Name: Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von UGSM aus Nagetierembryonen zur Bildung menschlicher Prostatepithelien durch Geweberekombination mit pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Prostatakrebs-Initiationsmechanismen.

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Wir wollen die Unterstützung der Universität von Chicago Abschnitt der Urologie von Dr. Arieh Shalhav führte, und der Direktor der Urologischen Forschung Dr. Carrie Rinker-Schaeffer anzuerkennen. Wir würden auch gerne die Unterstützung der Universität von Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) von Dr. Michelle Le Beau führte zu bestätigen. Wir arbeiten auch mit den Experten der technischen Hilfe des Human Tissue Resource Center Core Facility Dr. Mark Lingen führte, und der Unterstützung von Leslie Martin und Mary Jo Fekete danken. Wir danken auch der Core Facility Immunhistochemie von Terri Li laufen. Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Department of Surgery, die Abteilung für Urologie finanziert, ein American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), ein Krebs-Center Support Grant (P30 CA14599); Der Brinson Foundation, die Alvin Baum Family Fund; The University of Chicago Cancer Research Foundation Frauen Platine; S. Kregel wird von einem HHMI unterstützt: Med-in-Grad Fellowship (56006772) und ein Krebs-Biologie Ausbildung Grant (T32-CA09594). Schließlich möchten wir Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan und Nathan Stadick für ihre kritische Beurteilung des Manuskripts danken.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Chicago Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC, Protokoll-Nummern 72066 und 72231) zugelassen. Jede Operation wurde unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, nicht so lange leiden. Die menschlichen embryonalen Stammzellen Linie WA01 (H1; NIH-registration # 0043) wurde von WiCell (Madison, WI) und kultivierten erworben über den Einzug-unabhängiges Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-Zellen wurden innerhalb von zehn Durchgängen Auftauen verwendet. 1. Isolation des Sinus urogenitalis aus Maus oder Ratte Embryonen <ol><li> Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus (Tag 17,5) oder Ratte (Tag 18,5) durch die Inhalation von CO 2 für 5 min. Der Tod wird durch die Einstellung der Vitalfunktionen in der Ratte bestätigt. Dann brechen den Hals menschlich. Die rbei an dieser Stelle eingeschläfert. Sprühen Sie 70% Ethanol, um die Bauchhaut und Flanken zu sterilisieren. Schneiden Sie die Bauchhaut und Muskelschichten und dann schneiden die Gebärmutter, trennen Sie die Ratte Embryonen aus der Fruchtblase, und schnitt die Nabelschnur. Übertragen Sie die Embryonen in einem 50 ml Falcon Röhrchen mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und halten auf dem Eis. Föten werden durch Enthauptung mit chirurgischer Schere eingeschläfert. </li><li> Setzen Sie den Embryo in 100 mm Petrischale. Halbieren des Embryos mit einer Schere in der Höhe des Nabels (1A). Entfernen Sie den Magen und Dünndarm. Reveal die Eierstöcke in den weiblichen Embryo und Hoden in der männlichen Embryo (Abbildung 1B und 1C). (Die Eierstöcke sind am kaudalen Pole der Nieren. Die Hoden sind etwa in Höhe der Blase). In diesem Entwicklungsstadium, isoliert UGSM sowohl von männlichen und weiblichen Embryonen zu induzieren vermag eine Prostataepithelzellen Linie in Gegenwart von Host sindTestosteron. 4 Nach diesem Entwicklungsstadium Zeitpunkt beginnt jedoch Prostatahyperplasie Knospen bilden in den UGSM und Isolierung von reinem UGSM ist sehr herausfordernd. 4 </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, schneiden die Bauchdecke in der mittleren Zeile mit Vannas Schere, um die Blase und hinteren Bauchwand freizulegen. Free the oberen Genitaltrakt von Anhängen (bei männlichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter, Urnierengang und Müller-Gang; in weiblichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter und Müller-Gang). Befreie die Blase aus der Nabelschnur. Cut Schambein und unverblümt getrennt von der vorderen Wand des Sinus urogenitalis mit Dumont feine Spitze Pinzette. Schließlich trennt die hintere Wand des Urogenital-Sinus aus dem Rektum. Schneiden Sie den Sinus urogenitalis mit der Blase am unteren Ende (aus der Harnröhre) und speichern Sie die Sinus urogenitalis en bloc (mit der Blase) in eiskaltem HBSS. </li></ol> 2. Trennung des Sinus urogenitalis Mesenchym <ol><li&gt; Entfernen Sie die Blase aus dem Sinus urogenitalis unter dem Dissektionsmikroskop (1D). </li><li> Übertragen Sie die Sinus urogenitalis einem Falcon-Röhrchen mit 1% Trypsin in Calcium (Ca 2 +) und Magnesium (Mg 2 +) kostenlos HBSS. Das Röhrchen wird in einem Kühlschrank bei 4 ° C für 75 min. </li><li> Entfernen Sie die Trypsin und Trypsin neutralisiert mit 10% fötalem Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12 Medium. </li><li> Sorgfältig necken die klebrige mesenchymalen Hülse von der epithelialen Rohr mit einer Nadel oder Dumont feine Spitze Pinzette (Aufrechterhaltung der epithelialen Röhre intakt verringert die Chancen der Epithelzellen Kontamination des Mesenchym, dies kann in Nagetier Drüsen führen bilden zusammen mit Ihrem Stammzellen abgeleiteten menschlichen Drüsenepithel) (1D). 12 </li><li> Übertragen UGSM in ein neues Falcon-Röhrchen mit DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 0,5 mg / ml) + 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA) zzgl. 1 nM R1881. Place das Rohr in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht. </li><li> Zentrifuge das Gewebe bei 200 xg und den Überstand verwerfen. Waschen mit Phosphatpuffer Saline (PBS) (nicht stören das Gewebe Pellet). </li><li> In 0,2% Kollagenase (in DMEM/F12) zu resuspendieren des Gewebes. Inkubation in 37 ° C unter leichtem Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Energisch Wirbel die Verdauung Gewebe dreimal, bis es homogen einzellige Mischung wird und fügen DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% + 1 nM R1881 NEAA die Kollagenase neutralisieren. </li><li> Zentrifuge bei 200 xg und dann waschen durch erneute Aussetzung der UGSM Zellen in HBSS, und wiederholen dreimal vollständig waschen UGSM. Schließlich auszusetzen mesenchymalen Zellen in DMEM/F12 und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzählung Gerät. </li><li> Dissociate hES-Zellen kultiviert mit Feeder-freies Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) unter Verwendung eines Accutase Verdauung (Millipore; Billerica, MA). Waschen Sie die hES-Zellenwährend der log-Phase ihres Wachstums in warmen DMEM/F12-Medium, dann fügen warmen 1x Accutase Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 15-20 min, bis einzelne Zellen gleichmäßig losgelöst von Kolonien sind. In die gleiche Menge definiert 1x Trypsin Inhibitor (Invitrogen; Grand Island, NY), um die Accutase neutralisieren und sanft Pipette auf und ab zu mischen und brechen Zellklumpen. Pipette Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellpellet in DMEM/F12-Medium. Reaktionsgefäßständer für 3 min bei 200 xg erneut und entfernen Sie den Überstand, dann in kaltem HBSS oder DMEM/F12 resuspendieren auf gewünschte Lautstärke. </li><li> In hES-Zellen mit 1:2,5 Verhältnis von hES / mesenchymalen Zellen. 3 Dies wird eine zelluläre Zusammensetzung von 1E 5 UGSM Zellen mit 4E 4 hESCs pro 10 ml Injektionslösung (eine einzelne Ratte UGS Regel ergibt etwa 2E 6 mesenchymalen Zellen) sein. Zentrifuge bei 200 xg für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Mit 75% Matrigel (BD Biosciences Re-suspend,San Jose, CA; mit 25% kaltem HBSS für eine einfachere Handhabung) und legen Sie den Schlauch in Eis für Sub-Nierenkapsel Injektion. </li></ol> 3. Transplantation von Gewebe Rekombinante Unterhalb der Nierenkapsel <ol><li> Bereiten Sie eine sterile OP-Bereich. </li><li> Anesthetize einen männlichen athymischer Maus mit Ketamin / Xylazin ip; verwenden eine frische Mischung mit einem Verhältnis von 01.01.08 Ketamin: Xylazin: Kochsalzlösung. Dosierung beträgt 100 mg / kg Ketamin und 2,5 mg / kg Xylazin sein. Tiere reagieren nicht auf einer Zehe-Prise sollte vollständig unter 20-30 min. </li><li> Chirurgisch bereiten die Maus durch Rasieren das OP-Gebiet (wenn nicht mit einem nackten Maus), Reinigung mit drei abwechselnden Tücher von 70% Alkohol, gefolgt von betadine Lösung und Anlegen eines Operationstuch. </li><li> Setzen Auge Feuchtigkeit Salbe (Altalube Augensalbe) an den Augen der Maus Austrocknen zu verhindern während der Narkose. </li><li> Während der Operation werden Atemfrequenz und Körpertemperatur der Mäuse beobachtet. Die Atemfrequenz shoULD stabil sein und gewartet werden innerhalb 40-90 Atemzüge / min. Die Körperkerntemperatur wird mit Beobachtung der Farbe der Schleimhäute und der rosa Fußsohlen überwacht. </li><li> Machen Sie einen 1,0 cm langen Hautschnitt längs auf der Rückseite. Fahren Sie mit der Bauchdecke in einer 0,5 cm Längsschnitt geschnitten. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die Niere aus dem Bauch und halten die Niere Oberfläche feucht mit Tropfen steriler Kochsalzlösung. </li><li> Sanft Punktion der Nierenkapsel mit einem leeren 27-Gauge-Injektionsnadel. Eine sehr flache Punktion genügt. Diese werden, wo Sie Ihre stumpfen Nadel einsetzen, um Ihren zellularen Mischung injizieren. </li><li> Füllen Sie eine 28-Gauge-Nadel stumpf Spritze mit 10 ul Ihr Handy Mischung. Langsam legen Sie die Einstichstelle und dringen in die Nierenparenchyms um einen Bereich unterhalb der Nierenkapsel zu erreichen. Anschließend werden 10 ul der zellulären Mischung, um einen Bolus auf die Niere unter der Nierenkapsel zu bilden. Zurücknahme der Nadel. </li><li> Bringen Sie die Niere zur abdominal Hohlraum. Sichern Sie die Muskelschicht des Bauchfells mit 4-0 Nylonnaht. </li><li> Schließen Sie die Haut mit jeder Naht oder Grundnahrungsmittel. </li><li> Reinigen Sie das Blut aus der Haut mit steriler Kochsalzlösung. </li></ol> 4. Postoperative Analgesie und Überwachung <ol><li> Injizieren Sie das Tier mit Buprenorphin (0,1 mg / kg alle 12 h) oder Ketoprofen (3-5 mg / kg in Kochsalzlösung alle 12 h), um postoperative Schmerzen, und 1 ml 37 ° C zu halten Kochsalzlösung ip das Tier warmen verwalten und Austrocknung zu verhindern. </li><li> Setzen Sie das Tier in einem Käfig sauber und legen Sie sie an einem milden Heizkissen. </li><li> Senden Sie die Tiere zurück zu Tierraum sobald sie das Bewusstsein wieder zu erlangen und sind innerhalb des Käfigs zu bewegen. </li><li> Beachten Sie das Tier täglich für unerwartete Anzeichen von Krankheiten und Infektionen für die folgenden drei Tage. Die Mäuse werden mit der Beobachtung von Aktivitäten in Käfigen einschließlich Zugriff auf Nahrung und Wasser 1 Tag postoperativ überwacht. Wenn die Mäuse weniger Aktivitäten anzuzeigen, ist Ketoprofen intraperitoneal adwieder einmal ein Tag diente. </li><li> Entfernen Sie die Haut Klammern oder Nähte 2 Wochen nach der Operation. </li><li> Xenograft Gewebe können bereits nach 8 Wochen nach der Operation entnommen werden. Xenografts können in vivo abgebildet werden mit Kleintier-Ultraschall (2A) und fixierten Geweben kann geschnitten und gefärbt für verschiedene Proteine ​​mittels Immunhistochemie (Abbildung 3). </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+prostate+tissue+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of human prostate tissue from embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 179-181 (2006).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> J. Steroid Biochem. 14, 1317-1324 (1981).</li>
<li>Cunha, G. R., Chung, L. W., Shannon, J. M., Taguchi, O., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+morphogenesis+and+growth%3A+role+of+mesenchymal-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Prog.+Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced morphogenesis and growth: role of mesenchymal-epithelial interactions.</a> Recent Prog. Horm. Res. 39, 559-598 (1983).</li>
<li>Staack, A., Donjacour, A. A., Brody, J., Cunha, G. R., Carroll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+urogenital+development%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mouse urogenital development: a practical approach.</a> Differentiation. 71, 402-413 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+male+urogenital+tract.+Role+of+androgens%2C+mesenchymal-epithelial+interactions%2C+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the male urogenital tract. Role of androgens, mesenchymal-epithelial interactions, and growth factors.</a> J. Androl. 13, 465-475 (1992).</li>
<li>Cunha, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+as+mediators+of+androgen+action+during+the+development+of+the+male+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Growth factors as mediators of androgen action during the development of the male urogenital tract.</a> World J. Urol. 13, 264-276 (1995).</li>
<li>Aboseif, S., El-Sakka, A., Young, P., Cunha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+reprogramming+of+adult+human+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal reprogramming of adult human epithelial differentiation.</a> Differentiation. 65, 113-118 (1999).</li>
<li>Marker, P. C., Donjacour, A. A., Dahiya, R., Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+control+of+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular control of prostatic development.</a> Dev. Biol. 253, 165-174 (2003).</li>
<li>Cunha, G. R., Sekkingstad, M., Meloy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse%2C+rat%2C+rabbit+and+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li>
<li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li>
<li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. , (2009).</li>
<li>Vander Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human%2C+rat%2C+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 637-646 (2006).</li>
<li>Prokhorova, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells+is+site+dependent+and+enhanced+by+the+presence+of+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel.</a> Stem Cells Dev. 18, 47-54 (2009).</li>
<li>Hameed, O., Sublett, J., Humphrey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+stains+for+p63+and+alpha-methylacyl-CoA+racemase%2C+versus+a+cocktail+comprising+both%2C+in+the+diagnosis+of+prostatic+carcinoma%3A+a+comparison+of+the+immunohistochemical+staining+of+430+foci+in+radical+prostatectomy+and+needle+biopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical stains for p63 and alpha-methylacyl-CoA racemase, versus a cocktail comprising both, in the diagnosis of prostatic carcinoma: a comparison of the immunohistochemical staining of 430 foci in radical prostatectomy and needle biopsy tissues.</a> Am. J. Surg. Pathol. 29, 579-587 (2005).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+prostatic+epithelial+model+of+hormonal+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis.</a> Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).</li>
<li>Yao, V., Parwani, A., Maier, C., Heston, W. D., Bacich, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+expression+of+prostate-specific+membrane+antigen%2C+a+tissue+differentiation+antigen+and+folate+hydrolase%2C+facilitates+prostate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Moderate expression of prostate-specific membrane antigen, a tissue differentiation antigen and folate hydrolase, facilitates prostate carcinogenesis.</a> Cancer Res. 68, 9070-9077 (2008).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal-epithelial+interactions+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of stromal-epithelial interactions in hormonal responses.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 417-434 (2004).</li>
<li>Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regeneration+of+murine+prostate+from+dissociated+cell+populations+of+postnatal+epithelia+and+urogenital+sinus+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, Suppl 1. 11896-11903 (2003).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Mol. Ther. 7, 827-838 (2003).</li>
<li>Anderson, J. S., Bandi, S., Kaufman, D. S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+%28hES%29+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24(2006).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt mit der Arbeit vorgestellt.

Tissue Rekombination unter Verwendung UGSM ist eine unglaublich nützliche Technik, um die Entwicklung der Prostata und die molekularen Ereignisse, die zu Prostatakrebs Einleitung zu untersuchen. Der induktive Potential UGSM hat für zahlreiche Anwendungen in der Forschung Prostata eingesetzt, dazu gehören die Verbesserung Tumor der Prostata-Zelllinien und Tumoren nehmen, Studium Stroma-Epithel-Wechselwirkungen und bilden cross-species Prostata Rekombinanten 7,17-20 richtige Vorbereitung von UGSM. jedoch ist en...

Es gibt einen enormen Bedarf für eine bessere menschliche Modellsysteme von Prostatakrebs. Insbesondere wäre relevanten menschlichen Modellsysteme von normalen, gutartigen Prostata-Gewebe, die genetisch manipuliert werden, um direkt zu erkennen, die Rolle von spezifischen Genen in der Einleitung von Prostatakrebs kann unglaublich informativ. Das Aufkommen der genomischen Ära hat zahlreiche Gene, die eine Rolle bei der Entstehung von Krebs haben können, identifiziert. Ein Mangel an experimentellen menschlichen Modellsystemen jedoch stark beeinträchtigt unsere Fähigkeit, funktionell zu testen und zu charakterisieren Kandidat Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene. Ein ideales Modellsystem wäre die rasche und schnelle funktionelle Analysen von Krebs Suszeptibilitätsgene in Kombination mit geeigneten transgenen Tiermodell zu erleichtern. Darüber hinaus würde eine solche menschlichen Modell zu ermöglichen molekulare Charakterisierung der Mechanismen der Signalisierung Prostatakarzinogenese zur Entdeckung und Validierung von neuartigen Therapien zurProstatakrebs verhindern Bildung. Menschliche embryonale Stammzellen (HES) bilden können menschliche Prostata-Gewebe als Xenotransplantate. 2006 Taylor, et al. Berichtet, dass HES induziert werden, um Prostata-Epithelzellen in vivo zu bilden, wenn mit Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) innerhalb eines Zeitraums von 8-12 Wochen wieder kombiniert werden. 1 Diese Studien wurden liegen vorangehende basierend das Cunha Labor zeigen, dass die Nager embryonalen UGSM fördern können Prostatahyperplasie Differenzierung von Stammzellen und embryonalen epithelialen Zellpopulationen in vivo. 2,3 Die Prostata entwickelt sich aus einer embryonalen anlagen bezeichnet die Sinus urogenitalis (UGS), und vor dem embryonalen Tag 17 (Maus E17 ; Tag E18 in der Ratte) die UGS kann entfernt werden und physisch aufgeteilt in Epithel (UGSE) und Mesenchym (UGSM) 4 Dieses Gewebe Rekombination Ansatz hat wesentlich unser Verständnis der Entwicklung und Prostata-Krebsentstehung, insbesondere verbessert.ly Wachstumsfaktor und hormonelle Signalwege und die molekularen Verhältnisse zwischen Prostata Stroma und Epithel. 5-8 Dieses Verfahren umfasst die ex vivo Kombination UGSM mit Stammzellen oder epithelialen Zellen aus den gleichen oder unterschiedlichen Arten und diese zellulären / Gewebe Rekombinanten implantiert gewachsen und Xenotransplantate innerhalb Mäusewirt. 4,9 Nach einer in vivo Wachstum enthält das Implantat Prostataepithelzellen Drüsenstrukturen in stromalen Gewebe eingebettet. Weitere Färbung durchgeführt werden, um festzustellen, ob solche Strukturen wirklich Prostata und des menschlichen Ursprungs sind. 10,11

<table><tbody><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GIBCO</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>R1881</td><td>Sigma</td><td>965-93-5</td><td>Mischen auf 1 μg/ml in Ethanol (1.000x Lagerbestand)</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Solution</td><td>GIBCO</td><td>15070</td><td>100x Lagerbestand</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>KETASET (Ketaminhydrochlorid) </td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>100 mg/ml; 1:10 in steriler Kochsalzlösung verdünnen </td></tr><tr><td>AnaSed (Xylazin) </td><td>VET-A-MIX, Inc.</td><td>NADA 139-236</td><td>20 mg/ml; verdünnt 1:10 in steriler Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BD Biosciences</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase </td><td>Sigma</td><td>C2014</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen </td><td>Fort Dodge</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td>100 mg/ml; verdünnt 1:1.000 in steriler Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Altalube Augensalbe </td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td><td>NLC 56641-19850</td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ16 F Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Jedes gute Präparierfernrohr kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Hamilton</td><td>84855</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Nadel, Small RN, 28 Gauge, 0,5 Zoll, Point Style #3 (Blunt)</td><td>Hamilton</td><td>7803-02</td><td>Custom </td></tr><tr><td>Needle Ethanol Prep Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mullpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Naht (4-0 FS-2)</td><td>MedVet International</td><td>J392H</td><td>Auflösbares Nahtmaterial mit Nadel Autoclip </td></tr><tr><td>9 mm Wundclips</td><td>Becton Dickenson</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>PVP Jod-Vorbereitungspads</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-98</td><td></td></tr><tr><td>Dissektorschere mit stumpfem Ende</td><td>Fine Science Tools</td><td>14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette mit feiner Spitze</td> Fein <td> Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter mit Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

formation of human prostate epithel mit tissue rekombination von nagetier urogenitalsinus mesenchym und menschlichen stammzellen

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Die Fortschritte bei der Prostatakrebs-Forschung ist stark durch die Verfügbarkeit von Menschen stammenden und Hormon-naiven Modell-Systeme, die unsere Fähigkeit zur genetischen und molekularen Ursachen Prostata-Erkrankungen Einleitung verstehen begrenzen begrenzt. Gegen die Entwicklung besserer Modellsysteme für das Studium der menschlichen Prostata-Krebsentstehung, haben wir und andere Vorteile der einzigartigen Pro-Prostata-induktiven Potenzial von embryonalen Nagetier Prostata Stroma genommen, genannt Sinus urogenitalis Mesenchym (UGSM). Wenn bestimmte pluripotenten Zellpopulationen wie embryonalen Stammzellen rekombiniert induziert UGSM die Bildung von normalen menschlichen Prostata-Epithelzellen in einem Testosteron-abhängigen Weise. Solch ein Modell menschlichen System kann verwendet werden, um zu untersuchen und experimentell testen die Fähigkeit der Bewerber Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene in beschleunigtem Tempo im Vergleich zu typischen Nagetier transgenen Studien werden. Seit Menschliche embryonale Stammzellen (hES) können in Kultur genetisch modifiziert werden using induzierbare Genexpression oder siRNA knock-down-Vektoren vor Gewebe Rekombination erleichtert ein solches Modell Testen der funktionalen Folgen der Gene oder Kombinationen von Genen, die vermutlich fördern oder Vorbeugung einer Karzinogenese verwendet werden. Die Technik der Gewinnung von reinem Populationen UGSM Zellen, jedoch ist eine Herausforderung und Lernen erfordert oft jemand mit früheren Know-how, um persönlich zu unterrichten. Darüber hinaus kann der Impfung Zellgemischen unter der Nierenkapsel eines immungeschwächten Gastgeber technisch anspruchsvoll. Hier beschreiben wir veranschaulichen und ordnungsgemäße Isolierung UGSM von Nagetier Embryonen und Nierenkapsel Implantation von Gewebe Mischungen menschlichen Prostata-Epithel zu bilden. Ein solches Vorgehen, bei ihrer aktuellen Phase, erfordert in vivo xenografting von embryonalen Stammzellen; zukünftige Anwendungen könnten in vitro Drüse Bildung oder die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzell-Populationen (iPS) umfassen.

Aufbauend auf den spannenden Bericht von Taylor et al. Hat unser Labor eine engrafting Protokoll über die gängigen H1 (NIH-designated WA01, genetisch männlich) mit menschlichen embryonalen Stammzellen Linie. 1 Diese Linie wurde konsequent für die Qualitätskontrolle getestet und entwickelt ist karyotypisch normalen 13 Wenn kultiviert angemessen, hES-Zellen aufrechterhalten, ausgebaut und kryokonserviert in einem undifferenzierten und pluripotenten Zustand mit einem Feeder-freie Kultur-Metho...

Um zu entwirren die frühesten molekularen Mechanismen Prostatakrebs Initiation, neuartige und innovative menschlich Systeme und Ansätze dringend benötigt werden. Das Potenzial der pre-Prostata Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) an pluripotenten Stammzellen Zellpopulationen induzieren die menschliche Prostata-Epithel zu bilden ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Prostata experimentellen Forschung.

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, urogenitale Sinus-Mesenchyme oder UGSM von Nagetierembryonen zu isolieren und Gewebemischungen in die Nierenkapsel zu implantieren, die humanes Prostataepithel bilden können. Dies wird erreicht, indem zunächst der urogenitale Sinus von Maus- oder Rattenembryonen isoliert wird. Anschließend wird das urogenitale Sinus-Mesenchym vom Epithel getrennt.Anschließend werden Einzelzell-Suspensionen des urogenitalen Sinus-Mesenchyms mit pluripotenten Stammzellen kombiniert. Schließlich wird das Zellgemisch unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus implantiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass sich auf der Mausniere humanes Prostataepithel gebildet hat, wie durch die Validierung der human-spezifischen PSA-Expression bestätigt wird.Obwohl diese Methode Einblicke in die Prostatafunktion und die Initiation von Erkrankungen ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Xenotransplantate menschlicher Prostatatumoren und die Induktion wöchentlich tumorbildender Zelllinien zur Tumorbildung. Nach der Tötung einer zeitlich bestimmten trächtigen Maus oder eines Rattens und der Isolie

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In diesem Video demonstrieren wir die Kultivierung von isolierten Prostata-Epithelzellen der Maus mit einer auf Matrix-Gel-Ringen basierenden Kulturtechnik. Dieser Ansatz kann ergänzende Informationen über die Differenzierungsfähigkeit von Prostataepithelzellen zur Bildung von 3D-Drüsenstrukturen als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Manipulation liefern.

Prostata-Organoid-Assay: Eine auf Matrixgel-Ringen basierende Ex-vivo-Kulturtechnik zur Untersuchung der Differenzierungsfähigkeit von Prostata-Epithelzellen

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Dissektion des Urogenitalsystems oder UGS an einem männlichen Mausmodell. Dieses UGS wird ex vivo weiter präpariert, um die Prostata zu isolieren und ihre Rolle bei der Entstehung von Prostatakrebs zu untersuchen.

Extraktion der Prostata aus dem Urogenitalsystem der Maus: Eine Technik zur Trennung der Prostata von anderen Organen des Harn- und Genitalsystems bei männlichen Mäusen

Wir beschreiben die Herstellung von Druckhormonpellets sowie subkutane chirurgischen Implantation in Mäuse. Diese Strategie kann mit dem Wachstum von Zellen und Geweben Xenotransplantate unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen ohne Thymus hormonelle Regulation der Karzinogenese und der gutartigen Prostatawachstum zu beurteilen kombiniert werden.

Nierenkapsel Xenografting und subkutane Implantation Pellet für die Beurteilung von Prostata-Karzinogenese und benigne Prostatahyperplasie

Dieses Protokoll beschreibt die Dezellularisierung von Sprague-Dawley-Rattennieren durch antegrade Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem, wodurch azelluläre extrazelluläre Nierenmatrizen entstehen, die als Vorlagen für die Wiederbestückung mit menschlichen Nierenepithelzellen dienen. Die Rezellularisierung und Verwendung des Resazurin-Perfusionsassays zur Überwachung des Wachstums wird in speziell entwickelten Perfusionsbioreaktoren durchgeführt.

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle für Prostata-Mikrodissektion und chirurgische Kastration im Labor Maus. Wir zeigen auch Vertreter von diesen Protokollen erzeugt Ergebnisse. Schließlich diskutieren wir die Vorteile und die Nutzung dieser Protokolle.

Murine Prostata Micro-Dissektion und chirurgische Kastration

Gentechnisch veränderte Mäuse sind nützliche Modelle für die Untersuchung von Prostata-Krebs-Mechanismen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Identifizierung und sezieren Prostate Lappen aus einer Maus Urogenitales System, basierend auf Histologie, zu unterscheiden und zu isolieren und als Sphäroide für nachgelagerte Analysen der primären Prostata-Zellen in Vitro Kultur.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um menschliche primäre Prostata organoide Handhabung führen dann empfehle Endpunkte zur Beurteilung der Phänotyp. Aussaat, Kultur Wartung, Wiederherstellung von Matrix Gel sind morphologische Quantifizierung, einbetten und schneiden, FFPE-Schnitt, ganz-Mount Färbung und Anwendung von kommerziellen Assays bezeichnet.

Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

Maus-Prostata-Organoide stellen einen vielversprechenden Kontext zur Bewertung von Mechanismen dar, die die Differenzierung regulieren. Dieses Papier beschreibt einen verbesserten Ansatz zur Etablierung von Prostataorganoiden und führt Methoden ein, um (1) Proteinlysat aus Organoiden zu sammeln und (2) Organoide für die konfokale Volltonmikroskopie zu fixieren und zu färben.

Bewertung der Differenzierungskapazität von Mausprostataepithelzellen mithilfe der organoiden Kultur

Tissue-Engineering-Implantate für die rekonstruktive Chirurgie kommen aufgrund der aufwendigen Ex-vivo-Kultivierung , die komplexe und teure Gerüstkomponenten umfasst, selten über präklinische Studien hinaus. Hier stellen wir ein einstufiges Verfahren vor, das für die Harnableitung konzipiert ist, mit einem zugänglichen röhrenförmigen Gerüst auf Kollagenbasis, das autologe Mikrotransplantate enthält.

Chirurgisches Modell für einstufige Tissue-Engineering-Urotheltuben bei Minischweinen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines auf Maus basierenden Prostataorganoidenmodells, das in 2D gezüchtet wurde. Dazu gehören Organoid-Dissoziation, Zellaussaatung, Differenzierung, Bewertung der Epithelintegrität und In-vitro-Infektionen mit uropathogenen Escherichia coli. Das Modell bietet apikale Zugänglichkeit und eignet sich für die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen, wodurch die Einschränkungen traditioneller 3D-Organoidsysteme überwunden werden.

Erstellung eines auf Prostataorganoiden basierenden Mausmodells zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen

Dieses Protokoll bietet eine optimierte Methode zur Isolierung der epithelialen Schleimhaut der adulten weiblichen Maus-Harnröhre für nachgelagerte Analysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunfärbung und Organoidkultur. Methoden führten zu angereicherten, lebensfähigen Harnröhrenepithelzellen, wie die Flowzytometrieanalyse, Whole-Mount-Bildgebung und effiziente Organoidbildung belegen.

Eine optimierte Methode zur Isolierung des weiblichen Harnröhrenepithels für Einzelzell- und Immunfluoreszenzanalyse

Erfahren Sie die Isolierung von UGSM aus Nagetierembryonen zur Bildung menschlicher Prostatepithelien durch Geweberekombination mit pluripotenten Stammzellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Prostatakrebs-Initiationsmechanismen.

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

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