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Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Monozyten aus humanem peripherem Blut zu isolieren und sie in verschiedene Makrophagen-Polarisationstypen zu differenzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen des menschlichen peripheren Blutes durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. In einem zweiten Schritt wird die Isolierung negativer Kügelchen durchgeführt, um reine CD 14-positive Monozyten zu erhalten.

Anschließend werden Monozyten unter bestimmten Bedingungen kultiviert, um spezifisch polarisierte Makrophagen zu induzieren. Letztendlich kann die differentielle Expression von Makrophagen-Polarisationsmarkern als Reaktion auf ihre Kulturbedingungen durch quantitative PCR bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, die Differenzierung von Makrophagen in verschiedene Polarisationstypen zu entschlüsseln.

Eine Eigenschaft, die bei entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose äußerst wichtig ist. Nachdem Sie einem Freiwilligen 30 Milliliter Vollblut aus der Unterarmvene entnommen haben, teilen Sie das Blut gleichmäßig in zwei konische 50-Milliliter-Röhrchen ohne Polystyrol auf. Verdünnen Sie dann das Blut in jedem Röhrchen mit 10 Millilitern PBS.

Fügen Sie anschließend 25 Milliliter Histo-Packung zu den 25 Millilitern Vollblut und PBS in jedem Röhrchen hinzu und achten Sie darauf, dass sich die Histo-Packung und das Blut nicht vermischen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen dann 30 Minuten lang bei 400 g und Raumtemperatur ohne Pause. Nach dem Schleudern aspirieren Sie zunächst die Plasmaschicht und übertragen dann die undurchsichtige Grenzschicht in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die Zellen von der Grenzfläche in 20 Millilitern PBS plus CDTA für fünf Minuten bei 250 G und vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern PBS plus CDTA und mischen Sie die Zellen gut, indem Sie es 10 Sekunden lang vortexen. Verdünnen Sie nun 200 Mikroliter der Zellsuspension in 300 Mikrolitern PBS plus EDTA und 500 Mikrolitern Triamblau.

Um etwa 200 bis 500 Zellen pro 10 Quadrate zu erreichen, beginnt ein Hämozytometer die negative Isolierung, indem wir die Zellen dreimal für 10 Minuten bei 120 G herunterdrehen. Nach der zweiten Wäsche suspendieren wir das Pellet drei Sekunden lang in neun Millilitern sterilem Wasser. Fügen Sie dann nach dem Waschen und Zählen der Zellen noch einmal einen Milliliter von 10 XPBS hinzu und verdünnen Sie sie in leicht abbindendem Puffer bei fünfmal 10 der sieben Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie nun die Zellen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius in 50 Mikrolitern pro Milliliter Monozytenanreicherungscocktail.

In der letzten Minute des Inkubationswirbels perlt die Anreicherung der Cept-Monozyten 30 Sekunden lang. Geben Sie dann 50 Mikroliter pro Milliliter der Kügelchen zu den Zellen und inkubieren Sie die Kügelchen weitere fünf Minuten in Zellsuspension. Bringen Sie nach der zweiten Inkubation das Volumen der Zelllösung auf 2,5 Milliliter.

Mit mehr eep-Puffer erscheint die Lösung nun bräunlich. Legen Sie dann das Rohr für zweieinhalb Minuten bei Raumtemperatur in einen EEP-Magneten. Nachdem die kügelchengebundenen Zellen die Möglichkeit hatten, zu kleben, gießen Sie den Puffer mit den nicht bindenden Monozyten in ein frisches steriles Röhrchen.

Die Lösung erscheint nun weißlich, nachdem die ungebundenen Zellen einmal mit PBS plus EDTA gewaschen wurden, die Zellen in eine Multi-Well-Platte überführt und dann ein Milliliter Kulturmedium pro einmal 10 zu den sechs Zellen auf die Kulturplatte gegeben wurde. Kultivieren Sie die Zellen schließlich sechs Tage lang unter den interessierenden experimentellen Bedingungen, um die Makrophagendifferenzierung zu induzieren. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums nach drei Tagen durch ein neues Medium nach sechs Tagen.

Ernten Sie die Zellen für die gewünschte experimentelle Analyse. Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls werden etwa 25 mal 10 der sechs Monozyten routinemäßig aus 100 Millilitern Blutmonozyten gewonnen; die Reinheit, bestimmt durch durchflusszytometrische Färbung für CD 14, beträgt routinemäßig mehr als 95 %, wenn sie der Kultur zum ersten Mal zugesetzt wird. Die Monozyten sind zunächst rund geformt und schwimmen innerhalb weniger Stunden.

Sie haften jedoch an ihnen und sehen nach sechs Tagen wie ein Spiegelei oder eine Spindel aus. In Kultur mit MCSF allein oder unter Zusatz von oxidiertem LDL während der letzten 24 Stunden sind etwa 80 % der Zellen, die keinem oxidierten LDL ausgesetzt waren, lebensfähig, wie durch Propidiumiodid bestimmt. Die Färbebehandlung mit oxidiertem LDL hingegen führt nach sechstägiger Kultur zu einer Zellviabilität von etwa 70 %.

Bei der MCSF-Strömung zeigt die ZYTOMETRISCHE Analyse, dass die Zellen zwar weiterhin den Leukozytenmarker CD 45 ro exprimieren, den Monozytenmarker CD 14 jedoch herunterregulieren. Abhängig von den spezifischen Bedingungen, die die Polarisation von Makrophagen während der Zellkultur induzieren können, sind zusätzliche Marker erforderlich, um eine erfolgreiche Polarisation zu gewährleisten. Bestimmte Bedingungen können eine Makrophagenpolarisation induzieren.

Zum Beispiel exprimieren M1 polarisierte Makrophagen typische Marker wie IL six und TNF alpha, während M zwei polarisierte Makrophagen CD 36 und CD 2 0 6 exprimieren, Makrophagen können in funktionellen Experimenten weiter untersucht werden. So kann beispielsweise die Aufnahme von oxidiertem LDL mit fluoreszenzmarkiertem LDL untersucht werden. In diesem Experiment wurden die Zellen vier Stunden lang 10 Mikrogramm pro Milliliter DII-markiertem oxidiertem LDL ausgesetzt und die Zellkerne erneut mit dpi gefärbt

Das Histogramm zeigt die durchflusszytometrische Messung der DII-oxidierten LDL-Aufnahme durch MCSF-induzierte Makrophagen, wobei das durchgehende graue Histogramm die unbehandelten Kontrollzellen und das schwarze offene Histogramm darstellt. Repräsentiert die oxidierten LDL-behandelten Makrophagen Nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die Differenzierung und Heterogenität menschlicher Makrophagen zu untersuchen.

Damit können sie entzündliche Erkrankungen wie Atherosklerose untersuchen, um neue Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren.