Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung von Immunhistochemie an Biopsieschnitten der menschlichen Haut, um morphologische Veränderungen der intraepidermalen Nervenfasern, die mit schmerzhafter Neuropathie verbunden sind, durch dreidimensionale Bildgebung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein dreitägiges immunhistochemisches Protokoll mit schwimmenden Abschnitten an einzelnen Biopsieschnitten der menschlichen Haut durchgeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, 50 Mikrometer dicke Hautschnitte mit einem konfokalen Mikroskop abzubilden.

Als nächstes werden die Bilddateien der Flussansicht mit der MRS-Software ausgeführt, um eine dreidimensionale Filmdatei der ursprünglichen Immunfluoreszenzbilder zu erstellen. Der letzte Schritt besteht darin, die Filmdatei mit vdw-Software oder ähnlichem zu komprimieren. Letztendlich bieten dreidimensionale Bildgebungsergebnisse die Möglichkeit, morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit schmerzhafter Neuropathie zu untersuchen.

Gegenwärtig wird die intraop epidermale Nervenfaserdichte als quantitative Methode zur Diagnose der Neuropathie verwendet. Die Co-Markierung dieser intradermalen Nervenfasern mit dem nozizeptiven Biomarker hat das Potenzial, Aufschluss über die mit dieser Komplikation verbundenen Schmerzen zu geben. Das derzeitige zweidimensionale Bildgebungsprotokoll weist mehrere Einschränkungen auf, einschließlich der Überlappung von Nervenfasern.

Im Gegensatz dazu bietet die dreidimensionale Bildgebung die Möglichkeit zur weiteren Analyse morphologischer Veränderungen, die mit Neuropathie verbunden sind, wie z. B. axonale, Schwellung und Blanchierung, sowie zur Messung des axonalen Volumens. Es ist wichtig zu beachten, dass Maßnahmen ergriffen werden müssen, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, um aussagekräftige dreidimensionale Animationen zu erzeugen. Dass diese Methode einen Einblick in die schmerzhafte Neuropathie geben kann. Es kann auch auf andere Proben wie dicke Organkulturen oder dreidimensionale Zellkulturen angewendet werden, um komplexe Veränderungen in der dreidimensionalen Morphologie zu untersuchen und zu messen.

Nach dem Fixieren und Schneiden von menschlichen Hautbiopsien, wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben, wird eine 96-Well-Platte für die Färbung verwendet, wie in diesem Bild gezeigt. Geben Sie dann 150 Mikroliter Bild-ITFX-Signal in jede Vertiefung in Reihe eins der beschrifteten 96-Well-Platte und pipettieren Sie 150 Mikroliter eines XPBS in alle Vertiefungen in Reihe zwei und drei. Verwenden Sie eine Impfschlaufe, um einen 50-Millimeter-Schnitt aus der distalen Beinbiopsie eines Patienten in eine der Vertiefungen mit dem Bild zu übertragen.

Anschließend wird ein 50-Millimeter-Schnitt, der von den proximalen fünf desselben Patienten entnommen wurde, in die nächste Vertiefung mit dem Bild übertragen. Wiederholen Sie diese Prozedur mit den distalen Bein- und proximalen Oberschenkelschnitten von drei weiteren Patienten. Inkubieren Sie die Schnitte, bilde sie 30 Minuten lang auf einer flachen Wippe ab, während die Biopsieabschnitte im Bild inkubiert werden, bereite eine 5%ige Blocklösung vor und wirbele die Lösung ein, bis sich das BS A nach Ablauf der 30 Minuten vollständig aufgelöst hat.

Übertragen Sie die Abschnitte in Reihe zwei auf das PBS und schaukeln Sie 10 Minuten lang, gefolgt von einem 10-minütigen Spülen im PBS in Reihe drei. Wieder mit Schaukeln als nächstes pipettieren Sie 150 Mikroliter 5%BS, eine Blockierungslösung in jede Vertiefung der vierten Reihe und übertragen Sie die Schnitte in diese Vertiefungen, inkubieren Sie die Abschnitte in 5%iger BSA-Blockierlösung für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer flachen Wippe. Während dieser Inkubation wird eine 1%ige Spüllösung vorgewirbelt, bis sich die BSA vollständig aufgelöst hat, und dann die Primärantikörper auf die erforderliche Konzentration in dieser Lösung verdünnt.

Geben Sie dann 150 Mikroliter verdünnter Primärantikörper in die Vertiefungen in Reihe fünf der 96-Well-Platte. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Abschnitte aus der Blockierungslösung in die entsprechenden primären Antikörper-Wells überführt. Versiegeln Sie anschließend die Platte mit Param und Aluminiumfolie, um Austrocknung und Lichteinwirkung zu vermeiden, und inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer flachen Wippe, geben Sie 150 Mikroliter 1%ige BSA-Spüllösung in jede Vertiefung in den Reihen sechs, sieben und acht und führen Sie die Abschnitte eine Stunde lang durch diese Wäschen unter Schaukeln bei Raumtemperatur, wobei Sie sicherstellen, dass die Platte bei jedem Waschgang vor Licht geschützt ist, während die Die Abschnitte werden in der letzten Spülung von 1%BSA-Spüllösung inkubiert. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in einer 1%igen BSA-Spüllösung gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil der Protokolle.

Nach Ablauf der Inkubationszeit werden 150 Mikroliter verdünnter Sekundärantikörper in die dafür vorgesehenen Vertiefungen in Reihe neun der 96 Mikroantikörper gegeben. Well-Platte, übertragen Sie die Abschnitte in diese Wells und decken Sie die Platte mit Paraform und Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer flachen Wippe. Geben Sie am nächsten Tag 150 Mikroliter 1%ige BSA-Spüllösung in jede Vertiefung in den Reihen 10, 11 und 12 und spülen Sie die Abschnitte wie zuvor jeweils eine Stunde lang in dieser Lösung.

Während die Biopsieschnitte in der letzten Spülung mit 1 %iger BSA-Spüllösung inkubiert werden, bereiten Sie Objektträger vor, indem Sie jeweils 50 Mikroliter 1 %ige BSA-Spüllösung auf einen Objektträger pipettieren. Entfernen Sie den Schnitt aus der letzten Spülung und legen Sie ihn in den 50-Mikroliter-Tropfen 1%iger BSA-Spüllösung auf den dafür vorgesehenen Objektträger. Nachdem Sie die Position des Schnitts optimiert haben, entfernen Sie überschüssige 1%ige BSA-Spüllösung mit einer Kolbenglaspipette, wobei Sie Vorsichtsmaßnahmen treffen sollten, um eine Berührung der Probe zu vermeiden.

Geben Sie einen Tropfen verlängertes Gold-Einbettreagenz mit einem DPI in der Nähe der Biopsie auf den Objektträger. Nehmen Sie dann ein 22 x 22 Millimeter großes Mikroskopglas-Deckglas und legen Sie es vorsichtig über die Biopsie und den Tropfen des Einbettreagenzes. Entfernen Sie alle Luftblasen mit einer Pipettenspitze und wischen Sie überschüssiges verlängertes Gold ab.

Antifa-Reagenz. Wiederholen Sie dies für jeden Schnitt und lassen Sie die Objektträger am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Fluoreszierende Signale mit einem konfokalen Mikroskop abbilden, kommt hier ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop von Olympus flow view 500 mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv und zweifachem Zoom mit der Software flow view Version 5.0 zum Einsatz.

Verwenden Sie Alexa Etage 4 88 und Alexa Etage 6 47, um den 543-Nanometer-Helium-Neongrün-Laser bzw. den 633-Nanometer-Helium-Neonrot-Laser anzuregen. Stellen Sie die konfokalen Blenden für jeden Detektor auf 400 Mikrometer ein, um die Signale zu verbessern. Sequenzielle Scans sollten mit einer Auflösung von 10 24 x 10 24 durchgeführt werden.

Um die Signaltrennung zu maximieren, erfassen Sie dreidimensionale Z-Reihen mit Z-Schrittintervallen von 1,2 Mikrometern basierend auf der optimalen Scaneinheit, die von der Flow View-Software berechnet wird, wobei kalman zwei Frames bildet, die den ersten offenen Flow-View-Dateien in der MRSX 64-Software oder ähnlichem mitteln. Um die 3D-Bildsätze zu visualisieren, passen Sie die Anzeige nach Bedarf an, um den Kontrast des nervenspezifischen Signals zu verbessern. Erstellen Sie eine Oberfläche, um die dermale epidermale Grenze zu visualisieren.

Verwenden Sie das Konturwerkzeug im Zeichenmodus, um die Begrenzung zu zeichnen. Weisen Sie der Begrenzung eine halbtransparente Oberfläche zu, um die zugrunde liegenden Fluoreszenzsignale zu sehen und Standbilder der 3D-Fluoreszenzsignale aufzunehmen. Um Schnappschüsse des 3D-Films zu erstellen, verwenden Sie die Animationsfunktion, um eine 3D-Filmset-Animation zu erstellen, um Filme zu erstellen, die aus 200 Bildern bestehen, die mit 15 Bildern pro Sekunde animiert werden.

Speichern Sie jeden Film als rohe A VI-Datei, komprimieren Sie den endgültigen A VI-Film mit virtueller Synchronisationssoftware oder ähnlichem. Dieses Video zeigt 3D-Bilder von nozizeptiven intraepidermalen Nervenfasern. Dieses erste Bild zeigt PGP-positive intraepidermale Nervenfasern mit grüner Markierung, die die gesamten intraepidermalen Nervenfasern darstellen, und auch eine positive intraepidermale Nervenfaser mit roter Markierung, die nozizeptive intraepidermale Nervenfasern darstellt.

Und schließlich tauchte ein Bild auf, das PGP-positive nozizeptive intraepidermale Nervenfasern in einer Hautprobe aus dem ersten Fall zeigte, der Maßstabsbalken repräsentiert 20 Mikrometer. Das folgende Video zeigt 3D-Bilder von axonalen Schwellungen in intraepidermalen Nervenfasern schmerzhafter Neuropathien. Axonale Schwellungen, die durch Pfeilspitzen angezeigt werden, sind entlang der intraepidermalen Nervenfasern zu sehen, die mit PGP markiert sind, mit einem grünen Signal innerhalb des subdermalen Plexus.

In einer Hautprobe aus dem zweiten Fall stellt der Maßstabsbalken 10 Mikrometer dar. Dieses 3D-Bild zeigt axonale Verzweigungen in intraepidermalen Nervenfasern der schmerzhaften Neuropathie. Axonale Verzweigungen, die durch Pfeilspitzen angedeutet werden, sind entlang der intraepidermalen Nervenfasern, die mit PGP markiert sind, mit einem grünen Signal in einer Hautprobe aus Fall drei zu sehen.

Der Maßstabsbalken stellt 20 Mikrometer dar. Einmal gemeistert, kann diese Technik über vier Tage durchgeführt werden, dreieinhalb Stunden pro Tag für die Immunhistochemie und 35 Minuten pro Probe für die konfokale Bildgebung und 3D-Animation. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe ordnungsgemäß zu übertragen und zu montieren und Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um ein Reißen oder Zerreißen der Probenproben nach diesem Verfahren zu vermeiden. Andere Methoden, wie z.B. die dreidimensionale trimetrische Analyse zur Beurteilung der kutanen Innovation, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Spielt die Verzweigung der Bauchnervenfasern eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer schmerzhaften Neuropathie?