Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Zur Generierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen für die Polarisationsanalyse. Femur- und Tibiaknochen werden aus Mäusen isoliert und die Knochenmarkzellen entnommen. Die Zellen werden dann in einem Medium kultiviert, das Wachstumsfaktoren enthält, um die Bildung von Makrophagen zu induzieren.

Nach siebentägiger Kultivierung werden die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen mit verschiedenen Stimuli und polarisierten Makrophagen behandelt. Die Aktivierungsreaktionen werden durch Durchflusszytometrie, Echtzeit-PCR und Western Blos-Analyse analysiert, die eine hohe Reinheit von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mit polarisierten Aktivierungsantworten auf M1 oder M zwei zeigen. Reize lügen.

Die Implikation dieser Technik ist die Haltung zur Therapie oder Diagnose von Diversitäts-assoziierten Krankheiten, einschließlich insulinresistenter und der CROs, da T-infiltrierende Makrophagen in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle spielen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Beschleunigung der Knochenmarkzelle etwas schwierig ist und die Ausbeute entscheidend ist, um eine ausreichende Untersuchung der Zellvorbereitung zur Induktion der Makrophagenbildung zu erhalten. Beginnen Sie dieses Protokoll mit Femur- und Tibiaknochen, die von sechs bis acht Wochen alten Mäusen in einer Gewebekulturschale isoliert wurden. Spülen Sie die Knochen in PBS und schneiden Sie dann mit einer Schere beide Enden der Knochen auf, wobei Sie darauf achten, nicht zu viel zu entfernen, während Sie den Knochen mit einer Pinzette festhalten.

Führen Sie eine 21-auf-23-Gauge-Nadel mit einer 10-Milliliter-Spritze ein, die kaltes PBS mit 2 % erhitzungsaktiviertem FBS enthält, in ein Ende des Knochens. Drücken Sie den Kolben, um das Mark in eine neue Gewebekulturschale zu spülen. Führen Sie als Nächstes das Knochenmark vier- bis sechsmal durch dieselbe Nadel, um die Zellen zu dissoziieren.

Gießen Sie dann die Zellen in ein 70-Mikron-Zellsieb, um Zellklumpen, Knochen, Haare und andere Zellen oder Gewebe zu entfernen. Sammeln Sie den Durchfluss in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Sobald die Lösung den Filter passiert hat, geben Sie drei Volumen 0,8 % Ammoniumchlorid in den Durchfluss und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.

Um rote Blutkörperchen nach der Inkubation zu entfernen, schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 500 mal G herunter. Nach dem Schleudern wird das Zellpellet in 20 bis 50 Millilitern kaltem PBS mit 2 % FBS wieder suspendiert. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal G auf vier Grad Celsius herunter. Nach dem Abgießen des Supinats. Fahren Sie fort, um die BMDM-Bildung zu induzieren, wie im nächsten Abschnitt des Protokolls beschrieben. Um die BMDM-Bildung zu induzieren, suspendieren Sie die isolierten Knochenmarkzellen in BMDM-Wachstumsmedium in einer Konzentration von zweimal.

Zentrieren Sie die sechs Zellen pro Milliliter Samen ein- bis zweimal 10 auf die sechs Zellen in jeder Vertiefung einer Gewebekulturplatte mit sechs oder 12 Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Die Aussaat bei dieser Konzentration erleichtert die Ablösung für die Durchflusszytometrie nach drei Tagen. Wechseln Sie am siebten Tag zu frischem BMDM-Wachstumsmedium.

Die Bildung von reifem BMDM wird mittels Durchflusszytometrie und Fluorol-konjugierten Antikörpern bewertet, um Zellen nachzuweisen, die CD 11, B und F 4 80 exprimieren. Nach Überprüfung der Bildung von reifem BMDM erfolgt der Wechsel zu frischem Do-Echo-Medium mit 10% FBS und LPS oder LPS und Interferon-Gamma für die M1-Aktivierung oder IL vier oder IL 13 für die M-2-Aktivierung. Inkubieren Sie die Zellen nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Sammeln Sie die stimulierten b MDMs, indem Sie sie von der Schale lösen. Entfernen Sie dazu das Medium aus den Zellen und waschen Sie es mit PBS ohne Kalzium oder Magnesium. Fügen Sie dann warmes 0,05%iges Trypsin mit 0,48 Millimolaren hinzu, EDTA inkubieren Sie es nicht länger als 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, um einen Verlust von Oberflächenproteinen durch Überverdauung zu vermeiden.

Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit PBS mit 10 % FBS und überführen Sie sie in 1,2 Milliliter Probenröhrchen. Verwenden Sie Antikörper zum Nachweis der Expression von Zelloberflächenantigenen, einschließlich CD 11 BF vier 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 oder CD 86 zu verschiedenen Zeitpunkten. Unter Verwendung von Standard-Färbeverfahren der Durchflusszytometrie mittels quantitativer PCR.

Bestimmen Sie die Expressionsniveaus von IL eins, beta, TNF, alpha und IL sechs, um die M1-Aktivierung zu beurteilen, oder IL 10, IL 13, Arginase eins und PPAR-gamma, um die M-2-Aktivierung zu beurteilen. Führen Sie schließlich Western Blotting durch, um die Aktivierung von Zellsignalwegen zu beurteilen, die an der Aktivierung von M1 oder M beteiligt sind, zwei Makrophagen, um die Reinheit des reifen BMDM zu beurteilen. Nach der Induktion wurde eine durchflusszytometrische Analyse mit Antikörpern gegen CD 11, BF, vier 80, CD 11 C und CD 2 0 6 B durchgeführt. MDMs wurden zunächst auf FSC und SSC gegated, um DRI und Konjugate zu entfernen.

Reife b MDMs wurden als CD 11 B positive F vier 80 positive Subpopulationen definiert, die oben rechts in diesem Diagramm zu sehen sind und 95 bis 99% der Gated Population bei der Beurteilung der Makrophagenpolarisation beeinträchtigten. Es wurden weitere Analysen durchgeführt. Das erste Gating wurde durchgeführt, um gewebeinfiltrierte Makrophagen zu identifizieren, bei denen es sich um CD 11 B positive F und vier 80 positive Zellen handelt.

Unter diesen M1-Makrophagen, die CD 11 C positiv und CD 2 0 6 negativ sind, erscheinen im zweiten Quadranten, während M zwei Makrophagen, die CD 11 C negativ und CD 2 0 6 positiv im vierten Quadranten erscheinen, erscheinen. Zur Beurteilung der Makrophagenaktivierung wurden die Zellen entweder mit LPS inkubiert, um die M1-Aktivierung zu induzieren, oder mit IL vier zur M2-Aktivierung. Nach der Aktivierung nahm die Größe der Makrophagen zu, wie die Verschiebung der FSCA von M1 oder M um zwei Makrophagen 24 Stunden nach der Stimulation im Vergleich zu M null unbehandelt zeigt.

aktivierungsbezogenen Oberflächenmarker von Makrophagen wurden nach der Stimulation ebenfalls analysiert. Die früh ansprechenden Marker CD 69 wurden fünf oder 24 Stunden nach der Stimulation ausgewertet, die Marker CD 80 und CD 86 wurden 48 Stunden nach der Stimulation analysiert. Wie hier gezeigt, wurde eine erhöhte Abundanz von Oberflächen-CD 69, CD 80 und CD 86 in stimulierten Makrophagen beobachtet, um die klassische und alternative Aktivierung von Makrophagen zu beurteilen.

Diejenigen, die 24 Stunden lang entweder mit LPS oder IL vier stimuliert wurden, wurden gesammelt und die Gesamt-RNA für die Analyse mittels quantitativer Echtzeit-PCR extrahiert, wie hier gezeigt. Eine erhöhte Arginase-1- und PPAR-Gamma-Expression wurde in M-2-Makrophagen im Vergleich zu unbehandelten Makrophagen nachgewiesen, die proinflammatorische Zytokine exprimieren. Interleukin one beta TNF alpha erhöhte sich in M1-Makrophagen zur Beurteilung der Aktivierung des NF kappa B-Signalwegs durch LPS-Antikörper gegen P 65 und phosphoverwandtes P 65 wurden in der Western-Blot-Analyse verwendet, wie hier gezeigt.

Eine stärkere Bande gegen phosphoryliertes P 65 wird bei einer LPS-Behandlung beobachtet. Zusammengenommen deuten diese Daten auf aus dem Knochenmark stammende Makrophagen mit polarisierten Aktivierungsreaktionen auf entweder M1- oder M-Zwei-Stimuli hin. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen erzeugt, gefolgt von einer polarisierten Aktivierungsanalyse.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Reinheit differenzierter Makrophagen zu bewerten, bevor man ihre Reaktion testet. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Methode wie die transiente Transfektion von Genen oder SHRA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Wie sind Gene an der Regulierung der makrophagischen Aktivierung beteiligt?