Name: Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Makrophagen-Polarisation mit knochenmarkabgeleiteten Zellen für Immunologie und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von M1- und M2-Aktivierungsprofilen mittels Durchflusszytometrie und PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (BGIA 7850037 Dr. Beiyan Zhou) unterstützt.

1. Isolation von Knochenmarkzellen <ol><li> Isolieren Oberschenkels und des Schienbeins Knochen von 6-8 Wochen alten Mäusen, abspülen Haar und dann aufgeschnitten den Knochen. </li><li> Verwenden Sie eine Nadel 21G und 10-ml-Spritze zu spülen Knochenmark in kaltem PBS +2% hitzeinaktiviertes Fetal Bovine Serum (FBS) (3-5 ml / Maus). </li><li> Pass Knochenmark durch eine 21G Nadel 4-6 mal um die Zellen zu distanzieren. </li><li> Pass Zellen durch eine 70 um Zellsieb zu Zellklumpen, Knochen, Haare und andere Zellen / Gewebe zu entfernen. </li><li> In 3 Volumen von NH 4 Cl-Lösung (0,8% NH 4 Cl-Lösung, Stemcell Technology), und Inkubation auf Eis für 10 min, um rote Blutkörperchen zu entfernen. </li><li> Spin down Zellen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Zellpellet in kaltem PBS + 2% FBS (20-50 ml, je nach der Menge der Zellen). </li></ol> 2. Induction BMDM Formation <ol><li> Resuspendieren der isolierten Knochenmarkzellen in BMDM Wachstumsmedium (2x10 6 Zellen / ml). </li></ol> BMDM Wachstumsmedium: Iscoves Modified Dulbecco-Medium (IMDM) + 10% FBS + 15% gefiltert (0,2 um) L-929-Zellen (ATCC, CCL-1) Kulturüberstand (mit Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF) oder 10 ng / ml M -CSF. Hinweis: L-929 Zellüberstand enthält M-CSF 18. Um die effektive Aktivität des konditionierten Mediums, 5 X 10 5 sicherzustellen L-929-Zellen in T75 cm 2-Kolben für 6-7 Tage ausgesät, konditionierte Medium gesammelt und durch ein 0,45 um-Filter vor dem Gebrauch übergeben. Aliquots Medium kann sofort verwendet werden oder gespeichert in -80 ° C für 1-2 Monate. <ol start="2"><li> Seed-Zellen in 6 oder 12 Loch-Gewebekulturplatten (je nach Versuchsaufbau) (Corning Costar). </li><li> Ändern frisch BMDM Wachstumsmedium am 3. Tag. </li><li> Am 7. Tag wird die Bildung von reifen BMDM ausgewertet mittels Durchflusszytometrie-Analyseund Fluorophor konjugierten Antikörpern zu erkennen exprimieren CD11b und F4/80. </li></ol> 3. BMDM Polarized Aktivierung <ol><li> Am Tag 7, an die frische Stimulation Medium ändern: für M1 Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS und 100 ng / ml LPS oder 100 ng / ml LPS mit 50 ng / ml IFN; M2 für Aktivierung verwenden IMDM mit 10% FBS mit 10 ng / ml IL-4 und / oder 10 ng / ml IL-13. </li><li> Sammeln angeregt BMDMs durch Lösen sie aus der Schale mit warmem 0,05% Trypsin, gefolgt vom Waschen der Zellen zweimal mit PBS, enthaltend 10% FBS. </li></ol> Hinweis: Um lösen und suspendieren reifen Makrophagen nach der Differenzierung, 0,05% Trypsin-Lösung (enthaltend 0,48 mM EDTA, Invitrogen) oder 2-5 mM EDTA in Ca-und Mg-freiem PBS oder Hanks-Puffer (HBSS) verwendet werden. Bei der Verwendung von Trypsin Verdauung Medium werden die Zellen bei 37 ° C für weniger als 10 Minuten behandelt, um Verlust zu vermeiden surGesicht Proteine ​​aufgrund über-Verdauung. <ol start="3"><li> Mit Antikörpern, um die Expression von Zelloberflächen-Antigene, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 oder CD86 zu verschiedenen Zeitpunkten mit Standard Durchflusszytometrie Färbeverfahren. </li><li> Bestimmen Expression von Genen charakteristisch aktivierten M1 und M2 Makrophagen einschließlich IL-1β, TNF-α und IL-6 (M1 Aktivierung) oder IL-10, IL-13, arginase1 und PPAR (M2 Aktivierung) mit qRT-PCR. Bestimmen Aktivierung der Zelle Signalwege in der Aktivierung von M1 oder M2 Makrophagen durch Western-Blot-Analyse beteiligt. </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir berichten hier über eine einfache und leicht anpassbar in vitro Verfahren zur Aktivierung von Makrophagen aus Knochenmark-Vorläuferzellen abgeleitet induzieren. Dieses Verfahren kann zur Untersuchung der Mechanismen, die für die Polarisation von Makrophagen verwendet werden. Die Reinheit von reifen Makrophagen unter Verwendung dieses Protokolls beträgt 95 bis 99%, und keine zusätzlichen Reinigungsschritte benötigt werden. Um die Funktion bestimmter Gene von Interessen im Rahmen der Makrophagen-Polarisierung...

Im Unterschied zu klassischen Entzündungsreaktionen, Makrophagen, die Gewebe infiltrieren zeigen oft polarisiert Aktivierungsstatus, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung Wirtsgewebe physiologischen Funktionen 1-8 spielt. Nach Stimulation kann Makrophagenaktivierung in classic (M1) und alternativen (M2) Aktivierung 2, 4, 9 sortiert werden. M1 Makrophagenaktivierung hängt von Toll-like Rezeptoren (TLR) und Aktivierung von nuclear factor kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1), was zur Produktion von inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL- 1β und Aktivierung von iNOS, die zu einer erhöhten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies wie Nitrid-Oxid (NO) 10, 11. Im Gegensatz dazu führt M2 Makrophagen-Aktivierung rekrutiert PPAR, PPAR oder IL-4-STAT6 Wege, um alternative, entzündungshemmende (M2), die mit Aktivierung Hochregulation von Mannose-Rezeptor CD206 zugeordnet ist, und Arginase 1 (Arg1) 6, 12 - 14 &lt;/ Sup&gt;. Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMDM) präsentieren eine ideale in vitro Modell, um die Mechanismen, die die Polarisation des aktivierten Makrophagen 15 zu verstehen. Insbesondere kann die Aktivierung von Makrophagen M1 durch Lipopolysaccharide (LPS) Stimulation induziert werden, während Polarisation M2 Makrophagen IL-4 und / oder IL-13 induziert werden kann. Ältere Knochenmark stammende Makrophagen und aktivierten Makrophagen durch Durchflusszytometrie-Analyse auf die Expression von Oberflächen-Antigenen, einschließlich CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 und CD86 9, 16, 17 identifiziert werden. Darüber hinaus können Änderungen in der Produktion von Zytokinen und Zellsignalwege mit Makrophagen Polarisationsrichtung zugeordnet ist, durch quantitative RT-PCR und Western Blot, jeweils gemessen werden. Zusammenfassend kann Knochenmark der Maus Makrophagen als relevantes Modell Makrophagen Polarisation in-vitro-Studie dienen.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Maus GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>StemCell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Zellensieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>Propidium-Jod-Invitrogen</td><td></td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung von makrophagen-polarisation mit knochenmark-makrophagen

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Der Artikel beschreibt eine einfache adaptive leicht in vitro Modell zur Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Eine schematische Beschreibung des BMDM Generation Verfahren vorgestellt (Abbildung 1). Hohe Reinheit von reifen Makrophagen an Tag 7 beobachtet werden, wenn sie 95 bis 99% der CD11b + F4/80 + Zellen (Abbildung 2) zu vertreten. Polarisierte Makrophagen untersucht werden unter Verwendung von Antikörpern gegen CD11b, F4/80, gefolgt CD11c und CD206 mittels Durchflusszytometrie-Analyse. Wie in Abbildung 3 gezeigt, sind M1 Makrophagen erkannt CD11b + CD11c + + F4/80 CD206-Ze...

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach adaptive<em&gt; In vitro</em&gt; Modell Makrophagen Polarisation zu untersuchen. In Gegenwart von GM-CSF/M-CSF, hämatopoetische Stammzellen sind / Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in Monozyten Differenzierung gerichtet, gefolgt von M1 oder M2 Stimulation. Der Aktivierungsstatus kann durch Änderungen in Zelloberflächen-Antigene, Genexpression und Zellsignalwege verfolgt werden.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Um aus Knochenmark gewonnene Makrophagen für die Polarisierungsanalyse zu erzeugen, werden Femur- und Tibiaknochen von Mäusen isoliert und die Knochenmarkzellen gewonnen. Anschließend werden die Zellen in einem Medium kultiviert, das Wachstumsfaktoren enthält, um die Bildung von Makrophagen zu induzieren.Nach sieben Tagen der Kultur werden die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mit verschiedenen Stimuli behandelt und polarisierte Makrophagen erhalten. Die Aktivierungsantworten werden mittels Durchflusszytometrie, Echtzeit-PCR und Western-Blot-Analyse analysiert; die Ergebnisse zeigen eine hohe Reinheit der aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mit polarisierten Aktivierungsantworten entweder in Richtung M1 oder M2. Stimuli liegen vor.Die Bedeutung dieser Technik liegt in ihrer Anwendung für die Therapie oder Diagnose von Erkrankungen im Zusammenhang mit Diversität, einschließlich Insulinresistenz und den CROs, da T-infiltrierende Makrophagen in diesem Kontext eine wesentliche Rolle spielen. Eine visuelle Darstellung dieses Verfahrens ist entscheidend, da die Beschleunigung von Knochenmarkzellen etwas schwierig ist und die Ausbeute entscheidend für die Gewinnung einer ausreichenden Zellpräparation zum Induzieren der Makrophagenbildung ist. Arbeiten Sie in einer sterilen Haube. Beginnen Sie dieses Protokoll mit Femur- und Tibiaknochen, die von sechs bis acht Wochen alten Mäusen in einer Zellkulturschale isoliert wurden. Spülen Sie die Knochen in PBS aus, und schneiden Sie dann mit einer Schere beide Enden der Knochen auf, wobei Sie darauf achten sollten, beim Halten des Knochens mit einer Pinzette nicht zu viel zu entfernen.Führen Sie eine 21- auf 23-Gauge-Nadel mit einer 10-Milliliter-Spritze, die kaltes PBS mit 2 % hitzeaktiviertem FBS enthält, in ein Ende des Knochens ein. Drücken Sie den Kolben, um das Mark in eine neue Zellkulturschale auszuspülen. Anschließend wird das Mark vier- bis sechsmal durch dieselbe Nadel gegeben, um die Zellen zu dissoziieren.Geben Sie die Zellen anschließend in einen 70-Mikron-Zellsieb, um Zellklumpen, Knochen, Haare und andere Zellen oder Gewebe zu entfernen. Sammeln Sie das Durchflussvolumen in einem 50-Milliliter-Konischglas. Sobald die Lösung durch den Filter gelaufen ist, geben Sie drei Volumina 0,8 %iger Ammoniumchloridlösung zum Durchfluss hinzu und inkubieren die Probe 10 Minuten auf Eis.Um rote Blutkörperchen nach der Inkubation zu entfernen, die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius abzentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in 20 bis 50 Milliliter kaltem PBS mit 2 % FBS resuspendieren. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Abgießen des Überstandes fahren Sie mit der Induktion der BMDM-Bildung wie im nächsten Abschnitt des Protokolls beschrieben fort. Um die BMDM-Bildung zu induzieren, resuspendieren Sie die isolierten Knochenmarkzellen in BMDM-Wachstumsmedium mit einer Konzentration von zwei Mal.Zentrieren Sie sechs Zellen pro Milliliter Saatgut, ein- bis zweimal 10 hoch sechs Zellen, in jeder Vertiefung einer sechs- oder 12-Loch-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Die Aussaat in dieser Konzentration erleichtert die Ablösung für die Durchflusszytometrie nach drei Tagen. Wechseln Sie am siebten Tag auf frisches BMDM-Wachstumsmedium. Die Ausbildung reifer BMDM wird mittels Durchflusszytometrie-Analyse und fluorochrommarkierter Antikörper zur Detektion von Zellen, die CD11b und F4/80 exprimieren, überprüft. Nach Bestätigung der Bildung reifer BMDM wechseln Sie auf frisches, von Iscove modifiziertes Dulbecco-Medium mit 10 % FBS sowie LPS oder LPS und Interferon-gamma zur M1-Aktivierung bzw. IL-4 oder IL-13 zur M2-Aktivierung. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 °C.Sammeln Sie die stimulierten bMDMs, indem Sie sie von der Petrischale ablösen. Entfernen Sie dazu das Medium von den Zellen und waschen Sie mit PBS ohne Calcium oder Magnesium. Geben Sie dann warmes 0,05 %iges Trypsin, das 0,48 Millimolar EDTA enthält, hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius nicht länger als 10 Minuten, um einen Verlust von Oberflächenproteinen durch Überverdauung zu vermeiden.Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal mit PBS, der 10 % FBS enthält, und überführen Sie sie in 1,2-Milliliter-Probenröhrchen. Verwenden Sie Antikörper, um die Expression von Oberflächenantigenen wie CD11bF4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 oder CD86 zu verschiedenen Zeitpunkten nachzuweisen. Wenden Sie dabei Standardverfahren zur Färbung für die Durchflusszytometrie sowie quantitative PCR an.Bestimmen Sie die Expressionslevel von IL-1β, TNF-α und IL-6 zur Beurteilung der M1-Aktivierung oder von IL-10, IL-13, Arginase-1 und PPAR-γ zur Beurteilung der M2-Aktivierung. Führen Sie abschließend eine Western-Blot-Analyse durch, um die Aktivierung von Signalwegen zu überprüfen, die an der Aktivierung von M1- oder M2-Makrophagen beteiligt sind, und um die Reinheit ausgereifter BMDM zu beurteilen. Nach der Induktion wurde eine Durchflusszytometrie mittels Antikörpern gegen CD11b, F4/80, CD11c und CD206 durchgeführt. Die BMDM wurden zunächst anhand von FSC und SSC selektiert, um DRI und Konjugate auszuschließen.Reife b MDMs wurden als CD11b-positive, F4/80-positive Subpopulationen definiert, die in der oberen rechten Ecke dieses Diagramms zu sehen sind und 95 bis 99 % der analysierten Zellpopulation ausmachten, um die Makrophagenpolarisierung zu beurteilen. Es wurde eine weitere Analyse durchgeführt. Zunächst erfolgte eine Gating-Strategie, um in das Gewebe eingewanderte Makrophagen zu identifizieren, die CD11b-positive, F4/80-positive Zellen darstellen.Unter diesen M1-Makrophagen, die im Quadranten zwei erscheinen, sind CD11C-positiv und CD206-negativ, während M2-Makrophagen, die im Quadranten vier erscheinen, CD11C-negativ und CD206-positiv sind. Zur Beurteilung der Makrophagenaktivierung wurden die Zellen entweder mit LPS zur Induktion der M1-Aktivierung oder mit IL-4 zur M2-Aktivierung inkubiert. Nach der Aktivierung nahm die Größe der Makrophagen zu, wie durch die Verschiebung des FSC-Signals von M1- oder M2-Makrophagen 24 Stunden nach Stimulation im Vergleich zu unbehandelten M0-Makrophagen belegt wird.Die mit der Makrophagenaktivierung assoziierten Oberflächenmarker wurden ebenfalls nach Stimulation analysiert. Der früh antwortende Marker CD 69 wurde fünf oder 24 Stunden nach Stimulation bewertet, die Marker CD 80 und CD 86 wurden 48 Stunden nach Stimulation analysiert. Wie hier gezeigt, war eine erhöhte Expression der Oberflächenmarker CD 69, CD 80 und CD 86 in stimulierten Makrophagen nachweisbar, um die klassische und alternative Aktivierung von Makrophagen zu beurteilen.Diejenigen, die entweder mit LPS oder IL-4 für 24 Stunden stimuliert wurden, wurden gesammelt, und die gesamte RNA wurde für die Analyse mittels quantitativer Echtzeit-PCR extrahiert, wie hier gezeigt. Erhöhte Expression von Arginase-1 und PPARγ wurde in M2-Makrophagen im Vergleich zu unbehandelten Makrophagen nachgewiesen, sowie die Expression proinflammatorischer Zytokine. Interleukin-1β und TNFα stiegen in M1-Makrophagen an, um die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs durch LPS zu überprüfen; Antikörper gegen p65 und phospho-p65 wurden in der Western-Blot-Analyse verwendet, wie hier dargestellt.Eine stärkere Bande gegen phosphoryliertes P 65 ist bei LPS-Behandlung zu beobachten. Insgesamt zeigen diese Daten, dass aus dem Knochenmark stammende Makrophagen polarisierte Aktivierungsantworten auf entweder M1- oder M2-Stimuli aufweisen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus dem Knochenmark stammende Makrophagen erzeugt und anschließend eine Analyse der polarisierten Aktivierung durchführt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Reinheit der differenzierten Makrophagen vor der Untersuchung ihrer Reaktion zu überprüfen. Nach diesem Verfahren kann eine Methode wie die transiente Transfektion von Genen oder SHRA durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie sind Gene an der Regulierung der Makrophagenaktivierung beteiligt?

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Induktion der Differenzierung und Polarisation von Monozyten aus peripherem Blut in M1- oder M2-Makrophagen. Die Inkubation mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Lipopolysaccharid und Interferon-gamma ergibt proinflammatorische M1-Makrophagen, während die Inkubation mit Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und Interleukin-4 die entzündungshemmende Produktion von M2-Makrophagen induziert.

Differenzierung und Polarisation von Monozyten-abgeleiteten Zellen in Makrophagen-ähnliche Zellen

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur Proteomic Unterschriften von menschlichen Makrophagen und wenden Sie diese zur Bestimmung der Auswirkungen einer sauerstoffarmen Umgebung auf Makrophagen Polarisation.

Proteomic Analysen der menschlichen Makrophagen Polarisierung in einer sauerstoffarmen Umgebung

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Mycobacterium tuberculosis-Infektion bei menschlichen M1- oder M2-polarisierten Makrophagen auf der Grundlage der Differenzierung von peripheren Blutmonozyten zu Makrophagen-ähnlichen Zellen, die mit dem GFP-markierten virulenten Stamm H37Rv infiziert und mit Durchflusszytometrie mit einem 10-Farben-Panel einschließlich der Expression ausgewählter M1/M2-Marker analysiert werden.

Polarisation von M1 und M2 Human Monocyte-Derived Cells und Analyse mit Durchflusszytometrie bei Mycobacterium tuberculosis Infection

M2-ähnliche tumorassoziierte Makrophagen (TAM) sind mit Tumorprogression und schlechter Prognose bei Krebs assoziiert. Dieses Protokoll dient als detaillierte Anleitung, um THP-1-Monozyten-ähnliche Zellen innerhalb von 14 Tagen reproduzierbar in M2-ähnliche Makrophagen zu differenzieren und zu polarisieren. Dieses Modell ist die Grundlage, um die entzündungshemmende Wirkung von TAM in der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Makrophagendifferenzierung und Polarisation in einen M2-ähnlichen Phänotyp unter Verwendung einer humanen Monozyten-ähnlichen THP-1-Leukämie-Zelllinie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Bewertung des immunmodulatorischen Potenzials von Implantatoberflächen in vitro vor, um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aktueller Protokolle zu verbessern und die weitere Forschung zu fördern. Sekretorische Zytokinprofile, mRNA-Expression und Zelloberflächenmarker wurden mit Hilfe von Blutmonozyten-abgeleiteten Makrophagen überwacht, um die Makrophagenpolarisation auf Titan zu untersuchen.

Polarisation und Charakterisierung von M1- und M2-humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen auf Implantatoberflächen 

Erfahren Sie die Makrophagen-Polarisation mit knochenmarkabgeleiteten Zellen für Immunologie und Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von M1- und M2-Aktivierungsprofilen mittels Durchflusszytometrie und PCR.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Weitere Videos entdecken