Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, anderen Forschern zu zeigen, wie man die Nierenfunktion bei wachen Mäusen bestimmen kann. Dies wird erreicht, indem zunächst 24 Stunden lang Fluoresceinisothiocyanat oder FSE-Inulin dialysiert und die Konzentration für die Injektion bestimmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Maus zu wiegen, genaue Volumina von fitzy inulin für die retrobulbäre Injektion vorzubereiten und die Maus zu betäuben.

Als nächstes wird die Retrobulbar Fitzy Inulin-Injektion durchgeführt und acht Blutproben werden über einen Zeitraum von 75 Minuten entnommen. Der letzte Schritt besteht darin, Fitz Nulin mit einem Mikrovolumen-Fluorspektrometer zu messen und die Nierenfunktion mit Hilfe eines zweiphasigen exponentiellen Zerfallsmodells zu berechnen. Letztendlich ermöglicht die Kombination der Empfindlichkeit der Fiti Nulin Einzelbolus-Injektionsmethode mit der Mikrovolumenfähigkeit des Fluorspektrometers die Erkennung von Unterschieden in der Nierenfunktion, die durch genetische Veränderungen bei Mäusen, Ernährungsumstellungen oder Arzneimittelanwendungen verursacht werden.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie kontinuierlicher Infusion und anästhesierten Bedingungen, bei der Implantation von osmotischen Minipumpen mit radioaktivem Inulin besteht darin, dass keine Operation erforderlich ist. Es ist kein endgültiges Experiment. Es muss kein Urin gesammelt werden, und es ist möglich, bis zu 24 M pro Tag zu messen.

Ich werde dieses Verfahren zusammen mit Maria Azimo, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, zur Herstellung der Fitzy Nulin Injektionslösung demonstrieren. Wiegen Sie genug ZI-Inulin für zwei Milliliter einer 5%igen Lösung, lösen Sie das markierte Inulin in 0,85%iger Natriumchloridlösung auf, indem Sie es auf 90 Grad Celsius erhitzen, bis es sich vollständig aufgelöst hat. Legen Sie ein Stück 20 Zentimeter große Dialysemembran für 30 Minuten in doppelt destilliertes Wasser, um die restliche Natriumsäure von der Membran zu entfernen, spülen Sie die Membran danach einige Male, füllen Sie die Dialysemembran mit gelöstem fitzy inulin Dichtung ordnungsgemäß mit Verschlüssen und wiegen Sie dann die gesamte Membran.

Lassen Sie das gelöste fitzy Inulin in einem Liter 0,85%iger Natriumchloridlösung dialysieren und rühren Sie nach der Dialyse 24 Stunden lang langsam lichtgeschützt bei Raumtemperatur, wiegen Sie die gesamte Dialysemembran erneut und berechnen Sie die neue Konzentration. Wasser bewegt sich osmotisch in die Membran und ungebundenes FSI bewegt sich aus der Membran heraus. Dadurch nimmt die Konzentration von FSI-Inulin erheblich ab.

Berechnen Sie die neue Inulinkonzentration mit dieser Formel, wobei C die neue Konzentration ist. N ist die anfängliche Inulinmenge von E und V ist das neue Volumen, das sich aus der Gewichtsdifferenz der Dialyseschläuche vor und nach der Dialyse zuzüglich des Volumens der anfänglichen Inulinlösung ergibt. Als nächstes sterilisieren Sie die dialysierte Lösung durch Filtration durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter.

Denken Sie daran, fitzy Inulin immer vor Licht zu schützen, um Photobleiche vor dem Experiment zu vermeiden. Messen Sie das Körpergewicht der Mäuse, nachdem Sie die Mäuse kurz mit vier bis 5% ISO-Fluor betäubt haben. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie reflexartig zwei Mikroliter pro Gramm Körpergewicht dialysiertes fitzy nulin mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit einer halben Zoll langen 26-Gauge-Nadel aspirieren, um Luftblasen zu entfernen, und wechseln Sie dann zu einer halben Zoll langen 30-Gauge-Nadel für die Injektion.

Fahren Sie fort, das dialysierte fitzy Inulin in den retroorbitalen Plexus zu injizieren. Lassen Sie die Mäuse sich spontan in ihrem heimischen Käfig erholen. Fassen Sie einmal einen Millimeter Mausschwanz mit einer Schere und sammeln Sie Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der Injektion in Natrium-Heparin-Minikapillaren.

Verschließen Sie Mini-Kapillaren nach der Blutentnahme mit Cha Seal und halten Sie die Proben vor Licht geschützt. Legen Sie die versiegelten Mini-Kapillaren in die Hämatokritkapillaren und zentrifugieren Sie sie nach der Zentrifugation fünf Minuten lang. Brechen Sie die Mini-Kapillaren mit einem Diamantschneider auf und übertragen Sie das gesamte Plasma durch Pipettieren in ein 0,2-Milliliter-Röhrchen.

Machen Sie eine Verdünnung von eins bis 10, indem Sie zwei Mikroliter Plasma und 18 Mikroliter 0,5 Mol pro Liter Haufen in einem neuen 0,2-Milliliter-Röhrchen verwenden. Messen Sie anschließend zwei Mikroliter der verdünnten Probe mit dem NanoDrop 3, 300 in Duplikaten für einen hohen Durchsatz von sechs Mäusen. Bitte befolgen Sie das Flussdiagrammprotokoll im Textprotokoll zur Messung der GFR der gesamten Niere mit der Einzelbolus-Injektionsmethode: Acht Blutproben müssen 3, 5, 7, 10, 15, 56 und 75 Minuten nach der FSE-Nulin-Injektion entnommen werden.

In diesem Flussdiagramm geben die Zahlen die Entnahmezeitpunkte an, während die Zahlen in Klammern die Probennummer, die Zeitpunkte links von der vertikalen roten Linie angeben, die Injektionszeitpunkte anzeigen. Jede Maus ist mit einer anderen Farbe gekennzeichnet. Um sequentielle Blutentnahmen zu erhalten, folgen Sie den Pfeilen.

Graue Kästchen zeigen an, wann die nächste Maus vor der Injektion mit diesem Protokoll für die Fluoranästhesie vorbereitet werden muss. Die Mindestzeit zwischen zwei Blutentnahmen von verschiedenen Mäusen beträgt eine Minute verdünnte Fitzy Nulin-Injektionslösung mit verdünntem Mausplasma, um die im Textprotokoll aufgeführten Standardverdünnungen zu erhalten. Die Konzentration der Standards hängt von der Dialyse ab und ist bei jedem Präparat von FSI nulin immer unterschiedlich.

Daher ist es notwendig, jedes Mal die Konzentration für die Standardkurve einzugeben. Analysieren Sie die Daten, um die glomeruläre Filtrationsrate oder GFR mit geeigneter Software zu berechnen, indem Sie eine zweiphasige Exponentialzerfallsfunktion verwenden, wie sie im Textprotokoll zur Messung der GFR bei bewussten Mäusen ausführlich beschrieben ist. Die Plasmakinetik von ZI-Inulin nach einer intravenösen Einzeldosis-Injektion wird zur Berechnung der GFRA verwendet, das Zwei-Kompartiment-Modell wird im Zwei-Kompartiment-Modell verwendet.

Die anfängliche Phase des schnellen Zerfalls stellt die Umverteilung von fitzy Inulin aus dem intravaskulären Kompartiment in die extrazelluläre Flüssigkeit dar. Die spätere Phase mit einem langsameren Zerfall der fitzy Inulinkonzentration spiegelt überwiegend die systemische Clearance aus dem Plasma wider. Diabetes mellitus Typ 1 wurde durch intraperitoneale Applikation von Streptozotocin induziert.

Die GFR wurde vor und fünf Wochen nach Induktion von Diabetes Typ 1 bestimmt; diabetische Tiere zeigen deutlich eine glomeruläre Hyperfiltration. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die GFR bei großen Mäusen messen können, indem Sie eine einzelne Bolus-Injektionstechnik verwenden und ein zweiphasiges exponentielles DK-Modell verwenden.