Name: Trennung Plasmodium falciparum Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Lernen Sie die magnetische Trennung spätstadium-infizierter Erythrozyten bei Plasmodium falciparum. Diese Methode nutzt die paramagnetischen Eigenschaften von Hämozoin zur effizienten Isolierung mit nahezu 100%iger Reinheit.

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Diese Arbeit wurde gefördert durch Gewährung PRB-009 CS und ein Promotionsstipendium an LC, aus dem Secretaría Nacional de für Wissenschaft und Technologie (SENACYT), Panama.

Alle Schritte des Protokolls, mit Ausnahme Zentrifugationen, sollte innerhalb einer Haube zu halten die Probe steril erfolgen. Ein. Late Stage Isolierung von P. falciparum-infizierten Erythrozyten Alle späten Stadien von Plasmodium-infizierten Erythrozyten kann mit dieser Methode getrennt werden, da Hemozoin, die Paramagnetismus überträgt der Parasit, ist eine gemeinsame Metabolit zur Gattung. Eine hohe Parasitämie (3-10%) in der Kultur wird empfohlen, bessere Ausbeuten bei diesem Protokoll zu erhalten, obwohl eine typische Kultur 2-4% Hämatokrit (Volumenprozentsatz von roten Blutkörperchen) und 1-8% Parasitämie (Prozentsatz der infizierten enthalten wird rote Blutzellen). Parasiten können kultiviert wie durch Trager und Jansen 1 beschrieben. <ol><li> Eine einfache, mehrteilige Installation muss für jeden Schizonten Verfahren zur Isolierung montiert werden. Dafür LS Säulen, ein Magnetic MidiMACS Separator und eine MACS MULTISTAND von Miltenyi Biotec (Abbildung 1 </strong&gt;) verwendet. Zuerst bringen Sie den Magnetabscheider der Metall-Ständer und dann die magnetischen Säule auf dem Separator. </li><li> In einem separaten Röhrchen (verwenden Sie 50 ml Schrägen überall), mischen 23,2 ml RPMI 1640 und 750 ul von 7,5% Natriumbicarbonat, um die Arbeit Lösung zu schaffen. Zusätzliche Röhren an Hand zum Verwerfen und Sammeln der Durchströmung des Parasiten Kultur. </li><li> 3 ml der Arbeit auf die Säule zu äquilibrieren, und entsorgen Sie die Flow-Through in ein Rohr. </li><li> 8 ml des P. falciparum Kultur auf die Säule, um sicherzustellen, dass, sobald der letzte Teil der Arbeit Lösung wurde aus der Säule durch die Kultur geschoben wird das Aufnahmerohr durch das Sammeln von ein bis Gewinnung des ungebundenen Kultur beginnen ersetzt. Dies ist notwendig, um zu vermeiden Verdünnen der Kultur nicht weiter. </li><li> Sobald die Strömung der Kultur durch die Säule hat aufgehört, 1 ml der Arbeit Lösung, um die verbliebenen Erythrozyten Push aus der Säule. </li><li> Waschschritt: Hinzufügen weitere 3 ml der Arbeit auf die Säule und sammelt das strömende Flüssigkeit in den &quot;Discard&quot; Rohr zur Vermeidung Verdünnen der Kultur als Durchströmung in dem anderen Rohr gespeichert. </li><li> Elution: Sobald die 3 ml durch die Säule passiert haben, lösen diese aus dem Stand und legen Sie sie auf einer 15-ml-Tube. </li><li> Wieder, 3 ml der Arbeit auf die Säule. Dieser Schritt eluiert die Erythrozyten mit späten Stadium Parasiten, die in den Wülsten der Säule eingefangen wurden infiziert. </li></ol> Hinweis: An dieser Stelle, und je nach der Menge der Parasiten erforderlich, starten eine neue Runde / s für die Sammlung, natürlich in den Grenzen der Parasitämie in der ursprünglichen Kultur. Die Spalte können so lange wiederverwendet werden, da der Strom einen stationären Zustand aufrechterhält. <ol start="9"><li> Konzentration der gesammelten Parasiten: zentrifugieren 15 ml Röhrchen mit dem Eluat für 5 min bei 150 × g bei Raumtemperatureine dunkle Pellets aus befallenen Erythrozyten zu bilden. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, wobei genügend Flüssigkeit, um eine sehr kleine Probe nehmen und bestimmen die Konzentration und Gesamtertrag durch Mikroskopie (siehe Schritt 2 unten). </li><li> In diesem Moment, wenn die Isolierung und Erfassung von späten Stadium Parasiten zufriedenstellend durchgeführt wird, Inkubieren der Kultur gesammelt wieder mit frischen Medien. </li><li> Verdünnen Sie die gesammelten Parasiten im Volumen und die Lösung für weitere Versuche notwendig. </li></ol> 2. Reinheit und Ausbeute Analysis <ol><li> Überprüfen der Konzentration von Parasiten unter Verwendung eines Hämozytometers und Zählen unter einem Lichtmikroskop erzielt. Zu zählen, fügen Sie 10 ul der Mischung aus den gesammelten Parasiten und den Medien unter dem Deckglas des Hämozytometer. Zähle die Anzahl der Parasiten in den vier Quadranten des Hämozytometer und teilen die Gesamtzahl von 4. Multiplizieren Sie diese Zahl durch 10 4, um die Konzentration von infizierten E zu erhaltenrythrocytes pro ml enthält. </li></ol> Anmerkungen: a) Die Konzentration der Mischung wird durch den Benutzer im Moment des Resuspendieren des Pellets entschieden werden, indem mehr oder weniger Medium. Ein Vorschlag Arbeitskonzentration beträgt 5,5 X 10 4 schizontes pro ul (dies wird in der Regel durch Zugabe von 100-300 ul zu den gesammelten Parasiten erreicht). Wenn 20 ul dieser Konzentration auf ein Endvolumen von 100 ul Medienmix und Erythrozyten, eine Parasitämie von 1% in einer typischen 4% Hämatokrit Kultur zugegeben wird erhalten wird. b) Zählen unter dem Hämozytometer muss schnell sein, da die Erythrozyten lysiert, wenn die Probe trocken im Inneren der Kammer zu beginnen. Infizierten Erythrozyten, die die Mehrheit sein sollte, zeigen einen dunklen Fleck im Inneren, die sie aus dem nicht-infizierten. <ol start="2"><li> Führen Sie eine Dünnschicht-Giemsa-Färbung, um die Reinheit der Sammlung durch die Fixierung der Folien sehr schnell in 10% Methanol, Trocknen und Eintauchen t beurteilen,Saum in einer 20% Lösung von Giemsa mit destilliertem Wasser verdünnt Fleck. Flecken auf den Objektträger für 10 min, nach dem sie von der Luft getrocknet werden kann und unter dem Mikroskop untersucht. A Parasitämie deutlich über 70% erreichbar sein. </li></ol>

<ol><li>Jensen, J. B., Trager, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+in+culture%3A+use+of+outdated+erythrocytes+and+description+of+the+candle+jar+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method.</a> J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).</li>
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<li>Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+viable+schizont-infected+red+cells+of+Plasmodium+falciparum+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).</li>
<li>Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+cells+and+subcellular+particles+with+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).</li>
<li>Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+malaria-infected+erythrocytes+from+whole+blood%3A+use+of+a+selective+high-gradient+magnetic+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique.</a> The Lancet. 318, 70-71 (1981).</li>
<li>Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+concentration+of+malarial+parasite-infected+red+blood+cells+and+removal+of+contaminating+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells.</a> Malar. J. 3, 7(2004).</li>
<li>Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+separation+of+uninfected+erythrocytes+from+those+infected+with+Plasmodium+berghei+and+for+isolation+of+artificially+released+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Parasitenkd%22%5BJournal%5D)">A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites.</a> Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In-vitro-Kulturen des Malaria-Parasiten P. falciparum Parasitämie weisen eine begrenzte, mit mehr als der Hälfte der nicht infizierten Erythrozyten auf dem höchsten Punkt der Proliferation Kultur. Für die meisten Forschungs-Experimenten ist es wünschenswert, dass es nur mit den infizierten Erythrozyten. Zu diesem Zweck ist ein Trennverfahren notwendig, die Kultur nach der Infektion zu unterteilen. Nützliche Verfahren umfassen die Verwendung von Streptolysin O zu permeabilisieren und lysieren die nicht ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Hepes Geändert </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R4130 </td><td> Ergänzt mit 10% menschlichem Serum, 2% Glucose und 0,2% Natriumbicarbonat </td></tr><tr><td> MidiMACS Separator </td><td> MACS Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-302 </td><td></td></tr><tr><td> MACS MULTISTAND </td><td> MACS Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> LS Columns </td><td> MACS Miltenyi Biotec </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> Hämazytometer </td><td> GRAFCO </td><td> GRAFCO Neubauer Kammer </td><td> Kann durch viele andere Lieferanten gefunden werden </td></tr></tbody></table>

trennung<em&gt; plasmodium falciparum</em&gt; late stage-infizierten erythrozyten durch magnetische mittel

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Im Gegensatz zu anderen Plasmodium-Arten, P. falciparum kann im Labor, die ihre Studie 1 erleichtert kultiviert werden. Während die Parasitämie erreicht die ≈ 40%-Grenze erreichen kann, die Ermittler in der Regel hält der Anteil bei rund 10%. In vielen Fällen ist es notwendig, die Parasiten-haltigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) von den infizierten diejenigen, zu isolieren, um die Kultur zu bereichern und fahren Sie mit einem gegebenen Experiment. Wenn P. falciparum infiziert den Erythrozyten, verschlechtert sich die Parasiten und speist von Hämoglobin 2, 3. Allerdings muss der Parasit mit einem sehr giftig eisenhaltigen Häm-Einheit 4, 5 umzugehen. Der Parasit entzieht seiner Toxizität durch die Umwandlung der Häm in einem inerten Kristall Polymer namens haemozoin 6, 7. Diese eisenhaltigen Molekül in seiner Nahrungsvakuole gespeichert und das Metall in sich hat einen oxidativen Zustand, der sich von dem in Häm 8 unterscheidet. Die Eisen-III von Eisen in der Häm-ozoin verleiht es eine paramagnetische Eigenschaft fehlt in infizierten Erythrozyten. Da die eindringenden Parasiten Reife erreicht, der Inhalt haemozoin erhöht auch 9, die noch Paramagnetismus schenkt den letzten Stadien von P. falciparum Inneren der Erythrozyten. Basierend auf dieser paramagnetische Eigenschaft, die neuesten Stadien von P. falciparum infizierten Erythrozyten-Zellen können durch Passieren der Kultur über eine Säule mit magnetischen Kügelchen abgetrennt werden. Diese Perlen werden magnetisch, wenn die Spalten enthält sie auf einem Magnethalter gestellt werden. Infizierten Erythrozyten, die aufgrund ihrer Paramagnetismus, werden dann im Inneren der Säule eingefangen werden, während die Flow-Through enthält, zum größten Teil nicht infizierten Erythrozyten und solchen mit frühen Stadien des Parasiten. Hier beschreiben wir die Methodik, um die Bevölkerung der späten Phase Parasiten mit magnetischen Säulen, die gute Parasiten Lebensfähigkeit 10 hält bereichern.Nach Durchführung dieses Verfahrens kann das ungebundene Kultur in einen Inkubator zurückgegeben werden, damit die verbleibenden Parasiten weiter wachsen.

In Abbildung 2 wird das Kulturmedium durch den magnetischen Spalte gezeigt, vor (A) und nach dem Verfahren (B). Ein bis zwei infizierten Erythrozyten werden in der Regel auf einem 100-facher Vergrößerung Feld gesehen, wie in 2 gezeigt, wobei die Pfeile zeigen auf infizierten Erythrozyten in 2A. In einem typischen Verfahren, beginnend mit einem Kulturmedium mit 5% Parasitämie (2A), die Leistung dieses Verfahrens erzeugt ...

Die paramagnetischen Eigenschaften des Hämozoins werden verwendet, um späten Stadien der Isolierung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infiziert rote Blutkörperchen wachsen in der Kultur. Die Methode ist einfach und schnell und hat keinen Einfluss auf die nachfolgenden invasiven Fähigkeiten der Parasiten.

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

Plasmodium falciparum ist ein menschlicher Parasit, der ausschließlich innerhalb roter Blutkörperchen lebt. Während des Wachstums nutzt er die Moleküle der Erythrozyten als Nahrungsquelle. Da die Eisenmoleküle im Hämoglobin für den Parasiten toxisch wären, lagert er sie in einen inaktiven Kristall namens Hemin um. Dieser Hämokristall verleiht den Parasiten eine gewisse Paramagnetizität.Es ist diese paramagnetische Eigenschaft, die genutzt wird, um infizierte Erythrozyten von solchen zu trennen, die keinen Parasiten enthalten. Mithilfe eines Magneten kann eine Kultur mit einem sehr geringen Anteil an Parasiten angereichert werden, sodass nahezu hundertprozentige Parasitemie erreicht wird. Diese Trennung infizierter von nicht infizierten roten Blutkörperchen ist in einer Reihe von Experimenten äußerst vorteilhaft, bei denen ein bestimmtes Merkmal des Parasiten ohne die störenden Einflüsse überschüssiger Erythrozyten untersucht werden muss.Die hier gezeigte Methodik ist schnell, unkompliziert und für den Parasiten harmlos. Heute werden wir das Verfahren zur Trennung von Plasmodium falciparum im Chizen-Stadium beschreiben. Diese mehrteilige Ausrüstung muss für jede Isolationsmaßnahme n

separation-plasmodium-falciparum-late-stage-infected-erythrocytes

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung...

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Phagozytose-Assay mit markierten und opsonisierten Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten durch Monozyten. Die Durchflusszytometrie identifiziert die Fluoreszenz in Monozyten und bestätigt damit die erfolgreiche Identifizierung opsonisierter Erythrozyten durch Phagozytose.

Ein Assay zur Quantifizierung der Antikörper-vermittelten Phagozytose von parasiteninfizierten Erythrozyten

Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Humane microRNAs translozieren von Wirts-Erythrozyten zu Plasmodium falciparum-Parasiten. Im Folgenden werden die Techniken beschrieben, mit denen synthetische microRNAs in Erythrozyten des Wirts transfiziert und alle RNAs aus P. falciparum isoliert werden.  Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Polysomen in P. falciparum beschrieben, um die ribosomale Belegung und das translationale Potenzial von Parasitentranskripten zu bestimmen.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.

Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.

Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Anweisungen zu geben, wie die Kapazität von Antikörpern gemessen werden kann, die in Seren oder Plasma von Individuen vorhanden sind, die natürlich einer Plasmodium falciparum-Infektion ausgesetzt sind, um die Phagozytose der parasiteninfizierten Erythrozyten (IEs) zu opsonisieren und zu induzieren.

Messung natürlich erworbener Phagozytose-induzierender Antikörper gegen Plasmodium falciparum Parasiten durch einen Flow Cytometry-based Assay

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Lernen Sie die magnetische Trennung spätstadium-infizierter Erythrozyten bei Plasmodium falciparum. Diese Methode nutzt die paramagnetischen Eigenschaften von Hämozoin zur effizienten Isolierung mit nahezu 100%iger Reinheit.

Trennung

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