Name: Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Lernen Sie die Rekonstitution von Nukleosomen-Arrays aus rekombinanten Core-Histonen und DNA für Chromatinforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zur Genregulation und Chromatinstruktur.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse GM45916 und GM66834 zu JCH und ein Stipendium der Internationalen Rett Syndrome Foundation, diese Arbeit AK unterstützt wurde auch von NIH gewähren GM088409 und Howard Hughes Medical Institute Beiträge zur KL unterstützt

1. Montage von rekombinantem Core-Histone in Octamere Begründung: Der erste Schritt in nukleosomalen Array Rekonstitution ist es, nativen Kern Histon Octamere aus lyophilisierten rekombinanten Histone vorzubereiten. Histon-Proteine ​​werden in äquimolaren Mengen kombiniert und durch Dialyse der Proben aus einem denaturierenden Puffer in Rückfaltungspuffer in Histon Octamere montiert. <ol><li> Entschlacken und lyophilisiert rekombinanten Histone (H2A, H2B, H3, H4) wie beschrieben 13. </li><li> Auflösen etwa 5 mg jeder lyophilisierten Kern Histon in 3 ml Entfaltungspuffer (6 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT). Es jedem Aliquot für mindestens eine Stunde auflösen. Sicherzustellen, dass kein Protein an den Seiten des Behälters verbleibt. </li><li> Messen Sie die Absorption jeder Histon bei 276 nm mit Entfaltung Puffer als Referenz. </li><li> Berechnen Sie die Molarität von jedem Histon mit ihren Extinktionskoeffizienten (siehe Tabelle 1 </strong&gt; für Xenopus Histon Extinktionskoeffizienten). Vergleichen der Absorption bestimmten Konzentration des Histons an die lyophilisierte Trockenmasse, und Schätzung, wenn der Großteil des Proteins gelöst. </li><li> Bestimmen Sie, welche Histon Sie die wenigsten Mol haben, da dies die Höchstzahl der Mole für alle Histone sein. </li><li> Vereinige die Histone in gleichen molaren Mengen und Entfalten Puffer auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml zu verdünnen. </li><li> Legen Sie die Probe in 6-8 kDa MWCO Dialyseschlauch. Abdichten des Schlauchs aufnehmen und in 2 l kaltes Rückfaltungspuffer (2 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol). </li><li> Dialyse der Probe für 18 Stunden bei 4 ° C unter Rühren. Sicherstellen, dass die Dialyseschläuche frei und kräftig zu drehen, oder aber die Histone ausfallen. </li><li> Ändern Sie zweimal in der 18 Stunden-Zeitraum (dh ändern Sie die Rückfaltungspuffer über jede 6 Stunden, bis getan) die Dialysepuffer. Auch wenn Niederschlag bildet nicht verwerfendie Probe kann einige Octamer gewonnen, wobei die Ausbeute wird verringert werden. </li></ol> Hinweis: Siehe Schritt 2.1-2.2 Spaltenausgleich für den nächsten Tag vorzubereiten. 2. Reinigung von Histon Octamere durch Size Exclusion Chromatography Begründung: Nach dem Abschluss mit § 1, werden Proben Histon Octamere sowie andere Histon-Komplexe wie Aggregate, H3/H4 Tetramere und Dimere H2A/H2B enthalten. Histon Octamere wird von diesen anderen Komplexen mit Größenausschluss-Chromatographie (SEC) gereinigt werden. <ol><li> Schließen Sie einen HiLoad 16/60 Superdex 200 16/60 (S200) Spalte zu einer FPLC-System. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in das System nicht. </li><li> Reinigen Sie die Spalte S200 mit 0,2 um gefiltertes Wasser. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 0,3 ml / min und setzen einen Gegendruck Grenze von 0,5 MPa. Stellen Sie sicher, Sie haben genug Wasser und lassen Sie die Spalte, über Nacht zu reinigen. </li><li> Äquilibrieren Sie die S200-Säule und Probenschleife des FSPS über Rückfaltungspuffer. Verwenden 1 L von 0,2 um filtriert Rückfaltungspuffer. Rückfaltungspuffer fließen durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min und einem maximalen Druck von 0,5 MPa für ca. 2 Stunden. </li><li> Äquilibrieren einer Vivaspin Zentrifugal-Konzentrator (MWCO 50 kDa) mit 1 ml Rückfaltungspuffer. Entfernen der Probe aus Dialyseschlauch und Zentrifugieren der Probe bei 4 ° C bis keine Niederschläge zu entfernen. Pipettieren des Probenüberstand in den Konzentrator. Konzentrieren sich die Probe bis auf ein Volumen von etwa 500 &amp;mgr;. </li><li> Entfernen Sie die konzentrierte Octamers Probe in einen neuen Container und spülen Sie den Konzentrator mit 1 ml Rückfaltungspuffer. Konzentrieren Sie die Spülung auf 500 ul und es an die Oktamer Probe hinzufügen. Dies hilft, das noch in der Konzentrator restlichen Octamers retten. </li><li> Drehen die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 5 Minuten bei 10.000 UpM bei 4 ° C Sammeln Sie den Überstand und übertragen in ein neues Röhrchen. Dies hilft, jede Niederschlag vor dem Laden der Probe auf der FPL entfernenC. </li><li> Laden der Probe auf die Säule S200. Laden Sie ein Maximum von 1,5 ml Volumen oder 15 mg Oktamer in einem einzigen Reinigungs. </li><li> Eluiere das Beispiel mit frisch gemachten Rückfaltungspuffer. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und eines Rückdrucks Grenze von 0,5 MPa. Verwenden Sie zwei Säulenvolumen (400 ml) Rückfaltungspuffer und 2 ml Fraktionen. Überwachung der Absorption bei 280 nm während der Elution. Die verschiedenen Arten werden in der Reihenfolge der abnehmenden Größe zu eluieren. Histon-Aggregaten in der Regel eluieren bei etwa 45 ml, Oktamer bei etwa 65 ml, und Dimer zu etwa 84 ml (Abbildung 1). </li><li> Analyse der Elutionsfraktionen von Peaks von Interesse indem Proben auf einem 18-20% SDS-PAGE. Fraktionen, die gereinigtes Octamere sollten gleichen molaren Mengen der vier Kern-Histon-Proteine ​​(Abbildung 1). </li><li> Pool der Fraktionen, die gereinigt Octamere enthalten und zu konzentrieren, um mit einer Vivaspin Zentrifugal-Filter ≤ 15 mg / ml. Wenn links verdünnter kann Octamere distanzieren into H2A/H2B Dimere und Tetramere H3/H4. </li><li> Bestimmen die Octamer Konzentration durch Messen der Absorption bei 280 nm und die Berechnung unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Tabelle 1. </li><li> Histon Octamere kann kurzfristig in Rückfaltungspuffer bei 4 ° C gehalten werden, Wenn gespeichert wird langfristig die Octamere bei -20 ° C in einer 50% Glycerinlösung stabiler. Octamere in Glycerin gelagert werden, sollten vor der Absorptionsmessungen an die frische Rückfaltungspuffer dialysiert werden und die Verwendung in nukleosomalen Array Rekonstruktionen. </li></ol> 3. Rekonstitution der nukleosomalen Arrays aus DNA und gereinigtes Octamere Begründung: Rekonstitution der nukleosomalen Arrays erfordert, dass Histon-Octamere-und Template-DNA an spezifischen molaren Verhältnissen kombiniert werden. Mischungen von DNA und Histon Octamere in 2 M NaCl sind Schritt in die Puffer abnehmender Ionenstärke dialysiert. Eine allmähliche Änderung niedrigeren Salzbildung gewährleistet eine ordnungsgemäße Nukleosomen. Beziehen nucleosomal Arrays mit dem gewünschten Grad der Sättigung Histonoktamer der Template-DNA erfordert kleinen Test Rekonstruktionen, gefolgt von einem großen Maßstab präparative Rekonstitution. Die durch die Klein Rekonstruktionen definierten geeigneten Bedingungen verwendet, um die Wiederherstellungs führen. <ol><li> Reinige hintereinander wiederholt, wie beschrieben, 4,12 Nukleosomen-Positionierung DNA. Kurz gesagt, die Plasmid-DNA zu isolieren, unter Verwendung eines Qiagen GigaPrep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Set-up eines Restriktionsenzyms, um die Template-DNA freizusetzen und verdauen die Plasmid-DNA auf kleinere Größen (≤ 700 bp) zu verdauen. Die Matrizen-DNA kann dann von den kleinen Plasmid DNA Reste mit Größenausschluss-Chromatographie (SEC) gereinigt werden. Ein Schwerkraftsäule mit einer Höhe von etwa 115 cm mit Sephacryl S-1000 Perlen gepackt ist ausreichend für die Reinigung von 601 x 207bp 12mer DNA. </li></ol> Hinweise: Für die Reinigung von Plasmid-DNA bei verringerten Kosten, sondern erhöht effort, kann man alkalische Lyse mit Phenol / Chloroform DNA-Reinigung, um Plasmid-DNA aus E. isolieren verwenden coli 23,24. Strategien zur Trennung von Template-DNA aus Plasmid-DNA kann mit Veränderungen in der DNA-Vorlage Größe variieren. Für SEC ist es wichtig, die Einrichtung der Restriktionsenzym in einer Weise, die den Unterschied in der Größe zwischen der Vorlage und Plasmid-DNA maximiert verdauen. <ol start="2"><li> Bestimmen, welche Molverhältnisse (r), die für Wiederherstellungen verwendet. R ist gleich dem Verhältnis der Mole von Oktamer auf Mole DNA wiederholen. Für einen ersten kleinen Versuche, r-Werte von 0,9, 1, 1,1 und angemessen, wenn die Absicht besteht, gesättigten nukleosomalen Arrays zu erhalten. </li><li> Vorbereitung der kleinen Proben durch Berechnung des Betrags der Oktamer auf etwa 18 ug DNA pro Molverhältnis zu prüfenden hinzuzufügen. Mischen Sie die DNA und Histon Octamere. Die Endkonzentration von NaCl in der Probe sollte ≥ 2 m, und die Endkonzentration von DNA sollten rund 0,3 ug / ul sein. Die endgültige Probe Pufferbedingungen sollten auch 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. </li><li> Die Proben sind nun bereit für die Dialyse. Laden Sie die Proben in 12k-14k MWCO Dialyseschlauch. Dialysiere die Proben gegen 2 l Puffer abnehmender Ionenstärke wie folgt. </li></ol> Bauteile in den Puffer: 10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA. Puffer 1 (Add 1 M NaCl, 1 mM DTT) für 5-6 Std. Puffer 2 (Add 0,75 M NaCl, 1 mM DTT) über Nacht. Puffer 3 (Add 2,5 mM NaCl, 1 mM DTT) für 5-6 Std. Buffer 4 (Add 2,5 mM NaCl, 0,1 mM PMSF) über Nacht. <ol start="5"><li> Entfernen Sie die Proben aus dem Dialyseschlauch und fahren Sie Abschnitte 6.4. Wenn die kleinen Proben ergeben die gewünschten Ergebnisse, wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 6.3 auf der großen Skala. </li></ol> Hinweis: Um Ressourcen zu schonen, sollten kleinere Proben das Mindestvolumen notwendig, für nachgelagerte Screening-Tests genügen haben. Um e habennough Probe für die hier aufgeführten Sedimentationsgeschwindigkeit und AFM-Experimente wurden 50 ul-Proben mit 0,3 mg / ml DNA geeignet sind. Die Größe der in großem Maßstab, sind präparativen Proben abhängig von ihrem Verwendungszweck. Ein Groß Probe sollte in der gleichen Weise wie die kleinen Proben hergestellt werden. 4. Sedimentationsgeschwindigkeit Analyse der rekonstituierte nukleosomalen Arrays Begründung: Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente im Beckman XL-A / I analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form der Moleküle in Lösung. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente unter Niedrigsalzbedingungen durchgeführt werden, verwendet, um das Ausmaß, in dem die rekonstituierten Arrays mit Nukleosomen gesättigten bestimmen. <ol><li> Die Probe zu verdünnen, um eine Absorption in der Umgebung von 0,5 bei 260 nm mit TEN-Puffer (10 mM Tris pH 7,8, 1 mM EDTA, 2,5 mM NaCl). Laden 400 ul Probe in eine Zelle mit einem Zweikernsektor, wobei die Probe auf der einen Seite und dem Refece (TEN-Puffer) 25 auf der anderen. Halten Sie die Referenz Meniskus höher als die Probe Meniskus (Hinzufügen von 420 ul Referenzlösung). </li><li> Laden der Zellen in den Rotor, und richten die Zellen richtig mit den Hash-Zeichen auf dem Boden der Zellen und des Rotors 25. Vorsichtig reinigen Sie die Linsen der Zellen unter Verwendung von Druckluft. </li><li> Schalten Sie die Zentrifuge XL-A/XL-I, legen Sie den Rotor und befestigen und sichern Sie die Optik wie in der Anleitung beschrieben. Öffnen Sie die Proteome Lab Software und wählen Sie Datei: Neu. </li><li> Einrichten einer einzigen Scan laufen bei 3.000 Umdrehungen pro Minute und einer Temperatur von 25 ° C Unter Optionen wählen Sie Stop nach dem letzten Scan und Radiallauf Kalibrierung (radiale Kalibrierung ist nicht notwendig, wenn der Rotor war der letzte in der AUC verwendet Rotor). </li><li> Für jede Zelle, die Bezeichnung der Proben, wählen Sie eine Wellenlänge (260 nm), wählen Absorption, und wählen Sie eine Datei speichern Speicherort auf Ihrem Computer. Beginnen Sie die einzelnen Scan laufen. </li><li> Verwenden Sie die einzelnen Scan, um die entsprechende ra bestimmenWahlscanlänge (Abbildung 2A). Verringern der Länge der Zelle, die untersucht werden sollen verringert die Laufzeit. Jedoch sicher sein, um die Probe Meniskus sind und sich das Ende sehr nahe oder an der Unterseite der Zelle. </li></ol> Anmerkung: Einzelscans kann der Messbereich durch Messungen begonnen, kurz bevor die Probenmeniskus (2A) verkürzt werden. Die meisten der während der AUC-Lauf erzeugt Scans sollten Grenze Fraktionen Vergangenheit des Meniskus sowie stabile Plateaus (2B) haben. Schmutzige Gläser auf den AUC-Zellen können Scans mit großen Spitzen erzeugen, können diese Analyse der Daten beeinflussen. Die Ultrascan-Software umfasst ein Handbuch, das eine große Ressource für Informationen über die Analyse von Daten analytische Ultrazentrifugation 26 ist. <ol start="7"><li> Mit der XL-A/XL-I Bedienfeld, geben Sie eine Geschwindigkeit von 0 und Start drücken. Dies wird die Zentrifugenkammer aufgefordert, um ein Vakuum zu ziehen und alleow die Temperatur der Kammer zu äquilibrieren. Warten Sie 1 Stunde, um für Temperaturausgleich vor Beginn einer Lauf zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um den Lauf für die gewünschte Geschwindigkeit und Anzahl der Scans eingestellt. Höhere Geschwindigkeiten erhöhen Auflösung, aber man sollte mindestens 20 Scans (vorzugsweise mehr) zu sammeln, bevor die Probe auf dem Boden der Zelle sedimentiert. Es ist zweckmäßig, die letzten Scans (im Optionsmenü erreicht), um den Fortschritt der Lauf überwachen und auf mögliche Probleme wie undichte Zellen überlagern. Überwachen Sie die ersten paar Scans um den ordnungsgemäßen Betrieb zu gewährleisten. </li></ol> 5. Bearbeiten und Analysieren von Sedimentation Geschwindigkeitsdaten Begründung: Rohmaterial Sedimentationsgeschwindigkeit Daten durch ein Programm, das eine Diffusionskorrigierten Sedimentationskoeffizientenverteilung ergibt analysiert werden. Diese Informationen wiederum gibt den Bruchteil eines rekonstituierten Probe, die einen bestimmten Sättigungspegel enthält, z. B. </em&gt; bei Verwendung eines 12-mer-DNA-Matrize wird es möglich sein, den Bruchteil des rekonstituierten Arrays 10, 11 und 12 Nukleosomen / DNA hat bestimmen. <ol><li> Verwenden Sie AUC Datenanalyse-Software wie Ultrascan, um die Daten 26 bearbeiten. Bearbeitung von Scan-Daten müssen für jede Zelle durchgeführt werden und erzeugt eine Datenmenge für eine nachfolgende Analyse. Ordnungsgemäßen Bearbeitung von Abtastungen beinhaltet die Definition der Probe Meniskus, wodurch die Daten in eine Region von Interesse, und Definieren Basis sowie Plateaubereiche (Fig. 2). Unerwünschte Scans können auch aus den Daten an dieser Stelle gesetzt entfernt werden. Jedoch, da es möglich ist, unerwünschte Scans während der Analyse zu entfernen, empfiehlt es sich, daß alle Abtastungen an dieser Stelle gehalten werden. </li><li> Wir empfehlen dringend, dass die verbesserte van Holde-Weischet-Methode verwendet, um die Daten zu analysieren 27 werden. Dieses Analyseverfahren korrigiert für die Effekte der Diffusion im Laufe des Versuchs und liefert die integrale Verteilung der Sedimentationskoeffizienten. InsbesondereDie erhöhte van Holde-Weischet Verfahren (wie in Ultra implementiert) für die Aufnahme des Scans, die stabile Plateaus fehlt, oder die Randfraktionen, die den Meniskus in der Analyse 28 nicht gelöscht sind, enthalten kann. </li><li> Bestimmung der Verteilung der Sedimentation Koeffizienten für die zusammengebauten Anordnungen. Repräsentative Ergebnisse für 601-12 (207bp, 12-mer) nukleosomalen Anordnungen in Fig. 3 gezeigt. </li><li> Wenn eine der kleinen Proben enthält Arrays mit dem gewünschten Bereich von Sedimentationskoeffizienten, wiederholen Sie den Vorgang mit einer erhöhten Skala beginnend mit Abschnitt 3. Wenn keine der kleinen Proben hat eine angemessene Verteilung der Sedimentationskoeffizienten dann mit einem neuen R-Bereich ab Punkt 3 wiederholen Sie die kleinen Tests. </li></ol> 6. Visualisierung nukleosomalen Arrays Mit Atomic Force Microscopy (AFM) Begründung: AFM ermöglicht die Visualisierung der Sättigungsgrad von nucleosomal-Arrays. Diese Technik ergänzt Sedimentationsgeschwindigkeit von AUC und Restriktionsverdau als Qualitätskontrolltest. <ol><li> Mit oben beschriebenen Methoden erhalten eine gut gesättigt Nukleosomen-Array (5A). </li><li> Bereiten APTES behandelten Glimmer Folien, indem ~ 30 ul 1:1000 Verdünnung der kommerziellen (Sigma-Aldrich (3-Aminopropyl) triethoxysilan A3648-100 ml) in 0,22 um filtriert Nanopure-Wasser für 30 min. </li><li> Nach 30 min spülen Sie die APTES mit gefiltertem Wasser und trocknen Sie sie sanft in einem Stickstoffstrom. </li><li> Legen Sie entsprechend verdünnten Probe Nukleosomen Array (~ 1,5 ng / ul) auf der Folie, und bei Raumtemperatur 15 Minuten abgedeckt. </li><li> Spülen Sie probieren mit gefilterten Probenpuffer, trocken wie zuvor, und statt Schlitten auf der Bühne des AFM (in diesem Fall ein Asylum Research MFP-3D Atomic Force Microscope). </li><li> Starten Sie durch Abbildung 2 x 2 um Scans mit 512 Bildzeilen. Zähle die Anzahl der Nukleosomen auf Ebene der sa ermittelnturation (5B). </li><li> Idealerweise sollten Sie Bildbereiche auf dem Objektträger mit gut getrennt Nukleosomen-Arrays. </li><li> Für Bilder mit höherer Auflösung kann ein 500 x 500 nm-Scan erhalten werden (Abbildung 5C). </li><li> Bilder können abgeflacht und mit der MFP-3D-Software zur Verfügung gestellt von Asylum analysiert. </li><li> Jedes Bild kann in vier Quadranten unterteilt und in digital gezoomt, um eine bessere Sicht auf gut getrennten Arrays und mehrere Freihandlinien können durch die Arrays und Höhenprofile erstellt werden für die Nukleosomen (5C, rechte Tafel-Höhe Spur erhalten erhalten und 5D). </li><li> Mehrere solcher Bilder für jedes Array-Typ, die mehrere Hunderte von Nukleosomen analysiert werden. Höhenprofile werden erfasst, kategorisiert und in MS Excel aufgetragen. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Modell nukleosomalen Arrays sind ein sehr nützliches Werkzeug für die in vitro Untersuchung von Chromatin-Struktur und Funktion. Beispielsweise haben sie häufig verwendet, um den Mechanismus der Chromatinfaser Kondensation in Lösung 30-34 untersuchen, und machte es möglich, eine Röntgenstruktur eines tetranucleosome 35 erhalten. Vor kurzem haben sie nützlich bei der Entschlüsselung die strukturellen Auswirkungen der spezifischen Kern Histon-Varianten, Mutanten und posttranslationale Modifi...

Eukaryotischen Genomen existieren nicht als nackte DNA, sondern verdichtet und durch gebundene Proteine ​​organisiert. Diese Komplexe von DNA und Protein Chromatin. Die Grundstruktureinheit des Chromatins ist das Nukleosom. Ein Nukleosom umfasst Histonoktamer und 146 Basenpaare der DNA um die Histon-Oktamer gewickelt etwa 1,6 mal 1. Die Histonoktamer wird von jedem der Core-Histone H2A, H2B, H3, H4 und zwei Kopien zusammen. Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Die erweiterte Struktur nukleosomalen Arrays hat als die 10 nm-Faser oder den &quot;Perlen auf einer Schnur&quot;-Struktur bezeichnet worden ist und in vitro unter Niedrigsalzbedingungen 2 vorhanden. Die 10-nm-Faser ist in der Lage Kondensation in Strukturen höherer Ordnung durch intra-Array Verdichtung und / oder Inter-Array Oligomerisierung 2. Diese Strukturen höherer Ordnung in Gegenwart von Salzen induziert werden,oder durch die Bindung von Proteinen an Chromatin Architektur nukleosomalen Array 3,4 beeinflusst werden. Levels Verdichtung des Chromatins sind invers mit Transkriptionsrate in vivo 5,6 korreliert. Neue Forschung unterstreicht die Bedeutung der strukturellen Organisation der Genome in Prozesse wie Differenzierung, die Entwicklung von Krebs, und andere 7,8. Der Einsatz von Arrays nukleosomalen Chromatin Struktur und Funktion zu untersuchen hat sich weit verbreitet. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Montage von nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und Nukleosomen Positionierung DNA. Mit Hilfe rekombinanter DNA mit Tandem-Wiederholungen von Nukleosomen-Positionierung Sequenzen ermöglicht die Wiederherstellung des Arrays, die regelmäßig angeordneten Nukleosomen enthalten. Zwei der populäreren Positionierung Sequenzen sind die 5S-rRNA-Gen-Sequenz und die &quot;601&quot;-Sequenz 9,10. Die 601-Sequenz wurde aus SELEX-Experimenten und mor abgeleitete-Positionen stark Nukleosomen als die 5S-Sequenz 11. Folglich ist die Linker-DNA Länge der Arrays 601 homogener. Tandemwiederholungen Nukleosom Positionierung DNA durch Gelfiltration 4,12 erhalten. Rekombinante Histone werden von E. gereinigt coli unter denaturierenden Bedingungen 13. Die Verwendung von rekombinanten Histone erlaubt es, sorgfältig zu steuern, die Histon-Zusammensetzung der nukleosomalen Arrays. Zum Beispiel, Kern-Histone tragen spezifische Mutationen 14 oder post-translationale Modifikationen 15,16 für Wildtyp-Core-Histone ersetzt werden. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente überwachen die Geschwindigkeit der Sedimentation von Makromolekülen in Lösung unter einer angelegten Zentrifugalkraft 17. Dies liefert Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen in einer Probe. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente sind daher ein geeignetes Instrument für die Untersuchung Lösung Zustandsänderungen in ChromatinfaserStruktur aufgrund Chromatin-Kondensation 18. Wichtig ist es zunächst erforderlich, Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente als Qualitätskontrollschritt in nukleosomalen Array Rekonstitution zu verwenden. Wenn DNA und Nukleosomen sind nicht in der richtigen molaren Verhältnis kombiniert, können die Arrays unter-oder übergesättigten mit Core-Histone werden. Somit werden die Informationen aus der Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente gewonnen wird verwendet, um sicherzustellen, dass die DNA richtig mit Nukleosomen gesättigt. Es ist wichtig, alternative Methoden anzuwenden, um die Sättigung der DNA mit Nukleosomen zu schätzen, vor allem, wenn die Arbeit mit einem zuvor nicht charakterisierten DNA-Vorlage. Deshalb beschreiben wir auch ein Verfahren zur Analyse von nukleosomalen Arrays mit Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM ist eine leistungsfähige Technik, die ermöglicht die Visualisierung der Wirkungen einer Anzahl von Parametern, wie der Pegel der Sättigung Wirkung der Anwesenheit von Histon-Varianten oder die Auswirkungen von MgCl 2 19,20. AFM hat auch Anwendungened, um Nukleosomen Dynamik Studie mit Zeitraffer-Imaging-21. In vitro zusammen nukleosomalen 12-mer-Arrays sind besonders geeignet, um AFM-Untersuchungen, weil sie in der richtigen Größenbereich für AFM 22 gehören. In der vorliegenden Studie haben wir von AFM nukleosomalen Arrays als Qualitätskontrolle als auch als Mittel zur Bekräftigung die Daten von AUC (&quot;Sehen ist Glauben&quot;) eingesetzt. Neben einfachen Visualisierung ermöglicht AFM-Messung der Höhenprofile von Proben als eine zusätzliche Metrik.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa MWCO Dialyseschlauch</td><td>Fisher</td><td>21-152-5</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 16/60 Säule</td><td>GE</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 50 kDa MWCO Zentrifugalkonzentrator</td><td>Sartorius</td><td>VS2031</td><td></td></tr><tr><td>12-14 kDa MWCO Dialyseschlauch</td><td>Fisher</td><td>08-667A</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Sephacryl S-1000 Superfein</td><td>GE</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>XL-A/I Analytische Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

versammlung der nukleosomalen arrays von rekombinantem core-histone und dna nucleosome positioning

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Kern Histon Octamere, die wiederholt entlang eines DNA-Moleküls angeordnet sind nukleosomalen Arrays bezeichnet. Nukleosomalen Arrays werden in einem von zwei Wegen erreicht: Reinigung von in vivo-Quellen oder in vitro Rekonstitution von rekombinantem Core-Histone und tandemartig wiederholten DNA Nukleosom Positionierung. Das letztere Verfahren hat den Vorteil, dass für die Montage von einer in der Zusammensetzung einheitlich und genau positioniert nukleosomalen Array. Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge Ausbeute Informationen über die Größe und Form von Makromolekülen durch die Analyse der Geschwindigkeit, mit der sie durch Lösung unter Zentrifugalkraft migrieren. Diese Technik, die zusammen mit der Rasterkraftmikroskopie kann zur Qualitätskontrolle verwendet werden, so dass der Großteil der DNA-Templates werden mit Nukleosomen nach Rekonstitution gesättigt. Hier beschreiben wir die erforderlichen Milligramm-Mengen der Länge und der Zusammensetzung zu rekonstituieren d Protokolleefined nukleosomalen Arrays für biochemische und biophysikalische Untersuchungen der Chromatin-Struktur und Funktion.

Um das Protokoll zu veranschaulichen wir rekonstituiert nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Xenopus Histone und DNA, die aus 12 207 bp Tandem-Wiederholungen der Folge 601 Positionierung (601 207 x 12). Wir haben zuerst zusammengebaut nativen Octamere aus lyophilisierten Histone und reinigte die Octamere durch FPLC mit einem S200-Säule (Abbildung 1A) dann. Größere Komplexe eluieren früher aus der Säule S200. Histone eluieren in der Regel in dieser Reihenfolge: nicht-spezifische His...

Es wird ein Verfahren für die Wiederherstellung von Modell nukleosomalen Arrays aus rekombinanten Histone und hintereinander wiederholt Nukleosomen-Positionierung DNA vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie Sedimentationsgeschwindigkeit Experimente in der analytischen Ultrazentrifuge, und Rasterkraftmikroskopie (AFM) werden verwendet, um das Ausmaß der nukleosomalen Array Sättigung nach Rekonstitution zu überwachen.

Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Dieses Experiment zielt darauf ab, Nukleosomen-Arrays zusammenzusetzen, die eine Reihe tandemartig wiederholter DNA-Sequenzen mit Nukleosomen-Positionierung enthalten und eine gleichmäßige Anzahl von Nukleosomen aufweisen. Zunächst werden Histon-Komplexe durch Dialyse der Kernhistone aus einem denaturierenden Puffer heraus neu gefaltet. Anschließend werden die Histon-ER mittels einer Größenausschluss-Säule getrennt. Danach werden die Histon-ER mit Matrizen-DNA in einem Bereich molaren Verhältnisse kombiniert und durch schrittweise Dialyse von hohem zu niedrigem Salzgehalt als Nukleosomen auf die DNA abgeschieden.Als Nächstes testen Sie die Proben mittels Sedimentationsgeschwindigkeit, um das geeignete molare Verhältnis für den gewünschten Sättigungsgrad zu bestimmen. Die Ergebnisse können den Sättigungsgrad der nukleosomalen Arrays basierend auf deren Wanderung durch die Lösung unter Zentrifugalkraft oder anhand eines mittels Rasterkraftmikroskopie erzeugten Bildes zeigen. Der Hauptvorteil nukleosomaler Arrays gegenüber einzelnen Nukleosomen liegt darin, dass die Nukleosomen durch DNA-Linker miteinander verbunden sind, was eine zusätzliche strukturelle Einschränkung bewirkt.Obwohl diese Methode Einblicke in die Chromatinstruktur ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise auf in-vitro-Transkriptionsstudien an Chromatinschablonen. Ryan und Anna werden nun die Assemblierung nukleosomaler Arrays aus rekombinanten Kernhistonen in einer DNA mit Nukleosomenpositionierung demonstrieren. Beginnen Sie mit den gereinigten lyophilisierten rekombinanten Kernhistonproteinen H zwei A, H zwei B, H drei und H vier; lösen Sie jeweils etwa fünf Milligramm in drei Milliliter Entfaltungs-Puffer und inkubieren Sie mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren.Messen Sie nun die Extinktion jeder Histonlösung bei 276 Nanometern unter Verwendung des Entfaltungs-Puffers als Referenz. Berechnen Sie anschließend die Molarität jedes Histonproteins unter Verwendung ihrer Extinktionskoeffizienten. Vergleichen Sie die durch die Extinktion bestimmte Konzentration des Histonproteins mit dem lyophilisierten Trockengewicht und schätzen Sie ab, ob der größte Teil des Proteins gelöst ist.Identifizieren Sie die Histonprobe mit der geringsten Stoffmenge in Mol, da diese die begrenzende Stoffmenge für alle Histone darstellt. Mischen Sie anschließend die Histone in äquimolaren Mengen. Verdünnen Sie die Histonmischung mit Entfaltungs-Puffer auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter. Überführen Sie die Probe nun in eine Dialysehülle. Verschließen Sie die Hülle und legen Sie sie in zwei Liter kaltes Pufferpuffer für die Umfaltung. Dialysieren Sie die Probe 18 Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren.Stellen Sie sicher, dass das Dialyserohr sich frei und kräftig drehen kann, um eine Steinpräzipitation zu vermeiden. Wechseln Sie den Dialysepuffer alle sechs Stunden; selbst wenn sich ein Präzipitat bildet, entsorgen Sie die Probe nicht, da möglicherweise einige Octi zurückgewonnen werden können, obwohl die Ausbeute verringert sein wird. Schließen Sie die S 200-Säule an ein FPLC-System an und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in das System gelangen.Spülen Sie die S 200-Säule über Nacht mit 0,2 Mikrometer gefiltertem Wasser bei einer Flussrate von 0,3 Millilitern pro Minute und einer Rückdruckgrenze von 0,5 Megapascal. Anschließend wird das System mit einem Liter 0,2 Mikrometer gefiltertem Puffer für die Faltungsreaktion etwa zwei Stunden lang equilibriert. Equilibrieren Sie außerdem einen Zentrifugal-Konzentrator mit einem Milliliter Faltungspuffer. Entfernen Sie nun die Probe aus der Dialysefolie.Zentrifugieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius, um eventuelle Präzipitate zu entfernen. Pipettieren Sie das Überstand der Probe in den Konzentrator. Konzentrieren Sie die Probe auf ein Volumen von etwa 500 µL.Überführen Sie die konzentrierte Optimus-Probe in einen neuen Behälter. Spülen Sie den Konzentrator mit einem Milliliter Puffer für die Refaltung aus. Konzentrieren Sie die Abwaschung auf 500 Mikroliter ein und geben Sie sie der ER-Probe hinzu.Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang mit 10.000 U/min bei 4 °C in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Überführen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Laden Sie die Probe nun auf die S 200-Säule auf.Eluieren Sie die Probe mit 400 Milliliter frisch hergestelltem Puffer zur Faltungsreaktion und sammeln Sie Fraktionen zu je zwei Milliliter. Überwachen Sie während der Elution die Absorption bei 280 Nanometern. His-Tag-Aggregate eluieren gewöhnlich bei etwa 45 Millilitern EMR bei ungefähr 65 Millilitern und Zeitpunkt.Bei etwa 84 Milliliter. Analysieren Sie die Elutionsfraktionen aus den Peaks von Interesse, indem Sie die Proben auf einem 18 bis 20 %igen SDS-PAGE-Gel laufen lassen. Fraktionen, die gereinigtes Emus enthalten, sollten äquimolare Mengen der vier Kernhistonproteine aufweisen.Vereinigen Sie nun die Fraktionen, die gereinigte OCRs enthalten, und konzentrieren Sie diese mithilfe eines Zentrifugalfilters, um die endgültige Ocr-Konzentration zu bestimmen. Messen Sie die Absorption bei 280. Berechnen Sie anschließend die Konzentration unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten.Rekonstituieren Sie nukleosomale Arrays aus DNA und den gereinigten ERs, wie im Protokolltext beschrieben. Verdünnen Sie die Probe dann auf eine Extinktion von 0,5 bei 260 Nanometern. Geben Sie 400 Mikroliter der Probe in eine Zelle mit einem Zweikammer-Zentrifugierrohr, wobei die Probe auf der einen Seite und der Referenzpuffer 10 auf der anderen Seite platziert wird.Obwohl der Flüssigkeitsstand in beiden Sektoren annähernd gleich sein sollte, muss der Meniskus der Referenzprobe höher als der Meniskus der Probe sein. Beladen Sie die Zellen in den Rotor und richten Sie die Zellen ordnungsgemäß aus.Entstauben Sie vorsichtig die Linsen der Zellen mit Druckluft, indem Sie die Markierungen an der Unterseite der Zellen am Rotor verwenden. Schalten Sie die X-L-A-X-L-I-Zentrifuge ein. Setzen Sie den Rotor ein und befestigen Sie die Optik gemäß der Anleitung. Öffnen Sie die Proteom-Laborsoftware, und wählen Sie „Datei Neu“. Richten Sie einen Einzelscan bei 3000 U/min und einer Temperatur von 25 Grad Celsius ein. Benennen Sie für jede Zelle die Proben, wählen Sie eine Wellenlänge aus, wählen Sie Absorption und legen Sie einen Speicherort für die Datei auf Ihrem Computer fest.Wählen Sie unter Optionen „Stop“ aus. Führen Sie nach dem letzten Scan und der radialen Kalibrierung den Einzelscan-Durchlauf durch. Verwenden Sie den Einzelscan, um die geeignete radiale Scanlänge zu bestimmen.Über das X-L-A-X-L-I-Bedienfeld eine Geschwindigkeit von null eingeben und Stern drücken, um die Kammer auszugleichen. Mit der Software die gewünschte Geschwindigkeit und Anzahl der Scans einstellen.Höhere Zentrifugen­geschwindigkeiten erhöhen die Auflösung des Sedimentations­koeffizienten. Es sollten jedoch mindestens 20 Scans erfasst werden, bevor die gesamte Probe am Boden der Zelle sedimentiert ist. Überwachen Sie die ersten paar Scans, um einen ordnungsgemäßen Betrieb sicherzustellen.Die letzten mehreren Scans überlagern, um den Fortschritt des Laufs zu überwachen und auf mögliche Probleme wie leckenende Zellen zu prüfen. Die Analyse von Sedimentationsgeschwindigkeits-Ergebnissen sowie ein Protokoll zur Visualisierung von Arrays mittels Rasterkraftmikroskopie sind im Protokolltext beschrieben. In diesem Experiment.Lyophilisierte Xenopus-Kernhistone wurden in Octr rekonstituiert und mittels FPLC auf einer S-200-Säule gereinigt. Die unspezifischen Histonaggregate eluieren zuerst, gefolgt von Histonoctr, H3-, H4-Tetrameren und H2A-H2B-Dimeren. Die Analyse der gereinigten Octr-Fraktionen mittels SDS-PAGE zeigt äquimolare Mengen der vier Histoneproteine. Beachten Sie, dass Xip H2A und H2B Molekulargewichte aufweisen, die sich nur um etwa 200 Dalton unterscheiden, weshalb sie oft als einzelnes Band auf SDS-Gelelen erscheinen.Fraktion 64 bis 67 wurden gesammelt und zur Rekonstitution nukleosomaler Arrays aufbewahrt. Eine Bildschirmaufnahme der Proteome-Lab-Software eines einzelnen Scans, aufgenommen bei 3000 U/min, diente zur Einstellung des Messbereichs für einen UC-Zellscan. Anschließend wurde eine Reihe von Sedimentationsgeschwindigkeits-Scans bearbeitet, um einen Datensatz zu erzeugen; die rote und grüne Linie zeigen zwei verschiedene Methoden zur Darstellung der Verteilung der Sedimentationskoeffizienten.In UltraScan. Die rote Linie stellt die integrale Verteilung der Sedimentationskoeffizienten dar, während die grüne Linie die Ableitung bei der Untersuchung der Chromatinorganisation zeigt. Die in vitro Atomkraftmikroskopie ergänzt die analytische Ultrazentrifugation, um den Grad der Template-Sättigung nach der Rekonstitution zu bestimmen.Hier enthielten die meisten der 27 in der Bildgebung verwendeten SRAs 10 bis 11 Nukleosomen. Dieses 500 mal 500 Nanometer große Scan zeigt deutlich Nukleosomen-Arrays mit dem Linker-DNA. Dargestellt sind außerdem die Amplitudenkurve, die Phasenkurve und dieselbe Höhenkurve mit einer per Hand gezeichneten Linie durch die Nukleosomen, um das Höhenprofil der Nukleosomen zu bestimmen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Tagen durchgeführt werden.Während dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, darauf zu achten, die Konzentrationen Ihrer Reagenzien sehr präzise zu messen. Nach diesem Verfahren können Sie auch die Sättigungsgrade von nukleosomalen Arrays mithilfe von Techniken wie der Rasterkraftmikroskopie überprüfen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Chromatinstruktur den Weg, die Chromatinstruktur und die Chromatinverdichtung zu untersuchen.

assembly-nucleosomal-arrays-from-recombinant-core-histones-nucleosome

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie, AFM und bildgebende Techniken, um die Dynamik von Nukleosomenkomplexen zu untersuchen. Während die AFM-Spitze über die Oberfläche des Nukleosoms scannt, erkennt sie Veränderungen in der Nukleosomenhöhe und zeichnet die DNA-Enthüllung im Laufe der Zeit auf.

Hochgeschwindigkeits-Zeitraffer-Rasterkraftmikroskopie zur Erfassung der Nukleosomendynamik

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Hier präsentieren wir eine Methode, um acetylierte Histonproteine mittels genetischer Codeerweiterung auszudrücken und rekonstituierte Nukleosomen in vitro zusammenzusetzen.

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Herstellung von Nukleosomalkomplexen unter Verwendung von zwei Methoden der Probenvorbereitung zum Einfrieren von TEM-Gittern.

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt die Technik für die Herstellung von Veranstalter und animalen Pol Explantaten aus Xenopus laevis Embryonen, einschließlich der Verwendung der Augenbraue Messer eingesetzt - ein spezialisiertes Werkzeug Dissektion einer Augenbraue gemacht. Das Protokoll zur Montage eines Adhäsionsassay ist auch gegeben, die Sonden für die Präsenz der wichtigsten Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche Veranstalter oder animalen Pol Zellen, die entscheidend für die richtige Entwicklung vorhanden...

Präparation Organizer und Animal Pole Explantate aus Xenopus laevis Embryos und Montage eines Cell Adhesion Assay

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

Lernen Sie die Rekonstitution von Nukleosomen-Arrays aus rekombinanten Core-Histonen und DNA für Chromatinforschung. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zur Genregulation und Chromatinstruktur.

Versammlung der nukleosomalen Arrays von rekombinantem Core-Histone und DNA Nucleosome Positioning

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