Name: Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie ein Hochdurchsatz-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate bei wachen Mäusen mittels FITC-Inulin-Bolusinjektion und zweiphasigem exponentiellem Zerfallsmodell.

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Ich danke Dr. Jessica Dominguez Rieg für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), einem Carl W. Gottschalk Forschungsstipendium der amerikanischen Gesellschaft für Nephrologie, der National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Forschung ( P30DK079337) und das Department of Veterans Affairs.

1. Lösungen <ol><li> 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l ddH 2 O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / l HEPES pH 7,4 (59,6 g gelöst in 0,5 L HEPES ddH 2 0 und pH-Wert auf 7,4 mit 10 N NaOH). </li></ol> 2. Herstellung von FITC-Inulin Injektionslösung <ol><li> Wiegen FITC-Inulin eine 5% ige Lösung herzustellen und in 0,85% NaCl (in der Regel 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) aufgelöst durch Erwärmen auf 90 ° C bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Wiegen Sie gelösten FITC-Inulin-Lösung und Gewichtsangaben beachten. </li><li> Schneiden Sie ein 20 cm Stück Dialysemembran (molecular weight cut-off: 1.000) und in ddH2O für 30 min, um das restliche NaN 3 von der Membran zu entfernen und bündig ein paar Mal danach. </li><li> Füllen gelöst FITC-Inulin in Dialysemembran und Dichtung richtig mit Verschlüssen. </li><li> Wiegen gesamte Dialysemembran. </li><li> Legen Sie die Dialysemembran in 1 L 0,85% NaCl-Lösung und langsam rühren für 24 h bei ro-Licht geschütztom Temperatur. </li><li> Wiegen gesamte Dialysemembran wieder und berechnen Sie die neue Konzentration (Wasser osmotisch in die Membran und ungebundenen FITC verschieben oder gebunden FITC-Inulin &lt;1.000 Molekulargewicht bewegen wird aus der Membran, damit die Konzentration von FITC-Inulin wird erheblich verringern) . </li><li> Die neue FITC-Inulin-Konzentration (c) berechnet sich nach folgender Formel: c = n / V, wobei n = initial FITC-Inulin Menge, V = new Volumen (Unterschied im Gewicht von Dialyseschlauch vor und nach der Dialyse sowie Volumen der anfänglichen FITC-Inulin-Lösung). </li><li> Vor dem Gebrauch sterilisieren dialysierten FITC-Inulin Lösung durch Filtration durch ein 0,22 um Filter Spritze. </li><li> FITC-Inulin aus Licht (Aluminiumfolie) Halten bei 4 ° C geschützt Dialysiert und sterilisiert FITC-Inulin kann für bis zu 2 Wochen verwendet werden. Teilgenommen FITC-Inulin durch erneutes Erwärmen kann bei 90 ° C werden für ein paar Minuten gelöst. </li></ol> Hinweis: Wenn SieFITC-Sinistrin 16-18, die keine Dialyse können alle Schritte für die Dialyse erforderlichen übersprungen. 3. Injektions-und Blutentnahme <ol><li> Nehmen Körpergewicht (KG) der Mäuse vor dem Experiment. </li><li> Anesthetize Mäuse kurz mit Isofluran. </li><li> Für hohen Durchsatz von 6 Mäusen folgen Sie bitte Protokoll in Abbildung 3 vorgesehen. </li><li> Spritzen 2 ul / g bw dialysiertes FITC-Inulin in den Plexus retroorbitalen 24 durch die Verwendung eines G30 ½ in Nadel (entfernen Luftblasen aus 100 ul Hamilton Spritze indem Sie zuerst eine G26 ½ in Nadel-und dann der Wechsel zu einem G30 ½ in Nadel für Injektion). </li><li> Cut 1 mm von Maus Schwanz mit einer Schere einmal sammeln und Blut bei 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach der Injektion in Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries nach der Blutentnahme mit Cha-Siegel. </li><li> Die Proben vor Licht geschützt. </li><li> Setzen versiegelten minicapillaries innerhalb Hämatocrit Kapillaren und Zentrifuge für 5 min. </li><li> Brechen minicapillaries mithilfe eines Diamantschneiders und Transfer gesamte Plasma durch Pipettieren in einer 0,2-ml-Tube. </li><li> Machen Sie eine 1:10-Verdünnung mit 2 ul Plasma und 18 ul 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in neuen 0,2 ml Röhrchen (Proben konnten über Nacht bei 4 ° C gelagert werden für die Fluoreszenz-Messungen). </li><li> Maßnahme 2 ul verdünnte Probe mit NanoDrop 3300 in Duplikate. Die Beschreibung und die Nutzung des Instruments ist hier 5 beschrieben. </li></ol> 4. Herstellung von Standards <ol><li> Sammle Blut von Mäusen aus dem gleichen Hintergrund Stamm in Heparin beschichtet Hämatokritkapillaren, Spin-down und 1:10 verdünnen mit 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), in der Regel 80 ul Plasma + 720 ul HEPES. </li><li> Verdünnen FITC-Inulin Injektionslösung mit verdünnter Mäuseplasma folgende Standardverdünnungen erhalten: 01.10: 10 ul unverdünnt FITC-Inulin-Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:100: 10 &amp; mu; L (1:10) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:1000: 10 ul (1:100) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:2.000: 30 ul (1:1)-Lösung + 30 ul verdünnte Mäuseplasma 1:10.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma 1:20.000: 20 ul (1:1)-Lösung + 20 ul verdünnte Mäuseplasma 1:100.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma Die Konzentration der Standards auf der Dialyse abhängig und wird immer für jede Zubereitung von FITC-Inulin. Es ist notwendig, die Konzentration des Standard-Kurve immer wieder neu ein. </li><li> Analysieren von Daten zu GFR mit der entsprechenden Software (zB GraphPad Prism) berechnen durch Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Funktion wie in hier 15, 20 beschrieben und in Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. </li></ol>

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</ol>

Der Autor erhielt die Finanzierung der Kosten dieser Publikation von Thermo Fisher Scientific decken.

Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik zur Bestimmung der GFR in wachen Mäusen durch Single-Bolus-Injektion und Analyse von Fluoreszenz in 8 Blutproben mittels Zweiphasen-exponentiellen Abfall. Eine GFR Messung in 1 Maus dauert 75 min. Durch Verwendung eines speziellen Flussdiagramm, ist es möglich, die GFR von 6 Mäusen in 130 min zu messen. Es ist möglich, dieses Flussdiagramm-Protokoll bis zu 4 Mal pro Tag wiederholen und messen GFR in 24 Mäuse. Wir modifizierten diese Methode, so dass es möglich ist, Blut aus einem kleinen Schwanz snip anstatt Schwanzvene Punktion, die schneller und einfacher für Ermittler im Vergleich zu Schwanzvene Punktion durchzuführen sammeln. Durch die Verwendung von 10 ul Hämatokritkapillaren und einer 1:10-Verdünnung, ist es möglich, die gesamte Menge des Blutes benötigt, um &lt;100 ul zu reduzieren. Schließlich wird die Fluoreszenz gemessen mit einem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer, die Bestimmung der Fluoreszenz ermöglicht in 1-2 ul verdünnten Probe. Diese Methode wird dem interessierten investigatora wahre GFR Wert. Im Gegensatz dazu haben Kreatinin-Messungen bei Mäusen mehrere Schwachstellen, darunter &quot;Kreatinin-blinden Bereich&quot; und Schwierigkeiten im Zusammenhang mit spezifischen und sensitiven Bestimmung. Die &quot;Kreatinin-blinden Bereich&quot; schränkt seine Funktion als Marker für GFR weil Serum-Kreatinin bleibt im normalen Bereich bis 50% der Nierenfunktion 19 verloren. Da mehrere Forscher genetisch veränderte Mäuse in ihrer Forschung zu Nieren-Physiologie und Pathophysiologie studieren nutzen, trägt dies folgendes Problem: Annahme einer Knockout-Maus von Gen-X würde eine deutlich geringere GFR (um 40%) im Vergleich zu einer Wildtyp-Maus, eine haben einfache Screening durch Vergleich Plasma-Kreatinin würde nicht erkennen diesen Unterschied. Die Notwendigkeit für eine gute genaue Methode zur Bestimmung GFR wird immer kritischer, je kleiner die Unterschiede in GFR geworden. Mäuse haben hohe Konzentrationen von nicht-Kreatinin Chromagene in ihrem Plasma und Urin, die mit kommerziell störenverfügbar Kreatinin-Assays. Als Folge Assays, die auf der alkalischen picrate Jaffé Reaktion Überschätzung Kreatinin-Konzentration im Plasma bezogen sind mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Bestimmung 6, 13 verglichen. Eine weitere Einschränkung ist, dass Serum-Kreatinin ist unterhalb der Nachweisgrenze von mehreren kommerziell erhältlichen Assays im Vergleich zu HPLC-Bestimmung. Durch Verwendung von enzymatischen Reaktionen Ermittler konnten Plasma Kreatinin in Mäusen 10, 22 zu bestimmen. GFR in einem ähnlichen Bereich wurden in wachen Mäusen mit einem vergleichbaren Single-Bolus-Injektion Verfahren sowie Harn-FITC-Inulin-Clearance 14 gefunden. Im Gegensatz zu ihr Protokoll, unser Protokoll mit Schwanz snip erfordern keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um das Gefäß Integrität gegenüber Schwanzvene oder Vena saphena Punktion zu bewahren. Für den Harn / Plasma basierend FITC-Inulin-Clearance ist es notwendig, chirurgisch Implantat zwei osmotischen minipumps. Zwei Pumpen sind notwendig, um hoch genug Steady-State-Plasmaspiegel FITC-Inulin-Konzentrationen, die deutlich vom Hintergrund zu erzielen. Dies erfordert auch die Nutzung der metabolischen Käfigen für eine vollständige und zeitlich Urinsammlung. Die Käfige müssen zur Rechenschaft für einen Verlust von 25-37% des FITC-Inulin, die sonst tritt ohne Spülung gespült werden. Die Fallstricke der Verwendung dieses FITC-Inulin Verfahren sind begrenzt. Die Ermittler sollten Sie Folgendes beachten: (i) zu gewährleisten, dass es keine Luftblasen in der Spritze für die Injektion des FITC-Lösung verwendet wird, muss (ii) vollständige retrobulbären Injektion erreicht werden, weil die Menge eingespritzt bestimmt die GFR berechnet werden, und ( iii) Mäusen wird höchstwahrscheinlich urinieren während der 75 min GFR Experiment, so dass eine Verschmutzung Blutproben mit Urin, die eine sehr hohe FITC-Inulin Konzentration als Folge der Nieren Konzentrationsfähigkeit haben. Allgemeine Vorteile of diese FITC-Inulin Verfahren umfassen die folgenden: (i) es ist ein nicht-radioaktives Technik, (ii) es möglich ist, wiederholt Messungen mehrfach in der gleichen Maus, (iii) kann der Assay in wachen Mäusen durchgeführt werden ( iv) keine Urinsammlung erforderlich ist, und (v) eine Hochdurchsatz-Option verwendet werden. Nachteile für die einzelnen Bolus-Injektion sind die Notwendigkeit zur Dialyse von FITC-Inulin, das durch die Verwendung eines besser FITC-Marker, FITC-Sinistrin, die jetzt zur Verfügung steht und kann transkutan gemessen werden unter Verwendung eines speziellen miniaturisierten 18 überwunden werden können. Obwohl GFR gemessen wird, ist es nicht möglich, fraktionierte Ausscheidungen von Flüssigkeit oder Ionen mit dieser Methode zu messen. Zusammengenommen bietet dieses Verfahren die Machbarkeit eines High-Throughput-Verfahren zur Messung der GFR in wachen Mäusen. Daher könnte diese Technik von Interesse für andere Forscher, die daran interessiert bei der Bestimmung der Nierenfunktion bei Mäusen sein.

Die Geschwindigkeit der Bildung von Plasma-Ultrafiltrat am Glomerulus hat sich die Grundlage für die Beurteilung der Nierenfunktion (glomeruläre Filtrationsrate, GFR). Der ideale Marker GFR bestimmen sollte frei gefiltert werden, weder sezerniert oder resorbiert und nicht metabolisiert. Ein solches Verhalten wurde festgestellt, dass für Inulin wahr, und Inulin-Clearance hat sich eine Gold-Standard zur Bestimmung der GFR 3. Während die Clearance von Kreatinin wird weitgehend als ein Maß der GFR bei Menschen und Tieren eingesetzt werden, stellt Kreatinin erfüllen nicht die Anforderungen an ein ideales GFR-Marker. Rund 10 - 40% der Kreatinin-Clearance beim Menschen ist die Folge der aktive tubuläre Sekretion 1, 11, und die renale Sekretion von Kreatinin ist auch prominent in Mäusen und Ratten 4, 7, 9, 22. Nierenfunktionsstörung ist bekannt, dass die röhrenförmige Sekretion von Kreatinin, was deren Wert begrenzt als Marker der GFR 1, 2 erhöhen. Wir haben bereits, dass organisches Anion Transporter Isoform gezeigt3 (OAT3) trägt zur Maus Kreatinin-Sekretion 22. Jedoch Inulin-Clearance erfordert typischerweise die Verwendung von radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Die radioaktive Bestimmung von Inulin kann sowohl betäubt und wachen Mäusen verwendet werden, sondern birgt den Nachteil zahlreicher Sicherheitsvorschriften und Handhabung strenge Fragen bei der Verwendung radioaktiver Isotope. Entlang dieser Linien, sind chirurgische Clearance Vorbereitungen zur Bestimmung der GFR zeitaufwendig sowie Terminal in der Natur. 1999 Lorenz et al. 12 eingeführt FITC-Inulin als Marker der einzige Nephron GFR bei narkotisierten Mäusen. Fünf Jahre später Qi et al. Bestimmt ganze 15 GFR in wachen Mäusen mit FITC-Inulin. Alternative Protokolle sind jetzt mit FITC-Inulin als exogene Marker GFR in bewusste und narkotisierten Mäusen messen. Diese Protokolle behalten die Empfindlichkeit des radioaktiven Inulin mit Fluoreszenz DETECTIauf und umgeht die Nachteile der Zusammenarbeit mit einem radioaktiv markierten Marker. Die FITC-Inulin Assay wurde von anderen 7, 8 und uns 22, 23 modifiziert werden, um die Vorteile der Mikrovolumen Fähigkeit des NanoDrop 3300 Fluorospektrometer nehmen. Dies ermöglicht die Verringerung der gesamten Probenmenge benötigt, um &lt;100 ul Blut pro GFR-Messung. Mit dem Verfahren und Hochdurchsatz-Protokoll in dieser Veröffentlichung zeigen wir die Machbarkeit von Mess-GFR in bis zu 24 Mäuse pro Tag bewusst. Diese Technik könnte nützlich sein, um andere Forscher studieren Maus GFR und wir hoffen, dass es weniger genaue Methoden als Indizes für die Nierenfunktion, wie Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7706</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Webster Veterinär-</td><td>78366551</td><td></td></tr><tr><td>Dialysemembran (MWCO 1000)</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132636</td><td></td></tr><tr><td>Membranverschluss</td><td>Spectrum Laboratorien</td><td>132736</td><td></td></tr><tr><td>80 &mu; l Hämatokrit-Kapillaren</td><td>Drummond Scientific</td><td>22362566</td><td></td></tr><tr><td>Hämatokrit-Zentrifuge</td><td>IEC</td><td>Micro-MB</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Na+-Heparin Minicaps</td><td>Hirschmann</td><td>9000210</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (100 &mu; l)</td><td>Hamilton</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Fluorspektrometer</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 3300</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0,22 &mu; m)</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>880-26464-UE</td><td></td></tr><tr><td>Dichtstoff</td><td>Ch&#226;-Dichtung</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln (G26 &frac12; und G30 &frac12;)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305111 & 305106</td><td></td></tr></tbody></table>

ein high-throughput-verfahren zur messung der glomerulären filtrationsrate in conscious mäuse

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Die Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard in der Nierenfunktion Einschätzung. Zurzeit bestimmen Ermittler GFR durch Messen des Pegels des endogenen Biomarker Kreatinin oder exogen applizierten radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Kreatinin hat den wesentlichen Nachteil, dass proximalen tubulären Sekretion Konten für ~ 50% der gesamten Kreatinin-Ausscheidung und damit Kreatinin kein verlässlicher Marker GFR. Je nach Experiment durchgeführt, kann Inulin-Clearance durch eine intravenöse einzigen Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion (intravenös oder osmotische Minipumpe) bestimmt werden. Beide Ansätze erfordern die Sammlung von Plasma oder Plasma und Urin sind. Andere Nachteile von radioaktiv markierten Inulin enthalten sind die Nutzung von Isotopen, zeitaufwendig chirurgische Vorbereitung der Tiere, und die Forderung nach einer Terminal Experiment. Hier beschreiben wir eine Methode, die einen einzigen Bolus-Injektion von verwendetFluoreszeinisothiocyanat-(FITC) markiert Inulin und die Messung der Fluoreszenz in 1-2 ul verdünntem Plasma. Durch die Anwendung eines Zwei-Kammer-Modell mit 8 Blutsammlungen pro Maus, ist es möglich, in GFR messen bis zu 24 Mäuse pro Tag mit einem speziellen Workflow-Protokoll. Diese Methode erfordert nur kurze Isofluran-Narkose mit allen Blutproben in einer nicht-zurückhaltend und wach Maus gesammelt. Ein weiterer Vorteil ist, dass es möglich ist, Mäusen über einen Zeitraum von mehreren Monaten und Behandlungen (dh tun gepaart Experimente mit Veränderungen in der Ernährung oder medikamentöse Anwendungen) folgen. Wir hoffen, dass diese Technik von Mess-GFR nützlich für andere Forscher studieren Maus Nierenfunktion und weniger genaue Methoden zur Schätzung der Nierenfunktion, wie Plasma-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

GFR wird anhand der folgenden Formel berechnet werden: GFR = n / (A/K1 + B/K2), wo n = eingespritzte Menge (n = c • V, wobei c = FITC-Inulin Konzentration, V = injizierte Volumen) A = span1, der Beseitigung y-Achsenabschnitt K1 = Abklingkonstante zur Beseitigung B = span2, y-Achsenabschnitt der Verteilung K2 = Zerfallskonstante für den Vertrieb Hinweis: A, K1, K2 und B Abkürzungen von GraphPad Prism, jede Software geeignet zur Analyse von zwei Phase exponentiellen Abfall gegeben genutzt werden kann, aber auch andere wissenschaftliche Software können unterschiedliche Abkürzungen verwenden. Durch die Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Kurvenanpassung, die auf Plasma FITC-Inulin-Konzentrationen basiert, sollte eine Kurve vergleichbar mit der in Fig. 1 gezeigt ist, erhalten werden. Berechnung GFR durch die oben gezeigte Formel (und, wie hier beschrieben &lt;sup&gt; 20) ermöglicht eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion 15 oder glomeruläre Hyperfiltration 8, 23 zu erkennen als bei Mäusen mit Diabetes mellitus Typ 1 (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Abbildung 1. Um GFR in wachen Mäusen messen, Plasmakinetik von FITC-Inulin nach einer Einzel-Dosis intravenöse Injektion verwendet wird. Für die Berechnung der GFR wird ein Zwei-Kammer-Modell eingesetzt. In dem Zwei-Kammer-Modell stellt die anfänglichen schnellen Abklingphase Umverteilung von FITC-Inulin aus der intravaskulären Abteil der extrazellulären Flüssigkeit. Die späteren Phase mit langsamer Zerfall in FITC-Inulin Konzentration, vorherrschend spiegelt systemische Clearance aus dem Plasma. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Abbildung 2. Detection der diabetischen Hyperfiltration in Wildtyp-Mäusen. Typ I-Diabetes mellitus wurde durch intraperitoneale Anwendung von Streptozotocin (STZ, 50 mg / kg an 5 aufeinanderfolgenden Tagen). GFR wurde vor (basal) und 5 Wochen nach Induktion des Diabetes bestimmt. Aufgrund tubuloglomerulären Feedback bewirkt eine Zunahme der primären proximalen Resorption frühen diabetischen Hyperfiltration 21 ein Befund, der reproduzierbar ist in Wildtyp-Mäusen (n = 10, p &lt;0,01 vs basale gleichen Maus). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Abbildung 3. Flussdiagramm für die Messung der GFR in einem Satz von 6 Mäusen. Um ganze GFR durch den einzigen Bolus-Injektion Verfahren zu messen, muss 8 Blutproben bei 3, 5 gesammelt werden, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach FITC-Inulin Injektion. Die Zahlen geben Zeitpunkten. Die Zahlen in Klammern geben Stichprobengröße. Die Zeitpunkte der vertikale rote Linie links zeigen InjektionZeitpunkten (bei 0, 11, 22, 33, 44 und 55 min). Jede Maus wird mit einer anderen Farbe markiert. Um sequentielle Blutsammlungen bekommen folgen Sie den Pfeilen. Graue Felder zeigen an, wann die nächste Maus für Isofluran-Narkose vor der Injektion muss vorbereitet werden. Über dieses Protokoll die minimale Zeit zwischen 2 Blutentnahmen aus verschiedenen Mäusen ist 1 min.

Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, anderen Forschern zu zeigen, wie die Nierenfunktion bei wachen Mäusen bestimmt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst 24 Stunden lang Dialyse mit Fluoresceinisothiocyanat oder FSE-Inulin durchgeführt und dessen Konzentration für die Injektion bestimmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Maus zu wiegen, genaue Volumina von Fitzy-Inulin für eine retrobulbäre Injektion vorzubereiten und die Maus zu anästhesieren.Anschließend wird die retrobulbäre Fitzy-Inulin-Injektion durchgeführt, und acht Blutproben werden innerhalb eines Zeitraums von 75 Minuten entnommen. Im letzten Schritt erfolgt die Messung von Fitz Nulin mittels eines Mikrovolumen-Fluoreszenzspektrometers, und die Nierenfunktion wird anhand eines zweiphasigen exponentiellen Abklingmodells berechnet. Letztendlich ermöglicht die Kombination der Empfindlichkeit der Fiti-Nulin-Einzelbolusinjektionsmethode mit der Mikrovolumenmessung des Fluoreszenzspektrometers den Nachweis von Unterschieden in der Nierenfunktion, die durch genetische Modifikationen bei Mäusen, Ernährungsumstellungen oder die Gabe von Arzneimitteln verursacht werden.Die wichtigsten Vorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie kontinuierlicher Infusion, anästhetisierten Bedingungen, Implantation osmotischer Minipumpen und der Verwendung radioaktiver Inuline bestehen darin, dass kein chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Es handelt sich nicht um ein terminales Experiment. Es muss kein Urin gesammelt werden, und es ist möglich, bis zu 24 M pro Tag zu messen.Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Maria Azimo, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, demonstrieren, um die Fitzy-Nulin-Injektionslösung herzustellen. Wiegen Sie ausreichend ZI-Inulin für zwei Milliliter einer 5 %igen Lösung ab, lösen Sie das markierte Inulin in 0,85 %iger Natriumchloridlösung unter Erhitzen auf 90 Grad Celsius, bis es vollständig gelöst ist. Geben Sie ein 20 Zentimeter langes Dialysemembran 30 Minuten lang in zweifach destilliertes Wasser, um restliche Natriumsäure aus der Membran zu entfernen, spülen Sie die Membran anschließend mehrmals durch, füllen Sie das Dialysemembran mit der gelösten Fitzy-Inulin-Lösung, verschließen Sie es ordnungsgemäß mit Verschlüssen und wiegen Sie danach das gesamte Membran ab.Lassen Sie das gel&ouml;ste fitzy-Inulin in einem Liter 0,85&nbsp;%iger Natriumchloridl&ouml;sung dialysieren und 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam unter Lichtschutz r&uuml;hren. Nach der Dialyse wiegen Sie die gesamte Dialysemembran erneut und berechnen die neue Konzentration. Wasser bewegt sich osmotisch in die Membran hinein, und nicht gebundenes FSI tritt aus der Membran aus. Dadurch wird die Konzentration des FSI-Inulins erheblich abnehmen.Berechnen Sie die neue Konzentration des gereinigten Inulins anhand dieser Formel, wobei C die neue Konzentration, N die anfängliche Menge an gereinigtem Inulin und V das neue Volumen angibt, das sich aus der Gewichtsdifferenz des Dialyse-Schlauchs vor und nach der Dialyse sowie dem Volumen der anfänglichen Inulinlösung ergibt. Anschließend sterilisieren Sie die dialysierte Lösung durch Filtration über einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter.Denken Sie daran, fitzy-Inulin stets vor Licht zu schützen, um eine Photobleiche vor dem Experiment zu vermeiden. Nehmen Sie das Körpergewicht der Mäuse nach einer kurzen Anästhesie mit 4 bis 5 % ISO-Fluoran auf. Überprüfen Sie die Anästhesietiefe mittels Zehenreflex. Aspirieren Sie zwei Mikroliter pro Gramm Körpergewicht dialysiertes fitzy-Inulin mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze und einer halbzöllangen Nadel mit 26 Gauge, um Luftblasen zu entfernen, und wechseln Sie anschließend zu einer halbzöllangen Nadel mit 30 Gauge für die Injektion.Führen Sie die Injektion des dialysierten Fitzy-Inulins in den retroorbitalen Plexus durch. Lassen Sie die Mäuse in ihrem Heimkäfig spontan aus der Narkose aufwachen. Schneiden Sie mit der Schere einmal ein Millimeter Stück von der Mausschwanzspitze ab und sammeln Sie das Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der Injektion in Mini-Kapillarröhrchen mit Natriumheparin.Versiegeln Sie die Mini-Kapillaren nach der Blutentnahme mit einem Cha-Verschluss und schützen Sie die Proben vor Licht. Legen Sie die versiegelten Mini-Kapillaren in Hämatokrit-Kapillaren und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang gemäß der Zentrifugation. Brechen Sie die Mini-Kapillaren mit einem Diamantschneider auf und überführen Sie das gesamte Plasma per Pipette in eine 0,2-Milliliter-Röhrchen.Stellen Sie eine Verdünnung im Verhältnis 1 zu 10 her, indem Sie zwei Mikroliter Plasma und 18 Mikroliter 0,5 Mol pro Liter HEPES in einem neuen 0,2-Milliliter-Röhrchen verwenden. Messen Sie anschließend zwei Mikroliter der verdünnten Probe mit dem NanoDrop 3300 in Duplikaten, um eine hohe Durchsatzrate von sechs Mäusen zu erreichen. Befolgen Sie das im Textprotokoll bereitgestellte Flussdiagramm, um die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) des gesamten Niere mit der Einzel-Bolus-Injektionsmethode zu bestimmen; dazu müssen acht Blutproben 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 Minuten nach der Injektion von FSE-Nulin gesammelt werden.In diesem Flussdiagramm zeigen die Zahlen die Zeitpunkte der Probensammlung an, während die Zahlen in Klammern die Anzahl der Proben angeben. Die Zeitpunkte links der vertikalen roten Linie zeigen die Injektionszeitpunkte an. Jede Maus ist mit einer anderen Farbe gekennzeichnet. Um sequenzielle Blutproben zu erhalten, folgen Sie den Pfeilen.Graue Felder zeigen an, wann die nächste Maus gemäß diesem Protokoll für die Isofluran-Anästhesie vor der Injektion vorbereitet werden muss. Die minimale Zeit zwischen zwei Blutentnahmen von verschiedenen Mäusen beträgt eine Minute. Verdünnen Sie die Inulin-Injektionslösung mit verdünntem Mausplasma, um die im Textprotokoll aufgeführten Standardverdünnungen zu erhalten. Die Konzentration der Standards hängt von der Dialyse ab und ist bei jeder Herstellung von FSI-Inulin stets unterschiedlich.Daher ist es erforderlich, bei jeder Messung die Konzentration für die Standardkurve einzugeben. Analysieren Sie die Daten mithilfe geeigneter Software, um die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) anhand einer zweiphasigen exponentiellen Abklingfunktion zu berechnen, wie im Textprotokoll zur Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen ausführlich beschrieben. Die Plasmakinetik von ZI-Inulin nach einer einzelnen intravenösen Dosisinjektion wird zur Berechnung der GFR verwendet, wobei ein Zwei-Kompartiment-Modell angewandt wird.Die anfängliche schnelle Abklingphase stellt die Umverteilung von fitzy-Inulin aus dem intravasalen Kompartiment in die extrazelluläre Flüssigkeit dar. Die spätere Phase mit langsamerem Abklingen der fitzy-Inulin-Konzentration spiegelt hauptsächlich die systemische Clearance aus dem Plasma wider. Typ-1-Diabetes mellitus wurde durch intraperitoneale Applikation von Streptozotocin induziert.Die GFR wurde vor und fünf Wochen nach der Induktion von Diabetes Typ eins bestimmt; diabetische Tiere zeigen eindeutig eine glomeruläre Hyperfiltration. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die GFR bei großen Mäusen mittels einer Einzel-Bolus-Injektionstechnik und unter Verwendung eines zweiphasigen exponentiellen DK-Modells bestimmt.

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Forschung

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Biologie

Dieses Video zeigt die Flüssigkeitsaspiration von Mausglomeruli mit der Zwei-Photonen-vermittelten Mikropunktionstechnik. Die Technik ermöglicht den Zugang zu den Glomeruli der lebenden Maus und hilft so, Einblicke in die Nierenphysiologie zu gewinnen.

Flüssigkeitsaspiration aus Maus-Glomeruli: Eine Methode zum Aspirieren von glomerulärer Flüssigkeit aus der Maus mittels Zwei-Photonen-vermittelter Mikropunktur

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Physiology Lab Demonstration: glomeruläre Filtrationsrate in einem Ratten-

Die Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard zur Beurteilung der allgemeinen Nierenfunktion. Herkömmliche Verfahren zur Messung dieses Parameters sind jedoch umständlich und erfordern einen großen Zeitaufwand. Hier beschreiben wir eine schnellere und minimalinvasive Methode, um die GFR transkutan zu bestimmen.

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