In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, genetisch kodierte Fluor-Vierer zu verwenden, um die Kalziumdynamik einzelner Neuronen im Nematodenwurm zu messen. Sehen Sie Eleganz, dies wird erreicht, indem zunächst intakte C-Eleganz, die ein kalziumempfindliches Fluorophor in den interessierenden Neuronen exprimiert, auf einem Standard-Objektträger montiert und demobilisiert wird. Anschließend werden einzelne Neuronen in vivo mit Hilfe von Videomikroskopie und Standard-Epi-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren abgebildet.

Dann wird das Video analysiert, um die Fluoreszenzintensität an bestimmten Stellen im Neuron für zwei häufig verwendete Fluor-Vier-G-Lager zu messen, das ein robustes Einkanalsignal mit großer Amplitude liefert, und ein bundbasiertes Chamäleon, das ein Zweikanalverhältnis erzeugt. Metrische Messergebnisse sind die gezeigte neuronale Aktivität als Reaktion auf einen bestimmten sensorischen Reiz sowie die zelluläre Kalziumphysiologie als Reaktion auf zelluläre Schädigung, die beide auf der optischen Messung des relativen Kalziumspiegels innerhalb des abgebildeten Neurons basieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber ähnlichen Methoden in Wirbeltiersystemen oder konventioneller Elektrophysiologie besteht darin, dass CL elgan ein robustes, flexibles und genetisch manipulierbares System für die in vivo neuronale Bildgebung darstellt, das technisch einfach und kostengünstig ist.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in einem breiten Spektrum der feldbasierten Neuronenbiologie zu beantworten, indem sie Messungen sowohl der Aktivität als auch des Sinus mit einzelnen Neuronen in vivo ermöglicht. Beginnen Sie mit einem Standard-Verbundmikroskop mit Epi-Fluoreszenz-Bildgebungsfunktionen für beste Bild- und Signalqualität. Verwenden Sie ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur und eine gekühlte CCD-Kamera mit hoher Empfindlichkeit, um die Bildauflösung und -empfindlichkeit zu maximieren und gleichzeitig das Hintergrundrauschen für einfarbige Flora Fours zu minimieren.

Verwenden Sie das Standard-Mikroskop-Fluoreszenzfilter-Set, das für die jeweilige Wellenlänge des Fluor Four for G Camp entwickelt wurde. Verwenden Sie ein Standard-GFP-Filterset, das für die Anregung bei 488 Nanometern und die Emission bei 525 Nanometern optimiert ist. Metrische Flora-Vierer wie Chamäleon verwenden ein duales Bildgebungssystem, sodass die identischen Bilder gleichzeitig bei zwei separaten Wellenlängen aufgenommen werden können. Dies kann mit einem kommerziell erhältlichen oder selbstgebauten System erreicht werden, das Doppelbilder nebeneinander auf die Kamera projiziert, und zwar auf folgende Weise.

Ein Mikroskopfiltersatz mit einem 440 plus oder minus 20 Nanometer Anregungsfilter und einem 455 Nanometer langen Durchlass iic Spiegel einer Bildmaske, die in der anfänglichen Bildebene unmittelbar außerhalb der Mikroskop-Bildgebungsöffnung platziert ist, wo der CCD-Sensor der Kamera normalerweise den ersten Relaisobjektivsatz sitzen würde, eine Brennweite von der ursprünglichen Bildebene entfernt, so dass er das Licht sammelt, Ein dichroitischer Spiegel, der das Licht in zwei separate Abbildungswellenlängen oder -kanäle aufteilt, die eine Farbe reflektieren, während sie die anderen Emissionsfilter durchlassen. Das transmittierte Licht wird weiter auf die spezifischen Abbildungswellenlängen beschränkt. Die zweite Relaislinse, eine für jeden Kanal, die so in den Strahlengängen platziert sind, dass sie das Licht auf eine zweite Bildebene an der CCD-Kamera fokussieren.

Ein Paar Spiegel und ein zweiter dichroitischer Spiegel lenken die Strahlengänge so, dass die beiden Bilder rekombinieren und nebeneinander auf die Kamera projiziert werden. CCD-Sensor. Hier ist ein Beispiel für das resultierende Bild.

Nach der Einrichtung können die Bilder wie folgt angepasst und fein abgestimmt werden: Verschieben Sie die Kameraposition so, dass das übertragene Bild die Hälfte des Sichtfelds der Kamera abdeckt. Verschieben Sie das reflektierte Bild so, dass es die andere Hälfte des Sichtfelds abdeckt, indem Sie die letzten beiden Spiegel im Strahlengang anpassen, und optimieren Sie den Fokus, indem Sie die zweite Relaislinse für jeden Kanal entlang des Strahlengangs hin und her bewegen. Erwerben Sie Tiere, die ein kalziumempfindliches Fluorophor in dem interessierenden Neuron exprimieren, vom Citis-Genzentrum oder aus anderen Quellen.

Alternativ können transgene Tiere mit Standard-Robben-Elgan-Techniken konstruiert werden. Verwenden Sie dann eine der folgenden Techniken, um die Siegeleleganz für die pharmakologische Lähmung bei 0,05 % Leal bis 2 % Aros zu immobilisieren, und stellen Sie Aros-Pads für die Bildgebung her, indem Sie einen Tropfen geschmolzenen Aros zwischen zwei Glasobjektträger drücken, die zwei Stücke Laborklebeband als Abstandshalter haben. Nachdem Sie die obere Rutsche entfernt haben, wählen Sie fünf bis 10 Tiere aus und setzen Sie sie auf das Pad.

Decken Sie das Pad mit einem Deckglas ab und tragen Sie kleine Mengen einer heißen Eins-zu-Eins-Mischung aus Paraffinwachs und Vaseline auf die Ecken auf, um es in Position zu halten. Warten Sie fünf bis 10 Minuten, bis das Lemid wirkt und die Tiere völlig still werden. Um Tiere mit einer Stiff Aros-Methode zu immobilisieren, stellen Sie 10%Aros-Pads her.

Geben Sie etwa drei Mikroliter einer Mikrokügelchenlösung von ein bis 10 Polystyrol-Mikrokugeln auf die Oberfläche der Pads und pflücken Sie schnell fünf bis 10 Clean Sea Elegance in den Pool mit Rübenlösung. Decken Sie es vorsichtig mit einem Deckglas ab und tragen Sie geschmolzenes Wachs auf die Ecken auf. Typische Experimente erfordern die Verabreichung eines bestimmten Reizes oder Zustands an das Tier, während die Reaktion eines einzelnen Neurons auf Video aufgezeichnet wird.

Für die Videoaufnahme. Wir fotografieren häufig mit etwa einem Bild pro Sekunde und einer Belichtungszeit von etwa 300 Millisekunden. Das Video muss analysiert werden, um die Fluoreszenzintensität für jedes Bild innerhalb des interessierenden Bereichs oder ROI des abgebildeten Neurons im Verhältnis zu einem nahe gelegenen Hintergrundbereich zu messen.

Unser Analyseprogramm zeigt ein komprimiertes Bild aller Bilder im Film an, aus dem manuell eine grobe Grenze ausgewählt wird, die das Objekt von Interesse in allen Bildern umfasst, und ein unabhängiger Hintergrundbereich ausgewählt wird. Für die erste wird manuell ein ROI aus dem Grenzbereich ausgewählt. Für jedes nachfolgende Frame wählt das Programm die hellsten Pixel innerhalb des Grenzbereichs aus, um einen ROI in der richtigen Größe für mit Chamäleon erzeugte Ratio-Metric-Bilder zu erzeugen, wählt einen ähnlichen groben ROI und Hintergrundbereich für jedes der Dual-Bilder oder Kanäle aus und dann den ROI von einem Bild im ersten Frame. Das Fluoreszenzsignal F für jedes Bild wird berechnet als die durchschnittliche Pixelintensität in der ROI abzüglich der durchschnittlichen Intensität im Hintergrundbereich.

Der relative Kalziumgehalt für jedes Frame wird als prozentuale Intensitätsänderung berechnet, die auf einen anfänglichen Ausgangswert normiert wird, der aus dem ersten Frame oder der ersten Frame-Serie gemessen wurde. Die Werte der Verhältnismetrik werden als Verhältnis der beiden Kanäle berechnet. Ein ROI, der innerhalb des Zellkörpers selektiert wird, erzeugt die stärksten und robustesten Signale, aber es ist auch möglich, Signale aus einem ROI entlang der Nervenprozesse auszuwählen und zu messen.

Die Einwirkung von Anregungslicht kann zu einer Bleiche der Flora vier führen und ist durch eine stetige Abnahme des Signals gekennzeichnet, die von den Expositionswerten abhängt, wenn es zu einer Bleiche kommt. Reduzieren Sie die Belichtungszeiten und/oder die Anregungsintensität mit Neutraldichtefiltern, um das Rauschen zu minimieren, das durch die Bewegung der Meereseleganz während der Aufnahme entsteht. Führen Sie die Immobilisierungsprozeduren als Reaktion auf Lichteinwirkung und experimentelle Reize sorgfältig mit sauberen Präparaten durch.

Wählen Sie für eine erfolgreiche Bildanalyse Hintergrundbereiche, die einigermaßen einheitlich dunkler sind als das Bild zum Neuron und ausreichend weit entfernt sind, um Streulicht zu vermeiden. Hier ist ein einzelnes C elegance zu sehen, ein SJ-Neuron, das G Camp exprimiert und auf ein externes elektrisches Feld von drei Volt pro Zentimeter reagiert, und zwar in drei separaten Versuchen, die jeweils 10 Sekunden dauern. Das Tier wurde mit Lemisol immobilisiert, aber das Video zeigt leichte Bewegungs- und Fokusfehler.

Die Intensität der Driftfluoreszenz wurde am Zellkörper gemessen. Das Signal ist robust, obwohl die Videofehler einen starken Anstieg der Fluoreszenz um etwa 250 % als Reaktion auf den ersten und dritten Stimulus zeigen. Das Ergebnis der zweiten Stimuli ist deutlich reduziert.

Die Variabilität des neuronalen Response-Bleachings ist minimal, was sich an der Rückkehr zu einem konsistenten Ausgangsniveau zeigt. Eine traumatische zelluläre Schädigung löst eine große Kalziumtransiente in einem Neuron aus, die eine wesentliche Rolle bei der physiologischen Reaktion der Zelle spielt. Dieses Video zeigt die durch Schädigung induzierte Reaktion eines einzelnen Neurons auf Laser-Ex-Sodomie.

Duale Abbildungsoptiken wurden eingesetzt, um Signale sowohl von den CFP- als auch von den YFP-Fluoreszenzkanälen des Chamäleon-Reporters aufzuzeichnen. Diese Abbildung zeigt das resultierende Bundsignal, das im Laufe des Laserchirurgie-Experiments am Zellkörper gemessen wurde. Als Reaktion auf eine Laserschädigung beträgt ein Anstieg des zytoplasmatischen Kalziums bei T null Sekunden.

Der CFP sinkt schnell ab und der YFP steigt, was zu einem sofortigen Anstieg des Ratio-Metriksignals um etwa 200 % führt, das etwa 90 Sekunden lang anhält, bevor es in die Nähe des Ausgangsniveaus zurückfällt. Das Bleichen ist minimal, wie aus der konsistenten Ausgangslage hervorgeht. Diese Abbildung zeigt das resultierende Bundsignal, wie es im Axonsegment in der Nähe des hiesigen Schnittpunktes gemessen wurde.

Die lokale Menge an Fluorvier variiert im Verlauf des Experiments. Erschwerend kommt hinzu, dass die Signallaseroperation das Axon durchtrennt und die Membran kurzzeitig aufreißt, wodurch Flora vier entweichen kann und ihre lokale zytoplasmatische Konzentration vorübergehend reduziert wird. Dies zeigt sich an einer anfänglichen Abnahme der YFP-Spur zu späteren Zeitpunkten.

Das abgetrennte Ende quillt im Rahmen seiner kontinuierlichen Gewinnung auf, was zu einer stärker lokalisierten Fluoro-Vier-Substanz und einer Erhöhung der Intensität führt. Dies zeigt sich am deutlichsten in der langsam ansteigenden CFP-Kurve, jedoch betreffen diese Schwankungen beide Kanäle gleichermaßen und das Bundverhältnis kompensiert effektiv ein robustes Signal. Die resultierende Messung zeigt eine ähnliche Reaktion wie im Zellkörper mit einer sofortigen Signalerhöhung von etwa 150 %, einer dramatischen Erholung in die Nähe des Ausgangswerts nach etwa 90 Sekunden und dann einer zusätzlichen kleineren sekundären Reaktion nach etwa 150 Sekunden.

Kommerzielle Mikroskopaufsätze für die verhältnismetrische Bildgebung sind verfügbar, ebenso wie ausgefeiltere Bildanalysesoftware, die metrische Messungen des Pixel-für-Pixel-Verhältnisses erzeugt. Sobald diese Techniken beherrscht sind, können sie relativ einfach und ohne die komplizierte Probenvorbereitung, Gewebedissektion oder bildgebende Verfahren durchgeführt werden, die bei anderen Modellsystemen oder -methoden erforderlich sind. Ganze Experimente können bei ordnungsgemäßer Durchführung in ein oder zwei Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Eleganz für die Bildgebung immobilisieren, eine maximale Videokopie an einzelnen Neuronen in vivo durchführen und das resultierende Video analysieren, um den relativen Kalziumspiegel basierend auf dem Neuron zu messen.