Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben
29. April 2013
Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Immunhistochemie an Schnitten menschlicher Hautbiopsien durchzuführen, um mithilfe der dreidimensionalen Bildgebung morphologische Veränderungen intraepidermaler Nervenfasern im Zusammenhang mit schmerzhafter Neuropathie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein dreitägiges Immunhistochemie-Protokoll für schwimmende Schnitte an individuellen Schnitten menschlicher Hautbiopsien durchgeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, 50 µm dicke Hautschnitte mittels konfokaler Mikroskopie abzubilden.
Anschließend werden die Durchflussansicht-Bilddateien mit der MRS-Software verarbeitet, um eine dreidimensionale Filmdatei der ursprünglichen immunfluoreszenten Bilder zu erstellen. Der letzte Schritt besteht darin, die Filmdatei mit der vdw-Software oder einer ähnlichen Software zu komprimieren. Letztendlich ermöglichen dreidimensionale Abbildungsergebnisse die Untersuchung morphologischer Veränderungen, die mit einer schmerzhaften Neuropathie assoziiert sind.
Derzeit wird die intraoperative epidermale Nervenfaserdichte als quantitative Methode zur Diagnose einer Neuropathie verwendet. Die gleichzeitige Markierung dieser intradermalen Nervenfasern mit dem Nozizeptions-Biomarker könnte Aufschluss über mit dieser Komplikation assoziierte Schmerzen geben. Das derzeitige zweidimensionale Bildgebungsverfahren weist mehrere Einschränkungen auf, darunter das Überlappen von Nervenfasern.
Im Gegensatz dazu bietet die dreidimensionale Bildgebung die Möglichkeit, morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit Neuropathie, wie axonale Schwellung und Blässe, weiter zu analysieren sowie das axonale Volumen zu messen. Es ist wichtig zu beachten, dass Maßnahmen ergriffen werden müssen, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, die aussagekräftige dreidimensionale Animationen ermöglichen, die Einblicke in schmerzhafte Neuropathien liefern können. Diese Methode kann außerdem auf andere Proben wie dicke Organkulturen oder dreidimensionale Zellkulturen angewendet werden, um komplexe Veränderungen in der dreidimensionalen Morphologie zu untersuchen und zu quantifizieren.
Nach der Fixierung und Einbettung von menschlichen Hautbiopsien gemäß dem schriftlichen Teil dieses Protokolls beschriften Sie eine 96-Well-Platte, die wie in diesem Bild gezeigt zur Färbung verwendet wird. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter Bild ITFX-Signal in jedes Well der ersten Reihe der beschrifteten 96-Well-Platte und pipettieren Sie jeweils 150 Mikroliter 1× PBS in alle Wells der zweiten und dritten Reihe. Verwenden Sie einen Inokulationsloop, um einen 50 Millimeter langen Abschnitt, der von der distalen Beinbiopsie eines Patienten stammt, in eines der Wells mit Bild zu überführen.
Überführen Sie dann einen 50 Millimeter langen Abschnitt aus dem proximalen Bereich desselben Patienten in die nächste Vertiefung, die Bild enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den distalen Unterschenkel- und proximalen Oberschenkelabschnitten von drei weiteren Patienten. Inkubieren Sie die Abschnitte in Bild bei Raumtemperatur auf einem flachen Schüttler für 30 Minuten. Während die Biopsieabschnitte in Bild inkubieren, bereiten Sie eine 5 %ige Blockierungslösung vor und wirbeln die Lösung, bis das BSA vollständig gelöst ist. Nach Ablauf der 30 Minuten fahren Sie fort.
Überführen Sie die Schnitte in die PBS in Reihe zwei und schwenken Sie 10 Minuten lang, gefolgt von einer Spülung in der PBS in Reihe drei für 10 Minuten. Danach pipettieren Sie erneut unter Schwenken 150 Mikroliter 5 % BSA-Blockierungslösung in jedes Loch der Reihe vier und überführen Sie die Schnitte in diese Löcher. Inkubieren Sie die Schnitte 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur auf einem flachen Schüttler in der 5 % BSA-Blockierungslösung. Während dieser Inkubation bereiten Sie die 1 %ige Spüllösung vor, indem Sie solange wirbeln, bis das BSA vollständig gelöst ist, und verdünnen anschließend die primären Antikörper in dieser Lösung auf die erforderliche Konzentration.
Fügen Sie dann 150 Mikroliter verdünnte primäre Antikörper in die Vertiefungen der fünften Reihe der 96-Loch-Platte hinzu. Nach Ablauf der Inkubationszeit überführen Sie die Schnitte aus der Blockierungslösung in die entsprechenden Vertiefungen mit primären Antikörpern. Versiegeln Sie die Platte anschließend mit Parafilm und Aluminiumfolie, um Austrocknung und Lichteinwirkung zu vermeiden, und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem flachen Schüttler. Am folgenden Tag geben Sie 150 Mikroliter 1 %-BSA-Spüllösung in jede Vertiefung der Reihen sechs, sieben und acht und führen die Schnitte unter Schütteln eine Stunde lang bei Raumtemperatur durch diese Waschschritte, wobei sichergestellt werden muss, dass die Platte während jedes Waschschritts vor Licht geschützt ist. Während die Schnitte in der letzten Spülung mit 1 %-BSA-Spüllösung inkubieren, verdünnen Sie die sekundären Antikörper gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil der Protokolle in 1 %-BSA-Spüllösung.
Nach Ablauf der Inkubationszeit 150 Mikroliter verdünnte sekundäre Antikörper in die vorgesehenen Vertiefungen der Reihe neun der 96-Loch-Platte geben, die Schnitte in diese Vertiefungen überführen und die Platte mit Paraform und Aluminiumfolie abdecken. Die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem flachen Schüttler inkubieren. Am nächsten Tag 150 Mikroliter 1 % BSA-Spüllösung in jede Vertiefung der Reihen 10, 11 und 12 geben und die Schnitte wie zuvor jeweils eine Stunde in dieser Lösung spülen.
Während die Biopsieschnitte in der letzten Spülung mit 1 % BSA-Spüllösung inkubieren, bereiten Sie die Objektträger vor, indem Sie jeweils 50 Mikroliter der 1 % BSA-Spüllösung auf einen Objektträger pipettieren. Entfernen Sie den Schnitt aus der letzten Spülung und legen Sie ihn in den Tropfen mit 50 Mikrolitern 1 % BSA-Spüllösung auf dem vorgesehenen Objektträger ab. Nachdem Sie die Position des Schnitts optimiert haben, entfernen Sie die überschüssige 1 % BSA-Spüllösung mit einer Glaspipette mit Gummibalg, wobei Sie darauf achten, die Probe nicht zu berühren.
Geben Sie einen Tropfen prolongiertes Gold-Anti-Fade-Montiermedium mit einem DPI nahe der Biopsie auf den Objektträger. Nehmen Sie dann einen 22 mal 22 Millimeter großen mikroskopischen Glasdeckel und legen Sie ihn vorsichtig über die Biopsie und den Tropfen Montiermedium. Entfernen Sie eventuelle Luftblasen mit einer Pipettenspitze und wischen Sie überschüssiges prolongiertes Gold ab.
Antifa-Reagenz. Wiederholen Sie dies für jeden Schnitt und lassen Sie die Objektträger am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Bilden Sie die fluoreszierenden Signale mit einem konfokalen Mikroskop ab; hier wird ein Olympus Flow View 500-Laser-Scanning-Konfokalmikroskop mit einer 40x-Ölimmersions-Objektivlinse und zweifacher Vergrößerung mithilfe der Flow View-Version-5.0-Software verwendet.
Verwenden Sie Alexa floor 4 88 und Alexa floor 6 47, um den 543 Nanometer Helium-Neon-Grün-Laser bzw. den 633 Nanometer Helium-Neon-Rot-Laser anzuregen. Stellen Sie die konfokalen Blenden für jeden Detektor auf 400 Mikrometer ein, um die Signale zu verstärken. Sequenzielle Aufnahmen sollten mit einer Auflösung von 10 24 mal 10 24 durchgeführt werden.
Um die Signalabtrennung zu maximieren, erfassen Sie dreidimensionale Z-Serien mit 1,2 µm Z-Schrittintervallen basierend auf der optimalen Scan-Einheit, berechnet durch die Flow-View-Software mit Kalman-Filterung und Mittelung von zwei Bildrahmen; öffnen Sie zunächst die Flow-View-Dateien in der MRSX 64-Software oder einer ähnlichen Software. Um die 3D-Bilddatensätze zu visualisieren, passen Sie die Anzeige nach Bedarf an, um den Kontrast des nervenspezifischen Signals zu verbessern. Erstellen Sie eine Oberfläche zur Visualisierung der dermo-epidermalen Grenze.
Verwenden Sie das Konturwerkzeug im Zeichenmodus, um die Grenze zu zeichnen. Weisen Sie der Grenze eine halbtransparente Oberfläche zu, um die darunterliegenden fluoreszierenden Signale sichtbar zu machen, und erstellen Sie Standbilder der 3D-Fluoreszenzsignale. Um Schnappschussbilder des 3D-Videos zu erzeugen, nutzen Sie die Animationsfunktion, um eine 3D-Filmsequenz-Animation zu erstellen, die aus 200 Einzelbildern besteht und mit 15 Bildern pro Sekunde animiert wird.
Speichern Sie jeden Film als eine unkomprimierte AVI-Datei und komprimieren Sie den endgültigen AVI-Film mit VirtualDub-Software oder einer ähnlichen Software. Dieses Video zeigt 3D-Bilder nozizeptiver intraepidermaler Nervenfasern. Dieses erste Bild zeigt PGP-positive intraepidermale Nervenfasern, die grün markiert sind und die Gesamtheit der intraepidermalen Nervenfasern darstellen, sowie TRPV1-positive intraepidermale Nervenfasern, die rot markiert sind und nozizeptive intraepidermale Nervenfasern repräsentieren.
Und schließlich das entstandene Bild, das PGP-positive nozizeptive intraepidermale Nervenfasern in einer Hautprobe des ersten Falles zeigt; die Maßstabsleiste entspricht 20 Mikrometern. Das folgende Video zeigt 3D-Aufnahmen axonaler Schwellungen in intraepidermalen Nervenfasern bei schmerzhaften Neuropathien. Axonale Schwellungen, die durch Pfeilspitzen markiert sind, sind entlang der durch PGP markierten intraepidermalen Nervenfasern mit einem grünen Signal im subdermalen Plexus sichtbar.
In einer Hautprobe aus Fall zwei entspricht die Maßstabsleiste 10 Mikrometer. Dieses 3D-Bild zeigt die axonale Verzweigung in intraepidermalen Nervenfasern bei schmerzhafter Neuropathie. Axonale Verzweigungen, die durch Pfeilspitzen markiert sind, sind entlang der intraepidermalen Nervenfasern sichtbar, die in einer Hautprobe aus Fall drei mittels PGP mit einem grünen Signal markiert wurden.
Die Maßstabsleiste entspricht 20 Mikrometern. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden, jeweils dreieinhalb Stunden pro Tag für die Immunhistochemie sowie 35 Minuten pro Probe für die konfokale Bildgebung und 3D-Animation. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe ordnungsgemäß zu übertragen und zu montieren, wobei Vorsichtsmaßnahmen zu beachten sind, um ein Reißen oder Zerreißen der Probengewebestücke zu vermeiden. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden wie die dreidimensionale Tric-Analyse zur Beurteilung der kutanen Innervation angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.
Hat die Verzweigung abdominaler Nervenfasern beispielsweise eine wichtige Rolle bei der Entwicklung schmerzhafter Neuropathien?
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die morphologischen Veränderungen nozizeptiver intraepidermaler Nervenfasern (IENFs) bei schmerzhaften Neuropathien (PN) mithilfe fortschrittlicher Bildgebungsverfahren. Durch die Anwendung einer dreidimensionalen Analyse zielt die Forschung darauf ab, Einblicke in die strukturellen Veränderungen der mit PN assoziierten IENFs zu gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunhistochemie
- Pathologie
Hintergrund
- Nozizeptive IENFs spielen eine entscheidende Rolle bei der Schmerzwahrnehmung.
- Veränderungen der IENFs sind mit verschiedenen neuropathischen Schmerzsyndromen assoziiert.
- Dreidimensionale Bildgebung kann das Verständnis der Nervenfasermorphologie verbessern.
- Aktuelle Methoden erfassen möglicherweise nicht vollständig die Komplexität der Veränderungen in IENFs.
Zweck der Studie
- Untersuchung der morphologischen Veränderungen der IENF bei PN.
- Entwicklung von Protokollen für die dreidimensionale Bildgebung der IENF.
- Bewertung des Potenzials dieser Methoden in der klinischen Forschung.
Verwendete Methoden
- Immunhistochemie an Schnittpräparaten menschlicher Hautbiopsien.
- Drei-Tage-Schwimmschnittprotokoll für Hautproben.
- Bildgebung von 50 Mikrometer dicken Schnitten mittels konfokaler Mikroskopie.
- Erstellung dreidimensionaler Videodateien mit MRS-Software.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche dreidimensionale Visualisierung der IENF.
- Identifizierung morphologischer Veränderungen im Zusammenhang mit PN.
- Verbessertes Verständnis von Nervenfaserveränderungen bei schmerzhaften Zuständen.
- Mögliche Anwendungen bei der Diagnose und Behandlung neuropathischer Schmerzen.
Schlussfolgerungen
- Dreidimensionale Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der IENFs.
- Die Ergebnisse könnten zu besseren Erkenntnissen über schmerzhafte Neuropathien führen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um die klinischen Implikationen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die dreidimensionale Abbildung nozizeptiver intraepidermaler Nervenfasern ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Validierung von Schmerzzielen, indem überlappende Strukturen aufgelöst werden, die eine 2D-Analyse erschweren. Dieser Ansatz unterstützt das phänotypische Screening neuropathischer Schmerzmechanismen durch quantitative morphologische Messgrößen wie axonale Schwellungen und Verzweigungen. Eine verbesserte Vorhersagesicherheit bezüglich der Zielstrukturen wird erreicht, indem strukturelle Veränderungen mit schmerzhaften Neuropathiephänotypen in für den Menschen relevanten Systemen verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung von nozizeptiven faserspezifischen Veränderungen in menschlichen Hautbiopsien.
- Operationaler Wert: Bietet biologische Entlastung durch direkte Visualisierung der Zielinteraktion in Schmerzbahnen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit durch Korrelation struktureller Biomarker mit Phänotypen schmerzhafter Neuropathien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem PGP und Trk A gleichzeitig gefärbt werden, um die gesamte von der nozizeptiven Innervation zu unterscheiden.
- Operativer Wert: Trägt zur Standardisierung des Assays bei, indem Konfokalmikroskopie und 3D-Rekonstruktionsprotokolle verwendet werden, die Überlappungsartefakte minimieren.
- Operativer Wert: Unterstreicht die Eignung für die Analyse, indem quantitative Messungen des axonalen Volumens, der Schwellung und der Verzweigung als phänotypische Endpunkte ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem morphologische Veränderungen menschlicher IENFs mit Mechanismen schmerzhafter Neuropathien verknüpft werden.
- Operativer Wert: Beschreibt den Fortschritt von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem ein für den Menschen relevantes Assay zur Zielmodulation etabliert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Konzentriert sich auf die prädiktive Entschärfung von Risiken, indem strukturelle Veränderungen identifiziert werden, die klinische Schmerzresultate vorhersagen könnten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung, indem sie eine strukturelle Phänotypisierung nozizeptiver Fasern in für den Menschen relevanten Hautbiopsien ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Signalwegen oder die biologische Risikominderung durch Visualisierung methode durch Visualisierung spezifischer Veränderungen in nozizeptiven Fasern unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Eignung des Assays, seine Reproduzierbarkeit oder quantitative Ausgabe, sofern durch den Artikel mittels 3D-Bildgebung immunfluoreszenzmarkierter Hautschnitte belegt.
- Analytik: Betont Messungen, Nachweise oder statistische Ergebnisse, die Teams bei der Vergleichbarkeit von Bedingungen unterstützen, einschließlich axonalem Volumen, Schwellung und Verzweigungsmetriken.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit präklinischer Kontinuität oder Biomarkerabgleich, nur wenn dies durch die Verwendung menschlicher Hautbiopsien zur Modellierung schmerzhafter Neuropathie im Quelltext belegt ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmaltechnik, durch standardisierte Färbungs-, Bildgebungs- und 3D-Rekonstruktionsabläufe.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeit.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Immunhistochemie, konfokaler Mikroskopie und 3D-Bildanalyse.
- Erforderliche instrumentelle und analytische Infrastruktur, einschließlich eines konfokalen Mikroskops mit Z-Abschnittsfunktion und Software zur 3D-Rekonstruktion.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Färbeprotokolle, Bildaufnahmeparameter und morphologischer Quantifizierung.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, wie beispielsweise dicke Organkulturen oder 3D-Zellkulturen zur Untersuchung komplexer morphologischer Veränderungen.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, einschließlich der Notwendigkeit hochwertiger Bildaufnahme für aussagekräftige 3D-Animationen sowie des zeitaufwändigen Charakters des Protokolls (über vier Tage).
