Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die vaskuläre Reaktivität einer resistenter Arterie der Maus unter nahezu physiologischen Bedingungen in vitro in Echtzeit zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein kleines Segment des Gefäßes auf zwei Mikrokatheter montiert und unter physiologischem intraluminalem Druck gehalten wird. Anschließend wird das Gefäß mit einem Alpha-1-Rezeptor-Agonisten, Phenylephrin, verengt, um die Fähigkeit eines Wirkstoffs, das Gefäß zu dilatieren, zu untersuchen.

Die Belastung des verengten Gefäßes mit Acetylcholin bewertet dessen Fähigkeit, in Echtzeit über einen endothelabhängigen Mechanismus zu dilatieren. Die Ergebnisse zeigen die prozentuale Änderung des Lumendurchmessers als Reaktion auf Acetylcholin und bestätigen, dass ein Mangel an SGC-alpha1 zu einer beeinträchtigten endothelabhängigen Vasodilatation führt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Draht-Mammographie besteht darin, dass die Druck-Mammographie die Charakterisierung kleiner Mikrogefäße ermöglicht, die im Vergleich zu größeren Leitgefäßen eine wichtigere Rolle bei der Aufrechterhaltung der Blutdruckhomöostase spielen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, wie beispielsweise die Hypertonie, bei der makroskopische Widerstandgefäße eine entscheidende Rolle spielen. Beginnen Sie damit, eine Maus mit Pentobarbital zu euthanasieren. Öffnen Sie nun die Bauchhöhle und beginnen Sie, das Mesenterium zu präparieren.

Identifizieren Sie nun eine Mesenterialarterie dritter Ordnung und isolieren Sie sie vom Bindegewebe und Fettgewebe. Die Unterscheidung zwischen Arterien und Venen auf der Ebene der Mikrogefäße ist problematisch, wenn sich kein Blut in den Gefäßen befindet. Daher ist dies am intakten Tier vorzuziehen.

Schneiden Sie anschließend ein zwei bis drei Millimeter langes Segment einer Mesenterialarterie dritter Ordnung zu und legen Sie es in eine Schale mit PSS-Puffer. Das arterielle Segment sollte keine Verzweigungen enthalten.

Bereiten Sie die Myo-Kammer vor, indem Sie die Kanülen über Einlass- und Auslassventile vorsichtig mit PSS-Lösung aus einer 10-Milliliter-Spritze füllen. Achten Sie darauf, dass ein übermäßiger Druck den empfindlichen an die Kanülen angeschlossenen Transducer beschädigen kann. Nachdem die Kanülen vollständig gefüllt sind, schließen Sie beide Ventile. Überführen Sie nun das isolierte arterielle Segment in die Kammer und montieren Sie ein Ende des Gefäßes auf die rechte Kanüle.

Sorgfältig mit einem feinen Nylonfaden unter Verwendung einer Spritze festbinden und das Gefäß über das Einlassventil mit Heap-Lösung füllen. Nun das andere Ende des Gefäßes auf die linke Kanüle aufsetzen und die Kanüle mit dem Nylonfaden am Gefäß befestigen. Die Kammer mit bis zu 10 Milliliter Heap-Lösung füllen.

Überprüfen Sie auf Leckagen, indem Sie vorsichtig die Pufferlösung über das Einlassventil mit Hilfe einer Spritze zuführen. Platzieren Sie nun die Kammer unter die Videokamera. Starten Sie die Sauerstoffzufuhr und erwärmen Sie die Kammer auf 37 Grad Celsius, während das Einlassventil geschlossen ist und mit dem Röhre P aus dem ersten Pufferlösungsreservoir verbunden bleibt.

Lassen Sie Blasen und Lösung durch das Rohr fließen, bis keine Blasen mehr im Rohr vorhanden sind. Öffnen Sie dann das Ventil. Schließen Sie sich mit Rohr P zwei an das linke Ventil der Kammer an.

Kommen Sie vom Druckregler und stellen Sie sicher, dass im gesamten System keine Blasen oder Leckagen vorhanden sind. Gehen Sie zum Druckmenü auf dem myo-Bedienfeld oder in der Software und schalten Sie die Pumpe ein, während Sie den Durchfluss ausschalten. Öffnen Sie das Programm und klicken Sie auf Sammeln.

Die Überwachung und Analyse des Lumendurchmessers und der Wanddicke des Gefäßes ist nun möglich. Um den intraluminalen Druck schrittweise zu erhöhen, wählen Sie den Druck P1 aus und geben Sie eine aufsteigende Druckreihe ein. Werte von fünf bis 60 Millimeter Quecksilbersäule. Gefäße verwinden oder kräuseln sich manchmal, während der Druck ansteigt, daher passen Sie die Spannung oder Dehnung entsprechend mithilfe eines vertikalen oder longitudinalen Mikropositionierers an.

Wenn der Druck bei 60 Millimetern und das Bad bei 37 Grad Celsius liegt, muss das Gefäß während der Einlaufphase mindestens 45 Minuten und bis zu einer Stunde lang equilibriert werden. Wechseln Sie die Bade­lösung einmal mit vorgewärmter Lösung. Nachdem der arterielle Abschnitt equilibriert ist, geben Sie 10 Milliliter Kaliumchlorid-Depolarisationslösung bei 37 Grad Celsius zu.

Die glatte Muskulatur wird sich vollständig depolarisieren und die maximale Kontriktion erreichen. Nach Erreichen einer stabilen Kontriktion spülen Sie das Bad dreimal im Abstand von jeweils 10 Minuten mit Heap-Lösung aus. Überprüfen Sie nun die Vitalität des Gefäßes und die Integrität des Endothels.

Zunächst verengen Sie das Gefäß, indem Sie Phenylephrin in einer Konzentration von 10⁻⁵ mol/L hinzufügen. Sobald eine stabile Verengung erreicht ist, erstellen Sie eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve für Vasodilatation, indem Sie nacheinander steigende Dosen von Acetylcholin von 10⁻⁹ bis 10⁻⁵ mol/L hinzufügen. Nach der letzten Acetylcholin-Dosis spülen Sie das Präparat dreimal im Abstand von jeweils 10 Minuten mit HEPES-Puffer aus.

Bestimmen Sie nun den passiven Lumendurchmesser, indem Sie PSS ohne Calcium, das zwei Millimol EGTA pro Liter enthält, anwenden und die aufgezeichneten Spuren auswerten. Messen Sie den Lumendurchmesser für jede Dosis-Wirkungs-Kurve, der zur Berechnung aller Parameter verwendet wird. Drücken Sie die Relaxationsantwort auf Acetylcholin als Vergleich zwischen der Behandlung mit dem Agonisten und dem calciumfreien Puffer in Bezug darauf aus, inwieweit jede Behandlung den Lumendurchmesser im Vergleich zur durch Phenylephrin hervorgerufenen Konstriktion verändert hat.

Mittels Druck-Myographie wurde die vaskuläre Relaxation als Reaktion auf Acetylcholin in mesenterialen Widerstandsarterien untersucht, die aus Wildtyp- und SGC-alpha1-Knockout-Mäusen der S6- und Black-6-Linie isoliert wurden und zuvor mit Phenylephrin präkonstriktiert worden waren. Ein Mangel an SGC-alpha1 war mit einer verminderten Fähigkeit des Acetylcholins, eine vaskuläre Relaxation hervorzurufen, assoziiert, unabhängig vom genetischen Hintergrund der untersuchten Mäuse. Die endothelabhängige Relaxation von SGC-alpha1-defizienten Mäusen war jedoch auf dem S6-Hintergrund stärker beeinträchtigt als auf dem Black-6-Hintergrund.

Zusammen deuten diese Befunde darauf hin, dass die verminderte Empfindlichkeit der Gefäße gegenüber endothelabhängiger Relaxation zur strullenspezifischen Hypertonie bei SGC-Alpha-1-Knockout-Mäusen beitragen könnte. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Neben diesem Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie gleichzeitig an lebenden Blutgefäßen durchgeführt werden. Dies würde beispielsweise die Messung intrazellulärer Eisenkonzentrationen ermöglichen, was zur Identifizierung zugrundeliegender Signalmechanismen beitragen kann.