GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein hochgereinigtes Protein in voller Länge von Interesse zu erhalten. Dies wird durch die Herstellung eines rekombinanten Bao-Virus erreicht, das zur Infektion von SF-Neun-Insektenzellen verwendet wird, um eine hochexprimierte und lösliche zwei-markierte Version des interessierenden Proteins zu erhalten. Anschließend wird eine zweistufige Affinitätsreinigung durchgeführt, die durch die Aufreinigung von Glutathion, einem mit Seros markierten Protein, gekennzeichnet ist, gefolgt von einer Metallaffinitätschromatographie.

Das Ergebnis der Reinigung ist ein hochreines Histidin-markiertes Protein. Anschließend werden aufgereinigte Proteinproben dialysiert, um niedrige Salzkonzentrationen im Lagerpuffer zu gewährleisten. Es werden Ergebnisse erhalten, die die Expressionslöslichkeit, Menge und Qualität des Proteins basierend auf der Ganzproteinfärbung eines SDS-Seitengels zeigen.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir Schwierigkeiten hatten, große und instabile Proteine wie PAL B zwei und BOC zwei zu reinigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der einstufigen Affinitätsreinigung besteht darin, dass in unserem zweistufigen Affinitätsreinigungsprotokoll das erhaltene Protein hochrein und im Allgemeinen frei von Abbauprodukten ist. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinbiologie zu beantworten, wie z. B. die biochemischen Funktionen von gereinigten rekombinanten Proteinen.

Dieses Protokoll beginnt mit der Produktion des rekombinanten Bao-Virus, gefolgt von der Auswahl des effizientesten BA-Virus, wie im Textprotokoll für die Infektion beschrieben. Bereiten Sie ein Spinnerkulturgefäß vor, das zwischen 0,75 und 1,0 mal 10 to the six SF nine Zellen in 500 Millilitern Medium mit einem Verhältnis von eins zu 150 zwischen Virus und Medium enthält. Platzieren Sie den Spinner unter einer Zellkulturhaube, infizieren Sie die Zellen, indem Sie das erforderliche Volumen der Baula-Virussuspension durch einen Arm des Spinners in die Zellsuspension geben.

Lassen Sie die infizierten Zellen in Suspension bei 27 Grad Celsius wachsen und ernten Sie die Zellen, wenn die maximale Proteinexpression erreicht ist, die bei der Auswahl des effizientesten Makulavirus bestimmt wird. Nach der Ernte von Zellen lyce SF neun Zellen, die das Protein von Interesse in etwa 20 Millilitern GST-Bindungspuffer exprimieren, ergänzt mit Proteaseinhibitoren in einem Eiswasserbad. Die Lösung 20 Mal mit einem Down-Homogenisator herunterfahren, dann drei 32. Zyklen beschallen, bevor Sie anschließend erneut 20 Mal tanzen, das Zelllysat bei 18.000 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand inkubieren lassen, das lösliche Zelllysat mit einem Milliliter vorgewaschener GST-Kügelchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter sanfter Drehung inkubieren.

Die Inkubationszeit sollte entsprechend der Stabilität des Pros und der Bindungseffizienz nach der Bindung optimiert werden. Schnelles Schleudern bei 700 U/min und Entfernen von Überständen, die ungebundene Proteine enthalten. Waschen Sie die GST-gebundenen Proteine mit GST-Waschpuffer.

Wiederholen Sie diesen Vorgang nach der letzten Wäsche zweimal. So viel Überstand wie möglich entfernen. Inkubieren Sie dann die Kügelchen mit fünf Millimolaren A TP und 15 Millimolar Magnesiumchlorid in 10 Millilitern GST-Bindungspuffer für eine Stunde bei vier Grad Celsius, um eine unspezifische Bindung von Hitzeschockproteinen nach der Inkubation zu vermeiden.

Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit GST-Waschpuffer. Nach dem Zentrifugieren der GST-Kügelchen und dem Entfernen des Überstands waschen Sie die GST-Kügelchen mit P fünf Puffer. Als nächstes teilen Sie die GST-Kügelchen, Verstöße von 100 Mikrolitern, und fügen Sie vier bis acht Einheiten Präzisionsenzym hinzu, das in 100 Mikrolitern P-Fünf-Puffer verdünnt ist.

Inkubieren Sie die GST-Kügelchen mit Enzym für drei Stunden bis über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanfter Rotation. Die Inkubationszeit sollte entsprechend dem Molekulargewicht sowie der Stabilität des Proteins nach der Spaltung optimiert werden. Schnell drehen und den Überstand einsammeln.

Geben Sie 100 Mikroliter P fünf Puffer zu den Kügelchen. Dann wiederholen, drehen und übersteht die Sammlung zweimal. Ziehe alle Brüche.

Teilen Sie das EIT in drei Fraktionen zu je einem Milliliter auf und inkubieren Sie jeweils eine Stunde lang unter Rotation mit 100 Mikrolitern vorgewaschenen Talon-Metall-Affinitätsharz-Trockenkügelchen, wobei die Elution in mehrere Fraktionen aufgeteilt wird, um die Bindungs- und Wascheffizienz zu erhöhen. Anschließend waschen Sie das Harz fünf Minuten lang mit P 30 Puffer bei vier Grad Celsius bei sanfter Rotation. Nachdem Sie den Waschvorgang zweimal wiederholt haben, ziehen Sie die Kügelchen in ein einziges Röhrchen, um das gereinigte Protein zu eluieren.

Fügen Sie dem proteingebundenen Talonharz P 500 Puffer hinzu. Fügen Sie ein Puffer-zu-Wulst-Verhältnis von eins zu eins Volumen hinzu. Volumen. Inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten lang unter Rotation.

Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Jede entgangene Fraktion wird für die Lagerung des gereinigten Proteins getrennt gehalten. Dialysieren Sie das Protein zweimal eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Rühren gegen einen geeigneten Speicherpuffer.

Es ist wichtig, während der Dialyse nach einer Ausfällung des gereinigten Proteins zu suchen. Machen Sie kleine Aliquots aus dem gereinigten Protein und frieren Sie es 30 Minuten lang auf Trockeneis ein. Lagern Sie die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius und vermeiden Sie viele Auftau-Gefrierzyklen.

Analysieren Sie den Aufreinigungsprozess, indem Sie etwa 20 bis 40 Mikroliter jeder Fraktion auf ein SDS-Seitengel laden. Nach dem Ausführen der Gelfärbung mit Kumasiblau- oder Proteinfärbung zur Visualisierung wurden die löslichen und Gesamtzelllysate von SF-Neun-Zellen, die mit dem rekombinanten Valovirus REC 14 infiziert waren, oder von Scheininfizierten als Kontrolle durch Kumasi-Blau-Färbung analysiert, was eine Bestätigung der Expression des Proteins GST re 14 his während des Aufreinigungsprozesses ermöglichte. Viele Proben wurden analysiert, um die Effizienz der methodischen Analyse dieser Proben durch Kumasi Blue zu verfolgen.

Die Färbung zeigt, dass GST Rec 14 während des ersten Reinigungsschritts aufgrund der Fusion von rec 14 mit GST nach der Präzisionsspaltung mit G-S-T-G-S-T korrekt an GST-Kügelchen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 50 Kilodalton gebunden wurde, während das freie Rec 14-Hiss etwa 37 Kilodalton migriert. Während die gespaltene GST auf den GST-Perlen sichtbar ist, wurde trotz eines Teils der GST-freien REC 14, der immer noch an GST-Perlen gebunden blieb, eine bemerkenswerte Anreicherung von REC 14 Hiss erreicht. Dieser Schritt könnte verbessert werden, indem die Inkubationszeit des Proteins mit präziser Proteaseanalyse von REC 14-Hiss, das an Talon-Kügelchen gebunden ist, im Vergleich zu den Proteinen erhöht wird, die nach dem GST-Aufreinigungsschritt angedeutet wurden, und zeigt, dass ein großer Teil des REC 14-Hiss an Krallenkügelchen gebunden ist.

Nach mehreren Wäschen wurde das Rauschen von REC 14 ausgewichen und gesammelt, es wurden drei Illusionen durchgeführt. Die Analyse ergab eine hohe Reinheit von rec 14 Hiss und die größte Konzentration von rec 14 Hiss im ersten ellucianischen Vergleich der entgangenen Fraktionen mit den Krallenkügelchen nach Ellucian verdeutlicht die Effizienz der Illusion. Da wenig rec 14 Rauschen als auf Kügelchen gebunden erkannt werden kann.

Diese Proben wurden auch einer westlichen Blutanalyse mit Anti-GST- und Anti-Hiss-Antikörpern unterzogen, um REC 14 zu befolgen. Während des gesamten Verfahrens zeigt der Anti-GST-Blot, dass einige GS TRE 14 und GST allein in den genannten Proteinen aus dem GST-Reinigungsschritt vorhanden waren und dass Verunreinigungen durch den Hiss-Tag-Affinitätsreinigungsschritt entfernt wurden. Dieser Blot zeigt, dass GST durch die Präzisionsbehandlung und den Hiss-Ttag-Reinigungsschritt effizient aus re 14 entfernt wurde.

Der Anti-Hiss-Blot zielt darauf ab, re 14 zu detektieren. Dieser Blot bestätigt, dass das Rauschen von GST Rec 14 und das Rauschen von REC 14 nicht vollständig von den GST-Kügelchen gespalten und entfernt wurden. Darüber hinaus scheint sich REC 14 bei einer hohen Konzentration zu aggregieren.

Zusammenfassend zeigen die vorgestellten Ergebnisse die Wirksamkeit der GST-Hiss-Reinigung für die Reinigung von S-Palme B rec 14. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine stark verschönerte Energie wiederherstellen können. Einmal gemeistert.

Diese Technik kann 12 Stunden nach der Degeneration der löslichen Säure durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, schnell und streng bei vier Grad Celsius zu arbeiten, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Andere Methoden, wie z.B. Code-Präzipitationsassays oder Massenspektrometrie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Identifizierung von Proteinpartnern oder die posttranslationale Modifikation des interessierenden Proteins zu beantworten.

Obwohl wir diese Methode für DNA verwenden, könnten Reparaturproteine strategisch modifiziert werden, um die Funktion von Proteinen in anderen Forschungsbereichen zu untersuchen.