Name: PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und In-vitro- Antimikrobielle Eigenschaften von PRP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von thrombozytenreichem Plasma und dessen antimikrobielle Eigenschaften in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von PRP zur Prävention implantatassoziierter Infektionen.

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Die Autoren danken Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis und Suzanne Smith für experimentelle Unterstützung und Suzanne Smith für das Korrekturlesen. Die Autoren danken John Thomas, PhD für die Bereitstellung der bakteriellen klinischen Isolaten und John B. Barnett, PhD für seine Unterstützung und die Nutzung der biologischen Sicherheit Labor an der Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Zellbiologie an der West Virginia University. Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Osteosynthese und Trauma Care Foundation und der National Science Foundation (# 1003907). Microscope Experimente und Bildanalyse wurden auch in der West Virginia University Imaging Facility, die zum Teil von der Mary Babb Randolph Cancer Center und NIH P20 RR016440 unterstützt wird durchgeführt. Verwendung von Tieren für die Blutabnahmen wurden von der West Virginia University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten guidelin hingerichtetes, Vorschriften und Regulierungsbehörden.

Ein. Vorbereitung und Aktivierung von PRP 1,1 Blutentnahme <ol><li> Anesthetize Kaninchen durch Inhalation von Isofluran (2% in O 2 für die Induktion und 1% für Wartung). </li><li> Ziehe 2 ml 0,129 M Tri-Natriumcitrat (ein anticoagulent Lösung) in einen 20-ml-Spritze. Die Tri-Natriumcitrat-Lösung wird durch Auflösen von 1,897 g Trinatriumcitrat in 50 ml destilliertem H 2 O und eine Filterung mit einer 0,22 um Sterilfilter hergestellt. </li><li> Sterilisieren rabbit ear mit 70% Ethanol. </li><li> Ziehen Blut (zB 5 ml) aus dem Kaninchen Ohrvene über einen Butterfly-Nadel (25 G), die mit der Spritze. </li><li> Mischen Sie das Blut mit dem tri-Natriumcitrat-Lösung durch vorsichtiges Schütteln. Das Volumenverhältnis von Blut und Tri-Natriumcitrat-Lösung ist 9:1. </li></ol> 1,2 PRP Zubereitung (Abbildung 1) <ol><li> Übertragen der antikoaguliertem Blut zu einer 50-ml-Kunststoffröhrchen Zentrifugenröhrchen. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 ulBlut in den Thrombozytenausgangswert mit hemocytometry bestimmen. </li><li> Zentrifuge das Blut bei 300 xg für 10 min bei Raumtemperatur (RT) in einer Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor. Stellen Sie die Beschleunigung und Bremse Geschwindigkeit zu niedrig ist (Abbildung 1). </li><li> Nach Zentrifugation wird das Blut in drei Schichten getrennt. Die untere Schicht ist hauptsächlich roten Blutkörperchen wird die mittlere Schicht (gemeinhin als &quot;Leukozytenmanschette&quot; bezeichnet) von konzentrierten Blutplättchen und Leukozyten besteht und die oberste Schicht ist hauptsächlich Plasma, welches die flüssige Komponente des Blutes ist, und Plättchen ( Abbildung 1). Vorsichtig transportieren Zentrifugenröhrchen zu einer Zellkultur Kapuze; nicht stören die Schichten. Übertragen das Plasma, Buffy-Coat und 2-3 mm dicke Schicht roter Blutkörperchen in einem 15 ml Plastikröhrchen mit einer 1 ml Kunststoff-Pipette. </li><li> Zentrifuge die übertragenen Probe ein zweites Mal bei 3000 xg für 15 min bei RT. Die obere Schicht (Überstand) wird als plättchenarmes Plasma (PPP) eind wird in ein neues Röhrchen überführt. </li><li> PRP erhalten durch Einstellen der Blutplättchenkonzentration in dem verbleibenden Blutprobe mittels PPP bis 2,0 x 10 6 Blutplättchen / ul (bestimmt durch hemocytometry) zu erhalten. </li></ol> 1,3 PRP-Aktivierung <ol><li> Planen PRP Aktivierung durch Auflösen 5.000 IU bovines Thrombin mit 5 ml 10% Calciumchlorid der Arbeitskonzentration von 1.000 IU / ml. </li><li> Fügen Sie die Aktivierung Lösung PRP und PPP, und mischen Sie die Lösung durch wiederholtes Pipettieren zu PRP und PPP-Gele bilden. Das Volumenverhältnis der Aktivierungslösung zum PRP oder PPP ist 1:4. </li></ol> 2. In vitro Antimicrobial Test der PRP mit kill Curve Assay (Abbildung 2) <ol><li> Mit einer sterilen Impföse, fügen Sie mehrere Kolonien von S. aureus von seinem Plattenkultur über Nacht in 5 ml Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) in einem Kunststoffrohr. Vortex kurz und dann inkubieren Sie die Probe für 2 Stunden bei 37 ° C. NächsteDie optische Dichte der Bakterien-Medium wurde mit einem Spektralphotometer und auf eine optische Dichte von ~ 1 × 10 8 CFU / ml auf der vorbestimmten Standardkurve berechnet. </li><li> Machen Sie eine 100x Verdünnung mit PBS auf 1 x 10 6 CFU / ml zu erhalten und legen Sie die Inokulums auf Eis. </li><li> Einrichten und beschriften sterilen Einweg 5 ml Rundkolben Polystyrolröhrchen, und bereiten Sie die folgenden Beispieldaten Gruppen, wie in Tabelle 1 für ein Endvolumen von 2 ml in jedem Röhrchen angegeben. </li><li> Hinzufügen PRP, PPP, oder PBS ersten bis Polystyrolröhrchen, durch den Thrombin-Lösung zur Aktivierung (Gelbildung) gefolgt. Als Nächstes fügen MHB und dann die S. aureus Impfkulturen (1 x 10 6 CFU / ml), um die Endkonzentration von 1 × 10 5 CFU / ml. </li><li> Die Röhrchen bei 37 ° C unter kreisförmigen Schütteln bei 150 Upm. </li><li> Zu vorbestimmten Zeitpunkten (zB 0, 1, und 2 h), Mischen der Lösungen in jedem Rohr über Wiederholung Pipettieren (dieserSchritt ist wichtig, da Bakterien in dem PRP-Gel eingeschlossen werden kann). Nehmen Sie sich 10 ul Probe verdünnen seriell mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und pipettieren 100 ul Aliquot jeder Verdünnung auf eine CASO-Agar (TSA mit 5% Schafblut) Platte für CFU Zählen. </li><li> Kultur die Agarplatten über Nacht bei 37 ° C, dann zählen und notieren Sie die Platte Kolonien. Plotdaten auf einer Skala mit logarithimic Zeit (h) auf der x-Achse und CFU / ml auf der y-Achse. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Platelet-Rich Plasma wurde zunehmend für klinische Anwendungen aufgrund seiner Heilung fördernden Eigenschaften 15-17 verwendet. In der vorliegenden Studie wurde PRP als neuer Ansatz für die Infektionsprävention vorgestellt. PRP wurde festgestellt, dass starke antimikrobielle Eigenschaften gegen MRSA, MSSA, Gruppe A Streptococcus und Neisseria gonorrhoeae haben. Die wichtigsten Vorteile von PRP im Vergleich zu konventionellen Antibiotika, für Infektionsprävention gehören: (1) Aktuelle antibi...

Implantat-assoziierten Infektion eine signifikante klinische Komplikation. Staphylococcus aureus (S. aureus) ist eine der häufigsten Mikroorganismen aus Implantat-assoziierten Infektionen isoliert. Es ist geeignet zur Herstellung einer Biofilm, die die Oberflächen von Implantaten abdeckt und kann zu antibiotikaresistenten Infektion 1,2 führen. Behandlung von Implantat-assoziierten Infektionen erfordert häufig langfristige Krankenhausaufenthalte für wiederholte Debridements und verlängerte parenterale antibiotische Therapie. In antibiotikaresistente Fällen kann die Entfernung des Implantats erforderlich sein. Die steigende Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika hat auch wurde von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) als &quot;eines der weltweit drängendsten Gesundheitsprobleme.&quot; In der Zeit, ohne die Entwicklung von neuen und wirksame antimikrobielle Behandlungen, ist es möglich, dass multiresistenten Krankheitserreger werden mit herkömmlichen Antibiotika behandelbar. Prävention von Implantat-assoziiertenInfektion ist daher wichtig und neuartige prophylaktische Mittel oder Ansätze zur Verhinderung solcher Infektionen benötigt. Platelet-Rich Plasma (PRP) ist eine Konzentration von Eigenblut, die über 30 Wachstumsfaktoren, die mit Knochen und Knochenersatzmaterialien Heilung 3-5 helfen kann enthält. Die Anwendung des PRP, um Knochenregeneration und Weichgewebe Reifung Verbesserung wurde zunehmend in Kliniken wegen seiner hohen Konzentration verschiedener Wachstumsfaktoren durch Plättchen freigesetzt gemeldet. Mehrere Merkmale des PRP zeigen, dass PRP kann auch antimikrobielle Eigenschaften 9.6. PRP enthält eine Vielzahl von Plättchen, die eine hohe Konzentration von Leukozyten (der Host-Abwehrmaßnahmen gegen Bakterien und Pilze besitzen) und mehrere antimikrobielle Peptide 7,8,10. In einer aktuellen Studie von einer großen Kohorte von herzchirurgischen Patienten zeigte sich, dass die intraoperative Anwendung von PRP-Gel während Wundverschluss significantly verringert das Auftreten von oberflächlichen und tiefen Brustbein Infektion 11. Aus diesen Gründen und Beobachtungen stellten wir die Hypothese, dass PRP, neben seiner gut untersuchten die Heilung fördernden Eigenschaften hat antimikrobielle Eigenschaften. Die potentiellen Vorteile der Verwendung von PRP eine Infektion verhindern können gehören: (i) PRP ist weniger wahrscheinlich, Resistenz zu induzieren im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika. (Ii) PRP hat auch Eigenschaften, Heilung, die eine synergistische Wirkung auf Infektionsprävention aufweisen kann fördern; PRP die Heilung fördernden Eigenschaften könnten eine Dichtung zu schaffen, um bakterielle Anbringung verhindern wodurch die Chancen für Infektion als Krankheitserreger und menschlichen Zellen für Implantatoberflächen 12 sind Rennen , 13. (Iii) PRP ist inhärent biokompatibel und sicher und frei von der Gefahr von übertragbaren Krankheiten. Unser langfristiges Ziel ist es, PRP als neuer Ansatz verwenden, um Implantat-assoziierten infecti verhindernons. Das Ziel dieser Studie war es, PRP Vorbereitung mit einem doppelten Zentrifugation Ansatz, PRP in vitro antimikrobielle Eigenschaften zu untersuchen und die Protokolle zur Auswertung wie antimikrobielle Eigenschaften zu beschreiben.

<table><tbody><tr><td>Rinderthrombin</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>Thrombin (boviner Ursprung)</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>King Pharmaceuticals, Inc</td><td>60793-215-05</td><td>10% Calciumchlorid</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Hinton Brühe</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>275710</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Tryptisches Soja-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01202</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Kendro Laborprodukte</td><td>750043077</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr></tbody></table>

prp als neuer ansatz, um eine infektion zu verhindern: vorbereitung und<em&gt; in-vitro-</em&gt; antimikrobielle eigenschaften von prp

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implantat-assoziierte Infektion wird immer schwieriger, die Healthcare-Industrie weltweit durch die zunehmende Antibiotika-Resistenz, die Übertragung von Antibiotika-resistenten Bakterien zwischen Tieren und Menschen, und die hohen Kosten der Behandlung von Infektionen. In dieser Studie offenbaren wir eine neue Strategie, die wirksam bei der Verhinderung Implantat-assoziierten Infektion basierend auf den potentiellen antimikrobiellen Eigenschaften von plättchenreichem Plasma (PRP) kann. Aufgrund seiner gut untersuchten Eigenschaften zur Förderung der Heilung hat PRP (ein biologisches Produkt) zunehmend für klinische Anwendungen einschließlich der orthopädischen Operationen, parodontalen und oralen Chirurgie, Kiefer-Operationen, Schönheitsoperationen, Sportmedizin, etc. verwendet PRP könnte eine erweiterte Alternative zu herkömmlichen Antibiotika zu verhindern Implantat-assoziierten Infektionen. Der Einsatz von PRP kann vorteilhaft sein, im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika since PRP ist weniger wahrscheinlich zu Antibiotikaresistenz induzieren und PRP Die antimikrobielle und Heilung fördernden Eigenschaften können einen synergistischen Effekt auf die Infektionsprävention haben. Es ist wohlbekannt, daß Erreger und menschliche Zellen werden für Implantatoberflächen Renn, und PRP die Eigenschaften der Förderung der Heilung könnte menschlichen Zellanheftung zu verbessern wodurch die Chancen für Infektion. Darüber hinaus ist PRP inhärent biokompatibel und sicher und frei von der Gefahr von übertragbaren Krankheiten. Für unsere Studie haben wir verschiedene klinische Bakterienstämme, die üblicherweise in der orthopädischen Infektionen gefunden und untersucht, ob PRP in vitro antimikrobielle Eigenschaften gegen diese Bakterien ausgewählt hat. Wir haben PRP hergestellt unter Verwendung eines doppelten Zentrifugation Ansatz, der die gleiche Thrombozytenkonzentration für alle Proben erhalten werden können. Wir haben konsequente antimikrobielle Ergebnisse erreicht und festgestellt, dass PRP starke weist in vitro eine antimikrobielle Eigenschaften gegen Bakterien wie methicillin-sensitiv und Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus, Streptococcus der Gruppe A, und Neisseria gonorrhoeae. Daher kann der Einsatz von PRP haben das Potenzial, Infektion zu verhindern und die Notwendigkeit für kostspielige Nachbehandlung von Implantat-assoziierten Infektionen zu reduzieren.

PRP wird reproduzierbar hergestellt unter Verwendung einer doppelten Zentrifugation Ansatz (Abbildung 1). PRP wird festgestellt präsentieren starke (bis zu 100-fache Verringerung der KBE) in vitro antimikrobielle Eigenschaften gegen Methicillin resistenten S. aureus (MRSA) (Abbildung 3), die üblicherweise in Krankenhäusern weltweit 14 gefunden. Ebenso hat PRP starke antimikrobielle Eigenschaften gegen Methicillin sensiblen S. aureus (MSSA), Gruppe A...

Implantat-assoziierten Infektion ist eine signifikante klinische Komplikation. Diese Studie beschreibt einen Ansatz mit plättchenreichem Plasma (PRP) zu implantieren-assoziierten Infektionen zu verhindern, stellt das Protokoll zur Herstellung PRP mit konstanter Blutplättchenkonzentration, und meldet die neu identifizierten antimikrobiellen Eigenschaften von PRP und verwandten Protokollen für die Prüfung wie antimikrobielle Eigenschaften<em&gt; In vitro.</em

PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Antimikrobielle Eigenschaften von PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die antimikrobiellen Eigenschaften von thrombozytenreichem Plasma oder PRP in vitro zu untersuchen. Zunächst wird thrombozytenreiches Plasma von einem spendenden Kaninchen isoliert. Anschließend wird ein bakterielles Inokulum hergestellt, das PRP mit Thrombin aktiviert und mit dem bakteriellen Inokulum vermischt.Inkubieren Sie die Mischung, entnehmen Sie eine Probe und messen Sie die resultierenden koloniebildenden Einheiten. Die antimikrobiellen Eigenschaften von PRP zeigen sich in der Verringerung der CFU in mit PRP behandelten Proben im Vergleich zu Kontrollproben. Ohne PRP-Behandlung ist es weniger wahrscheinlich, dass Thrombozyten-plasma die BOL-Resistenz induziert im Vergleich zu herkömmlichen BOL-Behandlungen.Es weist außerdem Eigenschaften auf, die die Wundheilung fördern und möglicherweise eine synergistische Wirkung bei der Infektionsprävention entfalten. In der vorliegenden Anleitung wurde eine zweifache Zentrifugationsmethode angewandt und die Thrombozytenkonzentration des PRP auf zwei mal 10 hoch sechs Thrombozyten pro etwa 10-mal über dem Ausgangswert im Blut standardisiert; PRP mit enthaltenen Leukozyten wurde v

prp-as-new-approach-to-prevent-infection-preparation-vitro

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung zum Zeitpunkt der transrektalen ultraschallgesteuerten Prostata-Nadelbiopsie (TRUS PNB), das ein einfaches und kostengünstiges Mittel zur Reduzierung von Infektionen nach dem Eingriff darstellt.

Povidoniod Rectal Vorbereitung bei der Prostata-Nadelbiopsie ist eine einfache und reproduzierbare Mittel zur Gefahr der Verfahrens Infektion zu verringern

Dieses Papier soll die interfollikulären autologe Platelet-Rich Plasma-Injektionen (0,20 mL x cm2) in der Kopfhaut von 23 Patienten mit Androgenetic Alopezie in einer Tiefe von 5 mm mit einem medizinischen Injektor-Gun, ausgestattet mit einem 30 Gauge-Nadel beschreiben in drei Sitzungen.

Mechanische und kontrollierte PRP-Injektionen bei Patienten mit androgenetische Alopezie

Das Protokoll stellt die Escherichia coli-basierte Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Lactococcal antimikrobiellen Peptid Nisin. Während rekombinante Expression über Substitution mit gewünschten NcAAs in definierten Wachstumsmedien können seine Eigenschaften geändert werden. Daraus resultierenden Veränderungen in Bioaktivität werden durch Wachstum Hemmung Assays und Fluoreszenz-Mikroskopie zugeordnet.

Antimikrobielle Peptide produziert durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren

Dieses Protokoll stellt ein Gerät vor, das PRP produziert, um die In-vitro-Expansion von Zellen in einem 100% autologen Fibroblastenkultursystem zu fördern.

Herstellung von autologem plättchenreichem Plasma zur Förderung der In-vitro-Expansion humaner Fibroblasten

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zu beschreiben, wie das Ausmaß der Internalisierung von Staphylococcus aureus und seine Überlebensfähigkeit in der menschlichen Wirtszelle sowie die intrazelluläre Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen untersucht werden können.

Verbesserter Enzymschutzassay zur Untersuchung der Internalisierung von Staphylococcus aureus und der intrazellulären Wirksamkeit antimikrobieller Verbindungen

Thrombozytenlysate stellen ein aufstrebendes Werkzeug für die Behandlung von Augenoberflächenerkrankungen dar. Hier schlagen wir eine Methode zur Herstellung, Dispensation, Lagerung und Charakterisierung von Thrombozytenlysat vor, das von Thrombozytenspendern gewonnen wurde.

Plättchenreiches Plasmalysat zur Behandlung von Erkrankungen der Augenoberfläche

Wir stellen vier Methoden vor, um die antimikrobielle Aktivität von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen mit Hilfe von in vitro Techniken zu bewerten. Diese Methoden können angepasst werden, um die Wechselwirkungen verschiedener Nanopartikel und nanostrukturierter Oberflächen mit einem breiten Spektrum mikrobieller Spezies zu untersuchen.

Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Nanopartikeln und nanostrukturierten Oberflächen in vitro

Das Protokoll fasst die Best Practices zur Minimierung der mikrobiellen Keimbelastung in einer Reinraumumgebung zusammen und umfasst Strategien wie Umweltüberwachung, Prozessüberwachung und Produktsterilitätsprüfung. Sie ist relevant für Produktions- und Prüfeinrichtungen, die die aktuellen Standards der guten Gewebepraxis und die aktuellen Standards der guten Herstellungspraxis erfüllen müssen.

Mikrobielle Kontroll- und Überwachungsstrategien für Reinraumumgebungen und zelluläre Therapien

Es fehlt eine Methode, um häufig genutzte Bereiche in Laborumgebungen auf Prionenkontamination und eine effektive Dekontamination zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll bietet wichtige Grundlagen für die Implementierung eines Prionen-Sicherheits-Wischtests im Labor, der leicht an die individuellen Bedürfnisse bestimmter Labore angepasst werden kann.

Prion Safety Laboratory Wischtest

Wir präsentieren ein Protokoll zur Antigen-spezifischen Maus-T-Zellen produzieren unter Verwendung von retroviralen...

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

Erfahren Sie die Herstellung von thrombozytenreichem Plasma und dessen antimikrobielle Eigenschaften in vitro. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von PRP zur Prävention implantatassoziierter Infektionen.

PRP als neuer Ansatz, um eine Infektion zu verhindern: Vorbereitung und

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