Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Echtzeit-Gefäßreaktivität von Maus-resistenten Arterien in vitro unter nahezu physiologischen Bedingungen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem ein kleines Segment des Gefäßes auf zwei Mikrokanülen montiert und auf physiologischem luminalen Druck gehalten wird. Das Gefäß wird dann mit einem Alpha-Ein-Rezeptor-Agonisten Phenylephrin verengt, um die Fähigkeit eines Medikaments zur Erweiterung des Gefäßes zu untersuchen.

Die Auseinandersetzung des verengten Gefäßes mit Acetylcholin beurteilt seine Fähigkeit, sich in Echtzeit über einen endothelabhängigen Mechanismus zu erweitern. Die Ergebnisse zeigen die prozentuale Veränderung des Lumendurchmessers als Reaktion auf Acetylcholin und bestätigen, dass ein SGC-alpha-1-Mangel zu einer gestörten endothelabhängigen Vasodilatation führt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Drahtmamographie besteht darin, dass die Druckmamographie die Charakterisierung kleiner Mikrogefäße ermöglicht, die für die Aufrechterhaltung der Blutdruckhomöostase relevanter sind als größere Leitfähigkeitsgefäße.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, wie z. B. Bluthochdruck, bei dem makroresistente Gefäße eine entscheidende Rolle spielen. Beginnen Sie damit, eine Maus mit Pentobarbital einzuschläfern. Öffnen Sie nun die Bauchhöhle und beginnen Sie, das Mesenterialgewebe zu präparieren.

Identifizieren Sie nun eine Arteria mesenterica dritter Ordnung und isolieren Sie sie aus dem Binde- und Fettgewebe. Die Unterscheidung zwischen Arterien und Venen auf der Ebene der Mikrogefäße ist problematisch, wenn sich kein Blut in den Gefäßen befindet. Daher ist es vorzuziehen, dies am intakten Tier zu tun.

Schneiden Sie dann ein zwei bis drei Millimeter langes Segment der Mesenterialarterie dritter Ordnung ab und legen Sie es in eine Schale mit Haufen. PSS-Puffer. Das arterielle Segment sollte keine Verzweigungen aufweisen.

Bereiten Sie die Myokammer vor, indem Sie die Kanülen vorsichtig durch Einlass- und Auslassventile mit Haufen PSS-Lösung füllen. Beachten Sie bei einer 10-Milliliter-Spritze, dass ein zu hoher Druck den zerbrechlichen Schallkopf, der mit den Kanülen verbunden ist, beschädigen kann. Nachdem Sie die Kanülen fest gefüllt haben, schließen Sie beide Ventile. Übertragen Sie nun das isolierte arterielle Segment in die Kammer und montieren Sie ein Ende des Gefäßes auf die rechte Kanüle.

Binden Sie es vorsichtig mit einem feinen Strang Nylonnaht mit einer Spritze zusammen, spülen Sie es und füllen Sie das Gefäß über das Einlassventil mit Haufenlösung. Montieren Sie nun das andere Ende des Gefäßes auf die linke Kanüle und befestigen Sie die Kanüle mit der Nylonnaht am Gefäß. Füllen Sie die Kammer mit bis zu 10 Millilitern Haufenlösung.

Prüfen Sie, ob es ein Leck gibt, indem Sie die Haufenlösung mit Hilfe einer Spritze vorsichtig über das Einlassventil drücken. Platzieren Sie nun die Kammer unter der Videokamera. Starten Sie den Sauerstoff und heizen Sie die Kammer auf 37 Grad Celsius auf, während das Einlassventil geschlossen ist und mit dem P 1-Rohr aus dem ersten Haufenlösungsreservoir verbunden ist.

Lassen Sie alle Blasen und Lösungen durch das Röhrchen laufen, bis keine Blasen mehr im Röhrchen sind. Öffnen Sie dann das Ventil. Mit dem Schlauch P zwei an das linke Ventil der Kammer anschließen.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen oder Leckagen im gesamten System befinden. Gehen Sie zum Druckmenü auf dem Myo-Interface-Panel oder in der Software und schalten Sie die Pumpe ein, während Sie den Durchfluss ausschalten. Öffnen Sie das Programm und klicken Sie auf Sammeln.

Die Überwachung und Analyse des Gefäßlumens, des Gefäßdurchmessers und der Wandstärke ist jetzt möglich. Um den interluminalen Druck allmählich zu erhöhen, wählen Sie den Druck P eins und geben Sie eine Sequenz von aufsteigendem Druck ein. Werte von fünf bis 60 Millimetern von Quecksilbergefäßen verdrehen oder winden sich manchmal, während der Druck steigt, so dass die Spannung oder Dehnung mit Hilfe eines vertikalen oder längsseitigen Mikropositionierers entsprechend angepasst

Sobald der Druck bei 60 Millimetern und das Bad bei 37 Grad Celsius liegt, gleichen Sie das Gefäß mindestens 45 Minuten lang und während der Gleichgewichtszeit bis zu einer Stunde aus. Wechseln Sie die Badelösung einmal mit vorgewärmten Häufchen. Jetzt, da der arterielle Abschnitt ausgeglichen ist, tragen Sie 10 Milliliter Kaliumchlorid-Depolarisationslösung bei 37 Grad Celsius auf.

Die glatte Muskulatur wird vollständig depolarisiert und erreicht eine maximale Verengung. Nachdem Sie eine stabile Verengung erreicht haben, spülen Sie das Bad dreimal im Abstand von 10 Minuten mit Haufenlösung aus. Überprüfen Sie nun die Lebensfähigkeit des Gefäßes und die Integrität des Endothels.

Verengen Sie zunächst das Gefäß durch Zugabe von Phenylephrin, um die negativen fünf Mol pro Liter zu erreichen. Wenn eine stabile Verengung erreicht wurde, führen Sie eine kumulative Konzentrations-Vasodilatationsreaktionskurve durch sequentielle Zugabe von steigenden Acetylcholindosen von 10 auf die negative, neun auf 10 auf die negativen fünf Mol pro Liter nach der letzten Acetylcholindosis durch. Spülen Sie das Präparat dreimal im Abstand von 10 Minuten mit Häppchen ab.

Bestimmen Sie nun den passiven Lumendurchmesser, indem Sie calciumfreies PSS auftragen, das zwei Millimol EGTA pro Liter aus den aufgezeichneten Tracings enthält. Messen Sie den Lumendurchmesser für jede Dosiswirkung, der zur Berechnung aller Parameter verwendet wird. Äußern Sie die Acetylcholin-Relaxationsreaktion als Vergleich zwischen der Behandlung mit dem Agonisten und dem calciumfreien Puffer in Bezug darauf, wie stark jeder den Lumendurchmesser durch die Phenylephrin-induzierte Verengung verändert hat.

Die Zustandsdruck-Myographie wurde verwendet, um die Gefäßrelaxation als Reaktion auf Acetylcholin in mesenterialen Widerstandsarterien zu untersuchen, die aus Wildtyp- und SGC-alpha-1-Knockout-Mäusen auf dem S-Sechs- und Schwarz-Sechs-Hintergrund isoliert und mit Phenylephrin vorverengt wurden. Ein SGC-alpha-1-Mangel war unabhängig vom genetischen Hintergrund der untersuchten Mäuse mit der verminderten Fähigkeit von Acetylcholin verbunden, eine Gefäßentspannung zu induzieren. Die endothelabhängige Relaxation von SGC Alpha 1 Null-Mäusen war jedoch im S 6 Hintergrund deutlicher beeinträchtigt als im schwarzen sechs Hintergrund.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die verminderte Empfindlichkeit des Gefäßsystems gegenüber endothelabhängiger Entspannung zur stammspezifischen Hypertonie bei SGC Alpha One Knockout-Mäusen beitragen kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein oder zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie gleichzeitig an den lebenden Blutgefäßen durchgeführt werden. Dies würde beispielsweise die Messung intrazellulärer Eisenkonzentrationen ermöglichen, die helfen können, die zugrunde liegenden Signalmechanismen zu identifizieren.