Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, cephale Neuronen aus humanen embryonalen Stammzellen oder H-ESCs zu erzeugen, indem Checkpoints durchlaufen werden, die denen ähneln, die während der menschlichen Entwicklung beobachtet werden. Dies wird erreicht, indem HSCs zunächst in Suspension im HESC-Medium spontan differenzieren können und dann in neuronales Induktionsmedium übertragen werden, um selektiver zu differenzieren. Als nächstes können sich Embryokörper oder PSC-Aggregate an mit Gewebekulturen behandelte Platten anheften, wo sich die Zellen ausdehnen und zu einer Monoschicht differenzieren.

Mit den Zentren, die Neuroepithelzellen bilden, die morphologisch ähnlich wie Kilometerzellen sind. Anschließend werden die Neuroepithelzellen isoliert und in Suspensionskulturen gebracht, wo sie Neurosphären bilden. Schließlich werden die Neurosphären auf Deckgläser plattiert, wo sie sich weiter differenzieren können.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, welche spezifischen Arten von Neuronen durch Immunfärbung oder Elektrophysiologie gebildet werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf eine Vielzahl von genetisch vererbten Krankheiten, da patientenspezifische Neuronen auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden können, wo der Wirkmechanismus sowie mögliche Therapien aufgeklärt werden können. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Entwicklung von Talon-cephalen Neuro-Subtypen aus pluripotenten Stammzellen geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. menschliche Krankheiten, die mit Talon-Kopfneuronen zusammenhängen. Um humane pluripotente Stammzellaggregate zu erzeugen, beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher pluripotenter Stammzellen auf embryonalen Fibroblasten-Feedern der Maus in HESC-Medium, die fünf bis sieben Tage lang mit basischem FGF ergänzt werden, die Kolonien werden groß, aber noch undifferenziert sein. Wenn die Völker das richtige Stadium erreicht haben, in einer 50-Milliliter-Tube. Bereiten Sie eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Dis Bays in D-M-E-M-F 12 Medium gemäß dem Textprotokoll vor.

Saugen Sie das Medium aus den Zellen ab und spülen Sie sie anschließend einmal mit D-M-E-M-F 12 aus. Nach dem Entfernen der Wäsche einen Milliliter Dis Bays in jede Vertiefung geben und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie nach drei Minuten unter dem Mikroskop auf eingerollte Ränder, die etwas dunkler aussehen.

Inkubieren Sie die Zellen gegebenenfalls länger. Wenn die Zellen fertig sind, entfernen Sie die Dase-Lösung und waschen Sie die Zellen einmal mit D-M-E-M-F 12, bevor Sie die Wäsche durch 1,5 Milliliter HESC-Medium ersetzen, um die Zellen abzulösen und aufzubrechen. Positionieren Sie die Spitze einer 10-Milliliter-Glaspipette auf den Zellen in Richtung der unteren rechten Wand einer Vertiefung und bewegen Sie sich mit einer kleinen Auf- und Abbewegung über die Vertiefung auf die andere Seite, bevor Sie in die entgegengesetzte Richtung zurückkehren.

Sobald alle Zellen in Suspension sind, geben Sie sie in 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang bei 200 G, bevor Sie das Medium aus dem Pellet entfernen. Mit HESC-Medium werden die Zellen zur Kultivierung in einen Kolben überführt. Verwenden Sie beispielsweise für Zellen aus sechs Vertiefungen mit HSCs einen T 75-Kolben mit 50 Millilitern HESC. Mittel.

Inkubieren Sie die Zellen 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um alle Zelltrümmer zu entfernen, geben Sie die Zellen und das Medium in ein 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Zellen einmal, bevor Sie sie mit 50 Millilitern frischem Medium in einen neuen Kolben umfüllen. Füttern Sie die Zellen auf diese Weise bis zum fünften Tag.

Am fünften Tag werden die Zellen heruntergeschleudert und in einen neuen T 75-Kolben überführt. Inkubieren Sie sie mit 50 Millilitern neuronalem Induktionsmedium oder NIM zwei bis drei Tage lang und ersetzen Sie jeden Tag nach der Inkubationsplatte die Hälfte des NIM, wobei die Zellen entweder Laminin oder FBS verwenden, um sich an die Platten zu befestigen. Fügen Sie mit FBS jeweils 1,5 Milliliter Medium mit Zellen hinzu.

Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Aggregate zu verteilen und die Zellen über Nacht anhaften zu lassen. Ersetzen Sie am nächsten Tag bei 37 Grad Celsius das gesamte Medium durch zwei Milliliter NIM pro Vertiefung. Nach ein oder zwei Tagen Inkubation breitet sich jedes Aggregat aus, um eine Monoschicht zu bilden, und innerhalb weniger Tage erscheinen die Zentren der meisten dieser Zellen morphologisch ähnlich wie Kolumerzellen.

Um den Tag herum erscheinen 14 bis 17 Kolumerzellen kompakter. Manchmal bilden die Zellen Rillen oder Ringe mit einem sichtbaren Lumen im Inneren. Bevor Sie die Zellen isolieren, untersuchen Sie sie auf das Vorhandensein von Nicht-EU-Epithelzellen und kratzen Sie sie mit einer Pipettenspitze ab.

Isolierung der Neuroepithelzellen, die sich im Zentrum der Kolonien befinden. Verwenden Sie eine Mikropipette und eine sterile Pipette mit einem Milliliter-Filter, um Druck auf die Mitte der Kolonie auszuüben, damit sie abhebt. Achten Sie darauf, dass sich nicht auch der äußere Teil des Volkes ablöst

Übertragen Sie zwei Platten mit isolierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie sie zwei Minuten lang bei 200 g. Nach Entfernen des Mediums werden die Zellen in einen nicht mit Gewebekultur behandelten T-25-Kolben mit 10 Millilitern NIM überführt. Mit der Zugabe von B 27, das am nächsten Tag über Nacht inkubiert wird, sollten die Zellen ein kugelartiges Aussehen haben.

Manchmal werden auch die peripheren Zellen isoliert und heften sich in der Regel am Boden des Kolbens. In diesem Fall werden die kugelförmigen Zellen in einen neuen Kolben überführt, wobei die angehängten Zellen hinter der Kultur verbleiben. Die Neurosphären und die Suspension für eine Woche in NIMB 27, um die Zellausdauer und -proliferation zu fördern.

Fügen Sie zyklisches A MP und insulinähnlichen Wachstumsfaktor eins hinzu. Am Ende der Woche werden die Neurosphären kephale Vorläuferzellen enthalten und sind bereit, zur terminalen Differenzierung auf Deckgläser plattiert zu werden. Zur Herstellung von mit Polyurethan-Laminin beschichteten Deckgläsern beginnen Well-Platten damit, saubere Deckgläser über Nacht mit einer 0,1 Milligramm pro Milliliter Lösung von Polyurethan bei 37 Grad Celsius zu beschichten, um die Deckgläser bei 50 Mikrolitern mit Laminin oder 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in neuronaler Differenzierung zu beschichten.

Mittel zu jedem mit Polyurethan behandelten Deckglas. Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nur den Deckschirm selbst berührt. Inkubieren Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Nach der Laminin-Inkubation die Neurosphären in D-M-E-M-F 12 sammeln und waschen. Wenn die Zellen zu groß sind, um sich richtig zu befestigen, fügen Sie etwa zwei Milliliter Accutane hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie ein gleiches Volumen Trypsin-Inhibitor hinzu und ersetzen Sie die Zellen nach der Zentrifusion bei 200 G für drei Minuten die Lösung durch NDM und verwenden Sie ein P 200, um die Zellen für kleine Cluster aufzubrechen.

Legen Sie sie auf vorbeschichtete Deckgläser, saugen Sie den größten Teil des Mediums ab und geben Sie die Zellen in eine sechs Zentimeter große Petrischale, so dass die Auswahl erleichtert wird, ohne das Laminin von den vorbeschichteten Deckgläsern zu entfernen. Übertragen Sie jeweils etwa vier bis fünf Neurosphären. Lassen Sie die Neurosphären mindestens zwei bis vier Stunden lang anheften, bevor Sie 0,5 Milliliter Neurodifferenzierungsmedium hinzufügen, das mit B 27 cyclic ergänzt ist.

Ein MP und neurotrophe Faktoren ersetzen jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Die Zellen können über mehrere Monate erhalten werden, wie hier gezeigt. Dieses Protokoll beschreibt, wie humane PSCs in klauenkephale glutamaterge Neuronen in mehreren kritischen Schritten differenziert werden können.

Die Bildung von PSC aggregiert die Induktion von Neuroepithelzellen, die Bildung von talon-cephalen Vorläuferzellen und die terminale Differenzierung dieser Vorläufer zu talon-cephalen Neuronen. Dieses System ist robust und effizient bei der Erzeugung von z.B. Kopfneuronen, Vorläuferzellen und glutamatergen Neuronen. Ohne die Zugabe von Ising-Faktoren differenzierten sich die HSCs in die neuronale Linie und 24 Tage nach der Differenzierung.

Die Mehrzahl der neuronalen Vorläufer war positiv für Fox G eins, einen Transkriptionsfaktor, der vom Cephalon exprimiert wird, aber negativ für HOKs B vier, einen A-Marker für Hinterhirn- und Rückenmarkszellen, was darauf hindeutet, dass die telon-cephalen Vorläuferzellen erfolgreich erzeugt wurden. Diese telon-cephalen Vorläuferzellen besitzen einen dorsalen Phänotyp, der durch die Expression von PAC six angezeigt wird. Ein Marker, der von dorsalen Vorläuferzellen exprimiert wird, aber nicht NK X 2.1 Ein Marker für ventrale Vorläufer

Nach weiterer Differenzierung differenzierten sich diese cephalen dorsalen Vorläuferzellen zu glutamatergen Neuronen, die positiv für den glutamatergen Marker waren. TBR-1-Neuronen, die für TBR eins positiv waren, waren auch positiv für die neuronalen Marker Beta 3, Tubulin oder Karte zwei. Diese Zellen exprimierten auch vesikulären Glutamattransporter eins oder V glut eins, einen Marker für reife glutamaterge Neuronen, was auf die effiziente Erzeugung von talon-cephalen glutamatergen Neuronen in der Kultur hindeutet.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Elektrophysiologie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob diese Neuronen synaptische Verbindungen mit anderen Zellen herstellen können. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis haben. Es musste humane pluripotente Stammzellen in mehreren kritischen Schritten in kephale glutamaterge Neuronen differenzieren.

Die Bildung pluripotenter Stammzellen aggregiert die Induktion von Neuroepithelzellen, die Bildung von Kopfzellen und die terminale Differenzierung dieser Vorläuferzellen zu Kopfneuronen.