Name: Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus Arabidopsis thaliana Seeds (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur Isolierung junger Embryonen aus Arabidopsis thaliana Samen für transkriptomische und epigenetische Analysen. Diese Technik ermöglicht die schnelle Gewinnung von bis zu 40 Embryonen.

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Wir möchten Tal Nawy und Martin Bayer für ihre Beratung auf den Embryo Isolierung danken. MTR, VG, UG und CB entwickelt der Embryo Isolierung Ausrüstung. MTR, VG und CB entwickelt der Embryo Isolation Protokoll. MTR, VG und CB etablierte das Protokoll, die Embryonen isoliert und erzeugten Embryo-cDNA durchgeführt VG die PCR, MTR die GUS-Färbung, JJ die FISH Experimente. MTR, VG, CG und UG schrieb das Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Universität Zürich, ein Stipendium der Roche Research Foundation (MTR) und Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds (UG und CB) finanziert.

Das Verfahren ist in dem Flussdiagramm in 1 gezeigt zusammengefasst. Die Mikrokapillaren und die instrumentale Setup sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt und typische Schritte Embryo Isolierung sind in Abbildung 4 dargestellt. 1. Material-und Buffer Vorbereitung 1.1 Silicon Beschichtung von Glas Mikrokapillaren <ol><li> Legen Sie die Mikrokapillaren in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) und invertieren mehrmals. </li><li> Entfernen Sie die Lösung, platzieren Sie den Falcon Röhrchen mit der Kapillaren in einer Aluminiumfolie und backen Sie sie für 3 Stunden bei 60 ° C Lagerung bei Raumtemperatur. </li></ol> 1.2 Erhalten ~ 50-100 um Durchmesser mikrokapillaren Tipps <ol><li> Ziehen 1 mm Durchmesser Glaskapillaren entweder manuell über einen Bunsenbrenner oder durch Verwendung eines handelsüblichen Abzieher (vertikale Faden Abzieher oder Feinpipettenziehvorrichtung). </li><li> Verwenden Sie eine Diamant-Filzstift oder Klinge, um die Spitze der Kapillare gezogen geschnitten, um die gewünschte Öffnung zu schaffen. Wählen Sie die beste-förmigen Kapillaren unter einem Stereomikroskop. Die Öffnung sollte 50-100 um (Abbildung 2). </li></ol> 1.3 Slide Vorbereitung <ol><li> Siliconize sauber Schlitten durch die alle Vertiefungen mit Sigmacote (~ 1 ml / Folie) für 5 min, zu entfernen. Bake 3 Stunden in Alufolie. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Multi-Well-Glas Objektträger für 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in Nuklease-freiem Wasser (DEPC autoklaviert-ddH 2 O), 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 100% Ethanol, Luft- trocknen. Alle Schritte werden in autoklavierte Coplin Gläser getan. Folien können mehrmals verwendet werden, sofern eine gründliche Reinigung zwischen jedem Gebrauch. </li><li> Unmittelbar vor dem Embryo isoliert Ausbreitung ~ 0,5 ul 10 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Pipette über die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung und an der Luft trocknen. </li></ol> 1.4 Mikroskop und Kapillar-Setup &lt;ol&gt; <li> Mit einem inversen Mikroskop mit 10x und 20x Vergrößerung Ziel. Optimieren Sie das Licht Kontrast (Embryonen sind sehr transparent). </li><li> Legen Sie eine Mikromanipulators die Glaskapillare neben dem Mikroskop zu halten. Die Glaskapillare mit einem Mikroinjektor (3A) oder einem regelmäßigen P-200 Pipette über einen Gummischlauch verbunden (Fig. 3B, siehe die Diskussion für eine ausführliche Beschreibung des Setup). </li><li> Legen Sie die Kapillare über dem Objektträger bei einer ~ 70 ° Winkel (Abbildung 3) und passen Sie die Position, um die Öffnung in das Blickfeld zu haben. </li><li> Kurz vor dem Embryo Isolation aufnehmen und abgeben ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) zur Beschichtung der Kapillare. </li></ol> 1.5 Puffer Tabelle 1 listet die Isolierung und Zielpuffer Abhängigkeit von den Downstream-Anwendungen. <ol><li> Bereiten ~ 1 ml Isolation Puffer pro Probe vor Gebrauch frisch und bewahren Sie es auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Ziel-Puffer in einem 0,5 ml Eppendorf schwach bindende Röhrchen auf Eis (molekulare Anwendungen) oder auf einem Objektträger (zytologische Anwendungen) in einer feuchten Kammer. </li></ol> 2. Seed Dissection und Embryo Extraction 2.1 Synchronisation von Seed Entwicklung <ol><li class="jove_content"> Emasculate Blumen und halten sie 2 Tage im Wachstum der Kammer, während die Vermeidung von Kontakt der exponierten pistils mit anderen Blumen, dann bestäuben sie (z. B. 11). </li><li class="jove_content"> Testen Sie die Stufe der Entwicklung unter den Wachstumsbedingungen durch mikroskopische Untersuchung von Saatgut gelöscht. Mit unserem Wachstumsbedingungen (16 Stunden Licht bei 21 ° C, 8 Stunden Dunkelheit bei 18 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit) Samen gesammelt 2,5 Tage nach der Bestäubung (DAP) lieferte hauptsächlich 2-4 Embryonen und Samen gesammelt 3,5-4 DAP ergab Kugelsternhaufen Embryonen. </li></ol> 2.2 Seed Dissection und Rupture <ol><li> Entfernen Sie die seeds 10-15 Schoten (~ 2,5 DAP) unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette und Insulin Nadeln. </li><li> Tauchen Sie die Samen in 20 ul Isolation Puffer in einem 2-ml-Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt. </li><li> Vorsichtig zerdrücken Sie die Samen mit einer Kunststoff-Stößel (mit 10% SDS Pre-gereinigt, gespült mit DEPC-ddH2O gewaschen und mit 70% Ethanol), um die Embryonen freizugeben, bis die Samen-Extrakt ist bewölkt. Die Kraft anzuwenden ist, die von jedem Benutzer bei Versuch bestimmt werden. </li><li> Spülen Sie den Stößel mit 300 ul Puffer, um die Isolation Stößel waschen und Verdünnen Sie die Probe. </li><li> Spin-down der Extrakt bei 5.000 xg für 5 Sekunden. Vorsichtig resuspendieren pelletiert Extrakt durch Pipettieren up-and-down 2-3 mal. </li><li> Der Extrakt wird mit einer 30 um Nylon-Mesh (montiert auf Rohr-Adapter, zB von PartecCelltricks). Spülen Sie die Masche mit einer zusätzlichen Isolierung 200 ul Puffer. </li></ol> 3. Embryo Isolation 3.1 Slide Vorbereitung <ol> &lt;li&gt; Ein sauberes, BSA-beschichteten und silikonisierten Multi-Well-Schieber auf der Bühne des inversen Mikroskop, suspendieren die gefilterte Extrakt durch Pipettieren vorsichtig nach oben und unten und Pipette 2 Tropfen von 40-50 ul-Extrakt in 1 oder 2 Brunnen . Screening nur 1 bis 2 Tropfen auf einmal verhindert die Verdunstung der Probe. </li><li> Platz 50 ml frisches Isolation Puffer (1. wash &amp; Drop) in eine Vertiefung einer anderen Folie wie zuvor vorbereitet. Bewahren Sie diese Folie in einem überdachten, feuchten Kammer, um Verdunstung zu verhindern. </li></ol> 3.2 Bildschirm, reinigen, sammeln <ol><li> Bildschirm Der Tropfen Extrakt für Embryonen in der gewünschten Stufe mit dem 10-facher Vergrößerung Ziel. Bestätigen Sie ggf. die Bühne mit dem 20-facher Vergrößerung. Die Embryonen in der Regel an der Unterseite des Schlittens sinken. </li><li> Manuell entfernen Sie Schmutz rund um den Embryo mit einer Wolfram-Nadel, einer Insulin-Nadel oder ähnlichen Geräten. </li><li> Bewegen Sie die Glaskapillare in der Nähe der Embryo mit dem Mikromanipulators take up des Embryos mit so wenig wie möglich Lösung. </li><li> Sammle mehrere Embryonen (z. B. alle ein Tröpfchen) und lassen sie in der 1. Wäsche Tropfen (molekulare Anwendung) oder in Ziel-Puffer (zytologische Anwendungen). Jede Runde sammeln sollte innerhalb von 5-10 min und Embryonen aufbewahrt werden sollten in einem minimalen Volumen (das Gesamtvolumen aller Sammeln Runden sollte &lt;5 ul sein) gesammelt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Screening und Sammlung, bis die gewünschte Menge an Embryonen in der 1. Wäsche Tropfen gesammelt (zentral, wenn möglich, um Erinnerung zu erleichtern). </li><li> Erinnern Sie alle Embryonen auf einmal aus der Wäsche Tropfen (wenn Schutt durchgeführt werden über, entfernen Sie sie mit einer Nadel vor Erinnerung). </li><li> Lassen Sie die Embryonen in einem 2. waschen Tropfen von 50 pl. Wiederholen 3.2.6. </li><li> Lassen Sie die Embryonen in der Ziel-Puffer. Die Übertragung sollte beinhalten nur einen Kontakt, und nicht Eintauchen der Kapillare Spitze. </li><li> Ersetzen Sie die microcapillARY für die nächste Probe. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir entwickelten einen Embryo Isolation Protokoll, das eine schnelle, effektive ist, und kann leicht an andere Labors übertragen werden. Die beschriebenen Geräte besteht hier aus einem inversen Mikroskop, einem Mikromanipulator, Glas-Mikrokapillaren ein vertikaler Faden Abzieher und Mikroinjektor (Abbildung 3A). Das Setup ist ähnlich dem für Einzeltier Zellisolation für Transkriptom-Analysen 17 beschrieben. Wir haben auch erfolgreich mit einem Basis-Setup, wo Glas...

Der Embryo von Blütenpflanzen wird durch das Endosperm, ein Nährgewebe von einer zweiten Düngung Veranstaltung abgeleitet umgeben. Sowohl Embryo und Endosperm durch mehrere Zellschichten der Samenschale umgeben. Gemeinsam bilden diese Gewebe einen Samen, der in der Frucht zu entwickeln. So werden Gewebe-und Zell-spezifische Analysen von Arabidopsis Embryonen stark beeinträchtigt durch ihre Unzugänglichkeit. Dennoch sind Embryonen bei den späten Kugelsternhaufen oder späteren Phasen relativ gut zugänglich manuelle Dissektion mit feinen Wolfram Nadeln unter dem Stereomikroskop, oder durch leichten Druck auf das Saatgut mit einer Pinzette, um sie zu extrahieren. Solche Techniken wurden erfolgreich für Transkriptom oder epigenome Profiling Analysen wie Microarray-Hybridisierung, Bisulfit-Sequenzierung oder RNA-Sequenzierung (zB 1-3) verwendet. Im Gegensatz dazu bleiben Studien von Embryonen bei der Zygote bis Anfang globulären Stadium technisch anspruchsvoll. Bisher haben nur wenige Studien reported Transkriptomanalysen auf junge Embryonen entweder mit Laser-Mikrodissektion (LCM) von embryonalen Geweben von festen Samen Abschnitten 4 oder manuelle Extraktion einzelner Embryonen aus Samen mit feinen Werkzeugen 5. Allerdings ist LCM Ausrüstung nicht allgemein verfügbar und manuelle Extraktion Embryos in frühen Stadien ist zeitaufwendig und erfordern hervorragende Präparation Fähigkeiten, die nicht leicht übertragbar. Neben genomweite Analysen, in situ Genexpressionsanalysen sind auch schwierig, auf junge, whole-mount Embryonen von Arabidopsis durchzuführen. In gewissem Umfang können junge Embryonen auf Objektträgern durch sanften Druck auf die Samen freigesetzt werden und für Reportergen-Assays oder Protein Erkennung durch Immunfärbung (siehe zum Beispiel 6,7). Diese Technik ist jedoch nicht erlaubt High-Throughput-Embryo Isolierung und behindern so quantitative Analysen. Deshalb entwickelten wir eine effiziente und schnelle Protokollfür frühe Embryo isoliert von Arabidopsis Samen, die einfach zu installieren, leicht übertragbar und eignet sich für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Das Grundprinzip besteht darin, vorsichtig zerdrücken Samen - seziert von jungen Schoten in ein Eppendorf-Röhrchen mit einem Kunststoff-Stößel in einer geeigneten Isolierung Puffer. Der Extrakt wird in Tröpfchen auf einer Multi-Well-Objektträger aufgebracht und auf das Vorhandensein des freigesetzten Embryonen bei der gewünschten Stufe gescreent unter Verwendung eines invertierten Mikroskops. Die Embryonen werden gesammelt mit einem Glas zu einem Mikroinjektor oder einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren. Für molekulare Anwendungen werden Embryonen zweimal durch wiederholte Freisetzung in Tropfen neue Isolierung Puffer vor der Übertragung auf den Zielpuffer in einem minimalen Volumen gewaschen. Für zytologische Anwendungen (Reporter-Assays, Immunfärbung FISH), können Waschschritte verzichtet werden. Das Verfahren bietet mehrere Vorteile: (i) es ergibt 25-40 Embryonen in ~ 45 min für die zytologische Appfentlichungen oder in 3-4 Stunden für die molekulare Anwendungen (einschließlich der Waschschritte), (ii) es ermöglicht Isolierung spezifischer embryonalen Stadien, (iii) es ist leicht auf andere Personen übertragbar und Labors aufgrund seiner einfachen Setup, (iv) es erfordert erschwinglichen Geräten für die Grundeinstellungen, die zugänglich für Upgrades ist, und (v) wurde erfolgreich für verschiedene nachgelagerte Anwendungen wie RNA-Sequenzierung 8, Gen-spezifischen DNA-Methylierung Analyse 9, Reporter-Assays (10 und Raissig et al. verwendet, in prep.) und FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux unveröffentlicht, siehe Abbildung 5).

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (Lebenstechnologien)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Erststrangpuffer</td><td>Invitrogen (Lebenstechnologien)</td><td>18064-022</td><td>enthalten im Superscript II-Paket</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (Lebenstechnologien)</td><td>18064-022</td><td>enthalten in der Packung Superscript II</td></tr>, <tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) 100x = 10 mg/ml</td><td>, New England Biolabs, Inc.</td><td></td><td>Verschiedene Anbieter sind ebenfalls erhältlich</td></tr><tr><td>: Dünnwandige Kapillaren 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Röhrchen 0,5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>5Vertiefungen Objektträger mit 10 mm Durchmesser</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Thermo Fisher J1800AMNZ</td><td></td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td></tr><tr><td></td><td>Tris Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestle</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Microfine Insulin Spritzen</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon TMS (Japan),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipulator Post Mount LH1 Sonde</td><td>Leica Mikrosysteme</td><td>39430101</td><td>Andere Marke wird auch die Arbeit erledigen</td></tr><tr><td>Vertikaler Filamentabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-20 Modell</td><td>Andere Modelle sind auch geeignet </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Invitrogen (Lebenstechnologien</td><td></td><td></td>)</tr></tbody></table>

effiziente und schnelle isolierung von frühphasen-embryonen aus<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In Blütenpflanzen, entwickelt der Embryo innerhalb einer nährenden Gewebe - das Endosperm - von den mütterlichen Saatgut Integumente (oder Samenschale) umgeben ist. Als Folge wird die Isolierung von pflanzlichen Embryonen in frühen Stadien (1 Zelle Kugelsternhaufen Stufe) technisch anspruchsvolle aufgrund ihrer relativen Unzugänglichkeit. Effiziente manuelle Zerlegung in frühen Stadien ist stark durch die geringe Größe der jungen Arabidopsis Samen und die Haftfähigkeit des Embryos in die umliegenden Gewebe beeinträchtigt. Hier beschreiben wir eine Methode, die die effiziente Isolierung von jungen Arabidopsis Embryonen ermöglicht, wodurch bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden, abhängig von der nachgeschalteten Anwendung. Die Embryonen werden in die Isolation Puffer durch leichtes Quetschen 250-750 Samen mit einer Kunststoff-Stößel in ein Eppendorf-Röhrchen veröffentlicht. Ein Glas entweder mit einem Standard-Labor-Pipette angebracht mikrokapillaren (über einen Gummischlauch) oder eine hydraulisch gesteuerte Mikroinjektor wird verwendet, um Embryonen aus Tröpfchen Ort zu sammelnd auf einer Multi-Well-Folie auf einem invertierten Lichtmikroskops. Die technischen Fähigkeiten erforderlich sind einfach und leicht übertragbar, und die grundlegende Einrichtung erfordert keine teure Ausrüstung. Erhaltene Embryonen sind geeignet für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, DNA-Methylierungsanalyse, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), Immunfärbung und Reportergen-Assays.

Unsere Embryo Isolation Verfahren (Abbildung 1) ermöglicht die Isolierung von bis zu 40 Embryonen in 4 Stunden, wenn Waschungen durchgeführt werden, z. B. für die molekulare Anwendungen oder in weniger als einer Stunde, wenn Wäschen weggelassen werden, zB für die zytologische Anwendungen. Abbildung 2 zeigt hohe und niedrige Qualität mikrokapillaren Tipps und Abbildung 3 zeigt den Aufbau des Embryos Isolierung Maschine. Abbildung 4 zeig...

Wir berichten über eine effiziente und einfache Methode, um Embryonen in frühen Stadien der Entwicklung Isolat aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Samen. Bis zu 40 Embryonen in 1 Stunde bis 4 Stunden isoliert werden, abhängig von der Downstream-Anwendungen. Das Verfahren eignet sich für die Transkriptom-, DNA-Methylierung, die Expression des Reportergens, Immunfärbung und Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung analysiert.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, junge Pflanzenembryonen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Samen zerlegt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Samen in einem Isolationspuffer vorsichtig zu zerkleinern.Als nächstes werden die Embryonen gescreent und dann durch Mikroaspiration unter einem inversen Mikroskop entnommen. Der letzte Schritt besteht darin, alle Embryonen nach dem Waschen in einem minimalen Volumen wieder zu sammeln und in den Zielpuffer zu überführen. Letztendlich können Embryonen für die RNA- oder DNA-Extraktion verwendet werden, um das Transkriptom oder Epigenom zu analysieren, oder für zytologische Analysen, wie z. B. Genreporter-Assays oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Pflanzenembryonen in großen Mengen und in bestimmten Entwicklungsstadien isoliert werden können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, keine Probleme haben, sie schnell und effizient anzuwenden. Wählen Sie zunächst unter einem Stereomikroskop die am besten geformten Kapillaren aus, die zuvor silikonisiert, gezogen und geschnitten wurden.Wie im Textprotokoll beschrieben, sollte die Öffnung glatt und etwa 50 bis 100 Mikrometer groß sein. Waschen Sie anschließend die silikonisierten Multiwell-Glasmikroskop-Objektträger nach dem Waschen 10 Minuten lang in Coplin-Gläsern in 10 % SDS. Waschen Sie die Objektträger zweimal zwei Minuten lang.In nukleasefreiem Wasser für zwei Minuten in 70% Ethanol für zwei Minuten in 100% Ethanol und dann an der Luft trocknen. Verteilen Sie dann etwa 0,5 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter, Rinderserumalbumin oder BSA mit einer Pipette über die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung und trocknen Sie sie an der Luft. Bereiten Sie als Nächstes das Embryo-Isolationsmikroskop vor.Verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit einem Objektiv mit 10-facher und 20-facher Vergrößerung. Verbinden Sie die Glaskapillare mit einem Mikroinjektor, um die Mikrokapillare zu beschichten. Nehmen Sie etwa sechs Mikroliter BSA auf und geben Sie es ab.Sammeln Sie Sleeks im gewünschten Entwicklungsstadium, entweder nach Kreuzungen oder Selbstbefruchtungssohlen. 2,5 Tage nach der Bestäubung werden hier verwendet und enthalten zwei bis vier Zellembryonen. Entnehmen Sie die Samen von 10 bis 15 LICs unter einem Stereomikroskop mit Pinzette und Insulin. Nadeln.Tauchen Sie die Samen in 20 Mikroliter Isolationspuffer in ein zwei Milliliter langes Rohr mit rundem Boden, das auf Eis gestellt wird. Zerkleinern Sie die Samen vorsichtig mit einem Plastikstößel, der wie im Textprotokoll beschrieben vorgereinigt ist, um die Embryonen freizusetzen, bis der Samenextrakt trüb ist. Die anzuwendende Kraft ist von jedem Benutzer bei der Prüfung zu bestimmen.Spülen Sie den Stößel mit 300 Mikrolitern Isolationspuffer ab, um den Stößel zu waschen und die Probe zu verdünnen. Schleudern Sie den Extrakt nach der Zentrifugation fünf Sekunden lang bei 5.000 Chi herunter. Suspendieren Sie den pelletierten Extrakt vorsichtig, indem Sie ihn zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren.Filtern Sie den Extrakt mit einem 30-Mikron-Nylonnetz, das auf Schlauchadaptern montiert ist, und schwenken Sie den Schlauch. Spülen Sie das Netz mit zusätzlichen 200 Mikrolitern Isolierung, Puffer und Schwenk. Wieder. Um Objektträger für die Embryoisolierung vorzubereiten, legen Sie einen sauberen, BSA-beschichteten und silikonisierten Multiwell-Objektträger auf den Tisch des inversen Mikroskops.Platzieren Sie die Kapillare über dem Schieber und stellen Sie die Position so ein, dass die Öffnung im Sichtfeld ist. Nach der Resus-Behandlung wird der filtrierte Samenextrakt durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren von zwei Tröpfchen mit 40 bis 50 Mikrolitern Samenextrakt in eine oder zwei Vertiefungen suspendiert. Das Screening von nur einem oder zwei Tropfen auf einmal verhindert die Verdunstung der Probe: Geben Sie 50 Mikroliter frischen Isolationspuffer in eine Vertiefung eines anderen Objektträgers, der wie zuvor vorbereitet wurde.Als erster Waschtropfen dienend. Bewahren Sie diesen Objektträger in einer abgedeckten Feuchtkammer auf, um eine Verdunstung zu verhindern. Untersuchen Sie die Tröpfchen des Samenextrakts auf Embryonen im gewünschten Stadium mit dem Objektiv mit 10-facher Vergrößerung, falls erforderlich.Bestätigen Sie den Tisch mit der 20-fachen Vergrößerung. Die Embryonen sinken in der Regel auf den Boden der Rutsche. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Entnahme von Embryonen mit minimalem Rückstand.Dies kann durch die Reinigung mit einer Wolframnadel, durch sorgfältige Kontrolle des Waschtropfens auf mögliche Ablagerungen und durch Wiederholen der Wäsche bei Bedarf erreicht werden. Entfernen Sie manuell Ablagerungen um den Embryo herum mit einer Wolframnadel, einer Insulinnadel oder einem ähnlichen Gerät. Bewegen Sie die Glaskapillare mit dem Mikromanipulator in die Nähe des Embryos und nehmen Sie den Embryo mit so wenig Lösung wie möglich auf.Entnehmen Sie mehrere Embryonen und geben Sie sie in der ersten Wäsche frei. Tropfen. Für molekulare Anwendungen für zytologische Anwendungen können die Embryonen direkt in den Zielpuffer gelangen. Jede Entnahmerunde sollte innerhalb von fünf bis 10 Minuten durchgeführt werden, und die Embryonen sollten in einem minimalen Volumen entnommen werden.Wiederholen Sie das Screening und die Entnahme, bis die gewünschte Menge an Embryonen im ersten Waschtropfen entnommen ist. Wenn Schmutz in den Waschtropfen gelangt, entfernen Sie ihn mit einer Nadel, bevor Sie alle Embryonen auf einmal aus dem Tropfen entnehmen. Geben Sie die Embryonen in einen zweiten Waschtropfen von 50 Mikrolitern und wiederholen Sie die Sammlung.Zum Schluss setzen Sie die Embryonen in den Zielpuffer frei. Der Transfer sollte nur einen Kontakt und kein Eintauchen der abgebildeten Kapillarspitze beinhalten. Hier sind mehrere Embryonen im letzten Tropfen nach dem Waschen.Die isolierten Pflanzenembryonen können nun für verschiedene nachgelagerte Anwendungen zur Kontrolle der embryonalen Zöliakie NA verwendet werden. Bibliotheken vor der Sequenzierung. Embryospezifische Transkripte wurden amplifiziert und gezeigt. Hier sind die Ergebnisse der PCR-Amplifikation auf CD NA. Bibliotheken von zwei- bis vierzelligen Embryonen, die einmal gewaschen wurden, und auf genomischer DNA hat sich die Isolierung von Embryonen in Reportergen-Assays mit geringer embryonaler Expression als sehr nützlich erwiesen, und wo die mütterliche Samenhülle den Nachweis verwirrt, zeigt hier ein Embryo, der ein GUS-Reportergen unter der Kontrolle des Madea-Promotors exprimiert.Schließlich wurde die Fluoreszenz-in-C-Zwei-Hybridisierung angewendet, um die Kernarchitektur in isolierten Embryonen zu untersuchen, die in Acrylamid-Pads auf Objektträgern eingebettet waren. Ein Beispiel mit Sonden gegen die Zentromer-Wiederholungen und die unteren Organisationsregionen des Kerns ist hier zu sehen. Sobald diese Technik beherrscht wird, ermöglicht sie die Isolierung von 30 Embryonen in weniger als einer Stunde für zytologische Anwendungen und in weniger als drei Stunden für molekulare Anwendungen, einschließlich aller Waschschritte.Tatsächlich wird diese Technik es der Pflanzenforschung ermöglichen, genetische und epigenetische Mechanismen in der Embryogenese zu erforschen.

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Biology

Biologie

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von intakten Protoplasten aus Geweben des 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis. Da die isolierten Protoplasten intakt bleiben für mindestens 96h und sind aus Sämlingen statt einer Monate alten reifen Pflanzen isoliert, beschleunigt dieses Verfahren Assays erfordert intakte Protoplasten.

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