Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Nagetier-Urogenital-, Sinusmesenchym- oder UGSM-Embryonen aus Nagetierembryonen zu isolieren und Gewebemischungen in die Nierenkapsel zu implantieren, die das menschliche Prostataepithel bilden können. Dies wird erreicht, indem zunächst der Sinus urogenitalis aus Maus- oder Rattenembryonen isoliert wird. Als nächstes wird das Mesenchym des Sinus urogenitalis vom Epithel getrennt.

Dann werden einzellige Suspensionen des Mesenchyms des Sinus urogenitalis mit pluripotenten Stammzellen kombiniert. Schließlich wird das Zellgemisch unter die Nierenkapsel einer Wirtsmaus implantiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass menschliches Prostataepithel auf der Mausniere durch Validierung der humanspezifischen PSA-Expression

Obwohl diese Methode Einblicke in die Prostatafunktion und die Krankheitsentstehung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Xenotransplantation von menschlichen Prostatatumoren und die Induktion wöchentlicher tumorogener Zelllinien zur Bildung von Tumoren. Nachdem Sie eine zeitgesteuerte trächtige Maus oder Ratte eingeschläfert und die Embryonen isoliert haben, trennen Sie sie vom Fruchtwassersack, durchtrennen Sie die Nabelschnur und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit eiskalten Strängen. Salzlösung ausbalancieren und auf Eis legen.

Legen Sie einen Embryo in eine 100-Millimeter-Petrischale und halbieren Sie ihn mit einer Schere auf Höhe des Bolus. Entfernen Sie den Magen und den Dünndarm und lokalisieren Sie dann die Eierstöcke des weiblichen Embryos, die sich an den verhätschelten Polen der Nieren oder den Hoden beim Mann auf Höhe der Blase befinden. Im Rahmen eines Sezierbereichs.

Schneide die Bauchdecke mit einer Venice-Schere durch, um die Blase und die hintere Wand des Bauches freizulegen. Befreien Sie den oberen Genitaltrakt von den Ansätzen und befreien Sie die Nabelschnur. Das Schambein durchtrennen und mit Dumont eine Pinzette mit feiner Spitze einsetzen.

Trennen Sie es stumpf von der Vorderwand des Sinus urogenitalis. Trennen Sie die hintere Wand der Höhle urogenitalis vom Enddarm und schneiden Sie die Sinus urogenitalis mit der Blase am unteren Ende durch. Trennen Sie dann die Blase vom Sinus urogenitalis.

Lagern Sie den Sinus urogenitalis und den Block in eiskaltem HBSS. Übertragen Sie den Sinus urogenitalis in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das 1% Trypsin in HBSS ohne Calcium und Magnesium enthält, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation das Trypsin entfernen und 10%FBS und DM A MF 12 Medium hinzufügen, um den Aufschluss zu neutralisieren.

Verwenden Sie als Nächstes eine Nadel oder eine Pinzette mit feiner Spitze, um die klebrige mesenchymale Hülle vorsichtig aus dem Epithelschlauch zu ziehen. Wenn der Epithelschlauch intakt bleibt, verringert sich die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination des Mesenchyms durch Epithelzellen. Dies kann dazu führen, dass sich Nagetierdrüsen zusammen mit dem aus Stammzellen gewonnenen menschlichen Drüsenepithel bilden.

Übertragen Sie das UGSM in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen mit DMM F 12-Medium, das 10 % FBS, 1 % Streptokokken, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren und einen Nanomolar enthält. R 1 8 81 Inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 über Nacht. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie das Gewebe bei 200 g. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie PBS, um das Pellet zu waschen.

Nach der Entnahme des PBS resuspendieren Sie das Gewebe in 0,2%Kollagenase in D-M-A-M-F 12 und inkubieren bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schaukeln eine Stunde lang, wirbeln Sie das Verdauungsgewebe dreimal kräftig vortexen, bis es zu einem homogenen Einzelzellgemisch wird, und neutralisieren Sie die Kollagenase durch Zugabe von D-M-A-M-F-12-Medium mit 10%FBS, 1%pen Streptokokken, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und einem nanomolaren R 1 8 81. Waschen Sie die Zellen dreimal, indem Sie sie bei 200 g pelletieren und in HBSS aufhängen. Zum Schluss reanimation, suspendieren Sie die mesenchymalen Zellen in DMM F 12 und verwenden Sie ein Hämozytometer, um sie zu zählen, um die Transplantation durchzuführen.

Nach der Vorbereitung eines sterilen Operationsbereichs und der Anästhesie einer männlichen athymischen Nacktmaus mit einer IP-Injektion von Ketamin-Xylazin gemäß dem Textprotokoll führen Sie eine Zehenkneifung durch, um den Grad der Sedierung zu bestätigen. Bereiten Sie die Maus chirurgisch vor, indem Sie die Operationsstelle bei Bedarf rasieren und sie mit drei abwechselnden Tüchern mit 70% Alkohol reinigen, gefolgt von Betadin-Lösung. Machen Sie nach dem Auftragen der Augensalbe einen einen Zentimeter langen Schnitt auf dem Rücken und schneiden Sie die Bauchdecke mit einem 0,5 Zentimeter langen Längsschnitt weiter durch. Drücken Sie die Niere vorsichtig aus dem Bauch und verwenden Sie Tropfen steriler Kochsalzlösung, um sie feucht zu halten.

Als nächstes stechen Sie mit einer 27-Gauge-Spritzennadel vorsichtig in die Nierenkapsel, um eine Injektionsstelle für die Zellmischung zu schaffen. Füllen Sie dann eine 28-Gauge-Spritzennadel mit 10 Mikrolitern Zellmischung und führen Sie sie langsam in die Einstichstelle ein, wobei Sie in das Nierenparenchym eindringen. Um einen Bereich unterhalb der Nierenkapsel zu erreichen.

Injizieren Sie 10 Mikroliter des Zellgemisches, um einen Bolus auf der Niere unterhalb der Nierenkapsel zu bilden, und ziehen Sie die Nadel zurück. Bringen Sie die Niere wieder in die Bauchhöhle zurück und sichern Sie die Muskelschicht des Bauchfells mit vier Nylonnähten. Verschließen Sie die Haut entweder mit Nähten oder Klammern und verwenden Sie sterile Kochsalzlösung, um das Blut von der Haut zu entfernen.

Hier ist ein Ultraschallbild eines wachsenden Xenotransplantats acht Wochen nach der Implantation zu sehen. Der eingekreiste Bereich stellt das Xenotransplantat auf der Nierenoberfläche dar. Diese Bilder zeigen das Wachstum von Xenotransplantaten auf der Nierenoberfläche.

Nach 12 Wochen bilden humane ES-Zellen, die in Abwesenheit des Sinus urogenitalis implantiert werden, ein großes Teratom, während das Mesenchym des Urogenitalsinus, das allein implantiert wird, keine erkennbare Struktur bildet. In der Mitte abgebildet. Die Panels dieser Abbildung sind repräsentative immunhistochemische Färbungen von aus Stammzellen gewonnenem humanem Prostataepithel im Vergleich zu adultem humanem Prostatagewebe.

Wie hier links gezeigt, enthalten die Drüsen eine AR-positive luminale Epithelschicht. Das ist ebenfalls PSA-positiv, eine P 63-positive Basalepithelzellschicht und seltenes Chromogranin. Als neuroendokrine Zelle sind die Drüsen kein Krebs, wie die negative A-M-A-C-R-Färbung bei der Wirtskastration zeigt.

Die AR PSA-positiven Luminalzellen sind nicht mehr vorhanden, was eine charakteristische Androgenabhängigkeit zeigt. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, dass das Mesenchym des Sinus urogenitalis vom Epithel mit großer Sorgfalt getrennt wird. Da es das urogenitale Sinusepithel kontaminiert, bildet es Drüsen und verfälscht möglicherweise Ihre Ergebnisse.