%28SPI-077%29+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice.</a> Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).</li>
<li>Martino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+siRNA+delivery+by+the+cationic+liposome+DOTAP+in+human+hematopoietic+stem+cells+differentiating+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells.</a> J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delivery+system+targeting+bone+formation+surfaces+to+facilitate+RNAi-based+anabolic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.</a> Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).</li>
<li>Predescu, D., Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmalemmal+vesicles+represent+the+large+pore+system+of+continuous+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium.</a> Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).</li>
<li>Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dap160%2Fintersectin+acts+as+a+stabilizing+scaffold+required+for+synaptic+development+and+vesicle+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis.</a> Neuron. (43), 193-205 (2004).</li>
<li>Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Basierend auf früheren Studien von anderen 9 und uns 1, 18 haben wir diese Methode für die langfristige knock down von ITSN-1s in vivo durch wiederholte intravenöse Verabreichung (alle 72 h für 24 aufeinanderfolgende Tage) spezifischer siRNA / Liposom-Komplexen veröffentlicht. Dieser experimentelle Ansatz ist effizient, sicher und immer wieder verwendet werden und es kann leicht erweitert werden, um die Beteiligung eines Gens jedes Protein von Interesse in der Lunge und pulmonaler Endothel...

Nackte siRNA kann nicht durch die Zellmembran, das negativ geladen ist, und es ist leicht durch Enzyme abgebaut in Blut, Gewebe und Zellen. Selbst mit kurzem strukturelle Veränderungen, um die Stabilität zu verbessern, ist siRNA Akkumulation am Zielort nach Verabreichung äußerst gering und erfordert eine effiziente intrazelluläre Fahrzeug 5. Kationische Liposomen erwies sich als sicher Nukleinsäuren Träger mit dem Potenzial, große Stücke von DNA / RNA in Zellen übertragen durch Verkapselung und Schutz der Nukleinsäuren vor enzymatischem Abbau 6. Auch kationische Liposomen spontan interagieren mit DNA / RNA, damit die Förderung Gentransfer in die Zellen 2. In jüngerer Zeit Liposomen wurden angewendet, um Impfstoffe und niedrigem Molekulargewicht Drogen 7 liefern. Liposomal Lieferung microRNA-7-exprimierenden Plasmid überwindet epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz in Lungenkrebszellen 8. Bei der Ausrichtung dervaskulären Endothel ist die intravenöse Verabreichung notwendig, weil die Komplexe unwahrscheinlich, dass die endotheliale Schranke und extravasieren in dem Interstitium 9 sind. Im Vergleich zu anderen Organen, ECS vom Mikrovaskulatur der Lunge haben die größte Aufnahme und eifrig verinnerlichen kationische Liposomen und DNA / RNA-Komplexen, die Lymphknoten und Peyer-Plaques 9 gefolgt. Intravenöse Lieferung in Tiermodellen der siRNA über retroorbitalen oder Schwanzvene Injektionen ist erwiesen, auch in hohen Konzentrationen, wie 50 mg / kg 10 harmlos. In der Literatur die Zusammensetzung Liposomen, unterscheidet, basierend auf der Formulierung, Lipide und deren äquimolaren Verhältnis 11, 12. Es gibt eine breite Palette von möglichen Anwendungen, die kationische Liposomen für den Gentransfer in vivo, ob Targeting down-regulation/over-expression der Proteine, die Lieferung von Impfstoffen oder Anti-Tumor-Therapien 13-15. Wichtig zu merkenist, dass die Effizienz der DNA / RNA-Zellmembran Wechselwirkung durch die Form Kopplung zwischen erzeugten Komplexe und Membranlipiden geregelt wird. Dies legt nahe, dass Anpassung der Lipide Zusammensetzung auf die gezielte Zellmembran Profilen von Vorteil sein kann und zu einer hohen Transfektionseffizienz in einem bestimmten Zelltyp 6.

<table><tbody><tr><td>Dimethyldioctadecyl-Ammoniumbromid (DOAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2779</td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast-Stabilisator (Mini-Extruder)</td><td>Avestin Inc.</td><td>LF-STB</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membran, 19 mm Durchmesser, 50 nm Poren</td><td>Avestin Inc.</td><td>LFM-50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4432-04</td><td></td></tr><tr><td>Hank's ausgewogene Salze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td></td></tr><tr><td>Rundkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>FHB-275-030X</td><td></td></tr><tr><td>Maus siRNAITSN - on target </td><td>Dharmacon/ ThermoScientific</td><td>J-046912-11</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec</td><td>REGLO-CDF digital mit RHOO Pumpenkopf</td><td></td></tr><tr><td>Beatmungsgerät</td><td>Hugo Sachs Electronik</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0500</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>EM Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Epon812</td><td>EM Sciences</td> Vom <td>Hersteller abgekündigt</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>EM Sciences</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Einbettungsformen</td><td>EM Sciences</td><td>69923-05</td><td></td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>EM Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>8 nm Gold-Albumin-Tracer</td><td></td><td>Im Labor hergestellt wie in16<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Ausgestattet mit 2 Avestin 1 ml gasdichte Spritzen (Kat. # LF-1)</td></tr><tr><td colspan="4">Pyrex, 100 ml</td></tr><tr><td colspan="4">Modifizierte siRNA, in vivo<</td></tr><tr>td colspan="4">Teil von IDEX corp.</td></tr><tr><td colspan="4">D-79232 März, Deutschland</td></tr><tr><td colspan="4">Ersetzt durch Embed812, Kat. # 14120</td></tr></tbody></table>

langfristige silencing von intersectin-1s in mauslungen von wiederkehrenden lieferung eines spezifischen sirna durch kationische liposomen. auswertung der knockdown effects electron microscopy

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Frühere Studien zeigten, dass Knockdown von ITSN-1s (KD ITSN), ein Protein, das in der Regulierung endozytischen Lunge vaskulären Permeabilität und Endothelzellen (ECs) Überleben, induzierte Apoptose, ein wesentliches Hindernis bei der Entwicklung eines Zellkultur-System mit längerer ITSN-1s beteiligt Hemmung 1. Mit kationische Liposomen als Träger, erkundeten wir die Silencing ITSN-1s-Gen in der Maus Lunge durch systemische Verabreichung von siRNA Targeting ITSN-1-Gen (siRNA ITSN). Kationische Liposomen bieten mehrere Vorteile für siRNA Lieferung: Safe mit wiederholter Gabe, nicht immunogen, ungiftig und einfach zu 2 zu erzeugen. Liposomen Leistung und biologische Aktivität von ihrer Größe, Ladung, Lipid-Zusammensetzung, Stabilität, Dosis und Art der Verabreichung 3 Hier eine effiziente und spezifische KD ITSN in Mauslungen wurde unter Verwendung eines Cholesterin-und Dimethyl Dioctadecyl ammoniumbromid Kombination ab. Intravenöse Verabreichungvon siRNA ITSN / kationische Liposomen-Komplexe vorübergehend abgerissen ITSN-1s Protein und mRNA in Mauslungen am Tag 3, die nach weiteren 3 Tagen wiedergefunden. Unter Ausnutzung der kationische Liposomen als wiederholbare sichere Fluggesellschaft, erweitert die Studie für 24 Tage. So wurde retroorbitalen Behandlung mit frisch erzeugten Komplexe verabreicht jeden 3. Tag, induzieren anhaltende KD ITSN während der Studie 4. Maus-Gewebe an mehreren Zeitpunkten nach der siRNA ITSN gesammelt wurden elektronenmikroskopische (EM)-Analysen unterzogen, um die Wirkung einer chronischen KD ITSN auszuwerten, Lunge Endothel. Hochauflösende EM Bildgebung erlaubt es uns, die morphologischen Veränderungen durch KDITSN in der Lunge Gefäßsystem verursacht bewerten (dh Störung der endothelialen Barriere, verringerte Anzahl von Caveolae und Hochregulation alternative Transportwege), Eigenschaften nicht nachweisbar durch Lichtmikroskopie. Insgesamt diese Erkenntnisse etabliert eine wichtigewichtige Rolle von ITSN-1s in der ECs Funktion und Lunge Homöostase, während, die die Wirksamkeit von siRNA-Liposomen Lieferung in vivo.

ITSN-1s Protein-und mRNA-Spiegel wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der siRNA ITSN Lieferung durch Western-Blot-und konventionellen und quantitative PCR, wie in 4 überwacht. ITSN-1s Protein-und mRNA-Level in siRNA-behandelten Maus ITSN Lungen waren etwa 75% niedriger unter Bezugnahme auf die Kontrollen während der kontinuierlichen Knockdown von ITSN-1s für 21 Tage. Ohne ITSN-1s, Dynamin-2 ist ein wichtiger Interaktionspartner von ITSN-1s und wichtiger Akteur in Ablösung von Caveola...

Wiederholte retroorbitalen Injektionen kationische liposomes/siRNA/ITSN-1s Komplexe in Mäusen, alle 72 Stunden für 24 Tage, effizient die siRNA-Duplex zum Mauslunge Mikrovaskulatur Reduzierung ITSN-1s mRNA und Protein-Expression von 75%. Diese Technik ist in hohem Maße reproduzierbar in einem Tiermodell, hat keine Nebenwirkungen und Todesfälle verhindert.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen einer langfristigen Herunterregulation der Expression von Intersectin 1S auf Struktur und Funktion der Mauslunge zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst spezifische INA-Duplex-Liposomenkomplexe hergestellt werden, um die Lungengefäßstruktur der Maus gezielt anzusteuern. In einem zweiten Schritt werden die INA-Liposomenkomplexe retroorbital injiziert, wobei die Applikation alle 72 Stunden über einen Zeitraum von 24 Tagen hinweg wiederholt wird, um eine effiziente Hemmung der Expression von Intersectin 1S zu erzielen.Als Nächstes wird das Lungen­gewebe injizierter Mäuse für bio­chemische Analysen und EM-Untersuchungen entnommen, um die Expression des intersect in one-Proteins und dessen mRNA-Spiegel zu bewerten sowie umfangreiche morphologische Analysen der Lunge durchzuführen. Die mittels Western Blot von Lysaten der Lunge unter Verwendung spezifischer intersect in one-Antikörper und mittels Q-R-T-P-C-R-Analysen erhaltenen Ergebnisse zeigen einen spezifischen und effizienten Knockdown von intersect in one über 24 aufeinanderfolgende Tage. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Ver

long-term-silencing-intersectin-1s-mouse-lungs-repeated-delivery

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

Dieser Bericht beschreibt eine einfache und schnelle Technik der intrathekalen Punktion für eine lokalisierte Transfektion von siRNA in der Lenden-Wirbelsäule in der Maus unter Kurznarkose dauerhafte Licht.

In vivo siRNA-Transfektion und Gene Knockdown im Rückenmark über Rapid-Nichtinvasive Lendenwirbel intrathekale Injektionen in Mäuse

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

MicroRNAs spielen eine entscheidende Rolle im Gehirn und sind potenzielle Ziele für die Modellierung der Neurodegeneration. Die Störung des miRNA-Spiegels ist jedoch aufgrund der kurzen Länge der miRNA und der Unzugänglichkeit des Hirngewebes eine Herausforderung. Dieses Video stellt eine Methode für das Antagomir-Design und die gehirnspezifische Verabreichung unter Verwendung eines Neuropeptids bei Mäusen vor.

Eine einfache Alternative zur stereotaktische Injektion für Hirnspezifische Knockdown von miRNA

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann.  Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Gewebe-spezifische MicroRNA-Hemmung ist eine Technologie, die im Feld MicroRNA unterentwickelt ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erfolgreich die MiR-181 MicroRNA-Familie in Myoblast Zellen aus dem Herzen zu hemmen. Nanovector-Technologie wird verwendet, um eine MicroRNA Schwamm zu liefern, die erhebliche in Vivo Cardio-spezifische MiR-181 Familie Hemmung zeigt.

In Vivo Nanovector Lieferung von einem Herz-spezifische MicroRNA-Schwamm

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Wir bieten ein Protokoll, um Gene, die extrazelluläre Matrixproteine (ECM) in C2C12-Myoblasten kodieren, mit Small-Hairpin (sh) RNA zu fallig zu senken. Als Beispiel für ADAMTSL2 beschreiben wir die Methoden zur Validierung der Knockdown-Effizienz auf mRNA-, Protein- und Zellebene während der Myotube-Differenzierung von C2C12.

Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

Erfahren Sie die langfristige Gen-Silencing-Methode für ITSN-1s in Mäusen mittels kationischer Liposomen und retroorbitaler Injektion. Diese Technik ermöglicht sichere und effiziente Knockdown-Studien in der Lungenendothelforschung.

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

Langfristige Silencing von Intersectin-1s in Mauslungen von wiederkehrenden Lieferung eines spezifischen siRNA durch kationische Liposomen. Auswertung der Knockdown Effects Electron Microscopy

Weitere Videos entdecken