GST-His-Reinigung: Ein Zwei-Schritt-Affinitätsreinigung Protokoll Nachgeben in voller Länge Gereinigte Proteine

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein hochreines, vollständiges Protein von Interesse zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem ein rekombinanter Bao-Virus hergestellt wird, der verwendet wird, um SF9-Insektenzellen zu infizieren, um eine stark exprimierte und lösliche, zweifach markierte Version des Proteins von Interesse zu erhalten. Anschließend erfolgt eine zweistufige Affinitätsreinigung, die aus der Reinigung des mit Glutathion-S-Transferase markierten Proteins gefolgt von einer Metall-Affinitätschromatographie besteht.

Das Ergebnis der Reinigung ist ein hochreines, histidinmarkiertes Protein. Anschließend werden die gereinigten Proteinstichproben dialysiert, um niedrige Salzkonzentrationen im Lagerpuffer sicherzustellen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die lösliche Expression sowie Menge und Qualität des Proteins basierend auf der Gesamtproteinfärbung eines SDS-Page-Gels.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir Schwierigkeiten hatten, große und instabile Proteine wie PAL B zwei und BOC zwei zu reinigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der einkettigen Affinitätsreinigung liegt daher darin, dass das bei unserem zweistufigen Affinitätsreinigungsprotokoll erhaltene Protein hochgradig rein ist und im Allgemeinen frei von Abbauprodukten. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Proteinbiologie zu beantworten, beispielsweise die biochemischen Funktionen gereinigter rekombinanter Proteine.

Dieses Protokoll beginnt mit der Herstellung rekombinanter Bao-Viren, gefolgt von der Auswahl des effizientesten BA-Virus, wie im Textprotokoll zur Infektion beschrieben. Bereiten Sie einen Spinner-Kulturbehälter vor, der zwischen 0,75 und 1,0 × 10⁶ SF9-Zellen in 500 Milliliter Medium enthält, mit einem Verhältnis von 1:150 zwischen Virus und Medium. Stellen Sie den Spinner unter eine Zellkulturhaube und infizieren Sie die Zellen, indem Sie das erforderliche Volumen der Baula-Virus-Suspension über einen Arm des Spinners in die Zellsuspension geben.

Lassen Sie die infizierten Zellen in Suspension bei 27 Grad Celsius wachsen und ernten Sie die Zellen, wenn die maximale Proteinexpression erreicht ist, was bei der Auswahl des effizientesten Makulavirus bestimmt wird. Nach dem Ernten der Zellen lysieren Sie SF9-Zellen, die das Protein von Interesse exprimieren, in etwa 20 Milliliter GST-Bindungspuffer, angereichert mit Proteaseinhibitoren, in einem Eiswasserbad. Homogenisieren Sie die Lösung 20-mal mit einem Dounce-Homogenisator, dann sonifizieren Sie sie für drei 32-Sekunden-Zyklen, bevor Sie erneut 20-mal homogenisieren. Zentrifugieren Sie danach das Zelllysat bei 18.000 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und bewahren Sie das Überstand auf. Inkubieren Sie das lösliche Zelllysat mit einem Milliliter vorgewaschener GST-Kügelchen für eine Stunde bei vier Grad Celsius unter sanfter Rotation.

Die Inkubationszeit sollte entsprechend der Stabilität des Pro und der Bindungseffizienz nach der Bindung optimiert werden. Kurz bei 700 U/min zentrifugieren und das Überstand entnehmen, der nicht gebundene Proteine enthält. Die GST-gebundenen Proteine mit GST-Waschpuffer waschen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei Mal nach der letzten Waschung. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich. Inkubieren Sie dann die Kügelchen mit fünf Millimolar ATP und 15 Millimolar Magnesiumchlorid in 10 Milliliter GST-Bindungspuffer eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, um unspezifische Bindung von Hitzeschockproteinen nach der Inkubation zu vermeiden.

Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit GST-Waschpuffer. Nach dem Zentrifugieren der GST-Kügelchen und Entfernen des Überstandes waschen Sie die GST-Kügelchen mit P5-Puffer. Anschließend teilen Sie die GST-Kügelchen in Fraktionen von jeweils 100 Mikrolitern auf und geben vier bis acht Einheiten Präzisionsenzym hinzu, die in 100 Mikrolitern P5-Puffer verdünnt wurden.

Die GST-Kügelchen mit dem Enzym drei Stunden bis über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Die Inkubationszeit sollte je nach Molekularmasse sowie der Stabilität des Proteins nach der Spaltung optimiert werden. Kurz zentrifugieren und das Überstand aufsammeln.

Fügen Sie 100 Mikroliter P5-Puffer zu den Kügelchen hinzu. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation und Sammlung des Überstandes zweimal. Sammeln Sie alle Fraktionen.

Teilen Sie das EIT in drei Fraktionen zu je einem Milliliter auf und inkubieren Sie jede Fraktion eine Stunde lang unter Rotation mit 100 Mikrolitern vorgewaschener, trockener Talon-Metallaffinitäts-Resinperlen, wodurch die Bindungs- und Wascheffizienz erhöht wird, indem die Elution in mehrere Fraktionen aufgeteilt wird. Waschen Sie danach das Resin fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit P-30-Puffer unter sanfter Rotation. Nachdem der Waschschritt zwei Mal wiederholt wurde, sammeln Sie die Perlen in einem einzigen Reaktionsgefäß, um das gereinigte Protein zu eluieren.

Fügen Sie den P-500-Puffer an die proteinbindende Talon-Harzphase hinzu. Geben Sie einen Puffer-zu-Harz-Volumenverhältnis von eins zu eins hinzu. Inkubieren Sie die Suspension fünf Minuten unter Rotation.

Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Sammeln Sie jede Eluatfraktion getrennt, um das gereinigte Protein zu lagern. Dialysieren Sie das Protein zweimal je eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rühren gegen einen geeigneten Lagerpuffer.

Es ist wichtig, während der Dialyse auf Ausfällung des gereinigten Proteins zu achten. Stellen Sie kleine Aliquots des gereinigten Proteins her und gefrieren Sie diese 30 Minuten lang auf Trockeneis ein. Lagern Sie die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius und vermeiden Sie mehrfache Auftau-Einfrier-Zyklen.

Analysieren Sie den Reinigungsprozess, indem Sie jeweils etwa 20 bis 40 Mikroliter jeder Fraktion auf ein SDS-Page-Gel auftragen. Nach dem Laufen des Gels färben Sie es mit Kumasi-Blau oder einem Proteinfärbemittel zur Visualisierung. Die löslichen und gesamten Zelllysate von SF9-Zellen, die mit dem rekombinanten Valo-Virus REC 14 infiziert oder als Kontrolle mock-infiziert wurden, wurden mittels Kumasi-Blau-Färbung analysiert, wodurch die Expression des GST-RE-14-His-Proteins während des Reinigungsprozesses bestätigt werden konnte. Viele Proben wurden analysiert, um die Effizienz der Methode durch Analyse dieser Proben mit Kumasi-Blau zu verfolgen.

Die Färbung zeigt, dass während des ersten Reinigungsschritts GST-Rec-14 korrekt an GST-Kügelchen gebunden war und ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 50 Kilodalton aufwies, bedingt durch die Fusion von Rec-14 mit GST. Nach der Präzisions-Spaltung mittels G-S-T-G-S-T migriert freies Rec-14-Hiss bei etwa 37 Kilodalton. Während das gespaltene GST auf den GST-Kügelchen sichtbar ist, konnte trotz eines Teils von GST-freiem Rec-14, der weiterhin an die GST-Kügelchen gebunden blieb, eine bemerkenswerte Anreicherung von Rec-14-Hiss erzielt werden. Dieser Schritt könnte durch Verlängerung der Inkubationszeit des Proteins mit der Präzisionsprotease verbessert werden. Die Analyse von Rec-14-Hiss, das an Talon-Kügelchen gebunden ist, im Vergleich zu den Proteinen, die nach dem GST-Reinigungsschritt eluiert wurden, zeigt, dass ein großer Anteil von Rec-14-Hiss an Talon-Kügelchen gebunden ist.

Nach mehreren Waschungen wurde REC 14 hiss eluiert und gesammelt, wobei drei Illusionen durchgeführt wurden. Die Analyse ergab eine hohe Reinheit von rec 14 hiss sowie die höchste Konzentration von rec 14 hiss im ersten Elutionsvergleich der eluierten Fraktionen zu den Talon-Kügelchen nach der Elution, was die Effizienz der Illusion verdeutlicht. Da nur wenig rec 14 hiss als an den Kügelchen gebunden nachweisbar ist.

Diese Proben wurden außerdem einer Western-Blot-Analyse mit Anti-GST- und Anti-His-Antikörpern unterzogen, um REC14 zu verfolgen. Während des gesamten Verfahrens zeigt die Anti-GST-Blot, dass sowohl GST-REC14 als auch GST allein in den Proteinen, die aus dem GST-Reinigungsschritt hervorgingen, vorhanden waren, und dass Kontaminanten durch den Affinitätsreinigungsschritt mit dem His-Tag entfernt wurden. Diese Blot-Analyse zeigt, dass GST durch die Präzisionsbehandlung und den His-Tag-Reinigungsschritt effizient von REC14 entfernt worden war.

Die Anti-Hiss-Blot-Analyse dient zum Nachweis von Re 14. Diese Blot-Analyse bestätigt, dass GST-Rec 14 Hiss und REC 14 Hiss nicht vollständig gespalten und von den GST-Kügelchen entfernt wurden. Darüber hinaus scheint REC 14 bei hoher Konzentration zu aggregieren.

Zusammenfassend zeigen die vorgestellten Ergebnisse die Effizienz der GST-hiss-Reinigung für die Aufreinigung von S palm B rec 14. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hochgradig veredeltes Energieniveau erhält. Kombinantes Protein, sobald es beherrscht ist.

Diese Technik kann innerhalb von 12 Stunden nach der Degeneration von löslichem ly saurem Material durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell und streng bei vier Grad Celsius zu arbeiten, um eine Proteindegradation zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Ko-Präzipitationsassays oder Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Identifizierung von Proteinpartnern oder zur posttranslationalen Modifikation des Proteins von Interesse.

Obwohl wir diese Methode für DNA verwenden, könnte die Strategie für Reparaturproteine modifiziert werden, um die Funktion von Proteinen in anderen Forschungsbereichen zu untersuchen.