Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gesunde Inseln zu isolieren, um Unterschiede in der zyklischen AMP-Produktion als Reaktion auf verschiedene experimentelle Behandlungen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Inseln aufgeblasen und im zweiten Schritt die Bauchspeicheldrüse entfernt wird. Die gesunden Inseln werden durch eine Abfolge von Zentrifugier- und Waschschritten isoliert.

Anschließend werden die lebensfähigen Augen in frisches Inselkulturmedium überführt und über Nacht inkubiert. Im letzten Schritt werden die Augen den gewünschten experimentellen Behandlungen ausgesetzt und ein cAMP-Assay durchgeführt. Abschließend kommt ein enzymgekoppelter Immunosorbensassay zum Einsatz, um die Änderungen der cAMP-Produktion als Reaktion auf verschiedene Behandlungen der Augen zu messen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es viel Übung erfordert, eine vollständige Pankreasinflation zu erreichen. Laden Sie zunächst eine Spritze und Kanüle mit fünf Milliliter Kollagenaselösung vor. Befestigen Sie eine stumpfe Nadel mit 30 G an der Kanüle und stellen Sie die mit der Kanüle verbundene Spritze auf Eis.

Nachdem der Dünndarm auf die rechte Seite der Maus verschoben wurde, suchen Sie den Oddi-Sphinkter, der am Ende des Ductus choledochus liegt und sich auf den Dünndarm aufweitet, wodurch ein weißes Dreieck entsteht. Sobald der Sphinkter lokalisiert ist, nehmen Sie eine Pinzette der Größe Nr. 5 (Dumont) und schieben die Spitze so nah wie möglich unter den Ductus choledochus, ohne den Ductus zu verletzen.

Nachdem Sie die Wand des Dünndarms und das Bindegewebe durchbohrt haben, greifen Sie mit der Spitze der Dumont-Zange die Naht und ziehen sie unter den Ductus choledochus. Ligieren Sie den Ductus choledochus so nahe wie möglich am Sphinkter des OD, wobei sichergestellt werden muss, dass der Knoten straff gezogen ist, um ein Austreten von Flüssigkeit zu verhindern. Fassen Sie danach beide Enden der Naht und ziehen Sie sie in Richtung Pankreas-Schwanz, um eine leichte Spannung am Ductus choledochus aufzubauen.

Danach mit der freien Hand mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt im Ductus choledochus direkt oberhalb der letzten Verzweigung in die Leber vornehmen, wobei die beiden Enden des Fadens so gehalten werden, dass der Ductus choledochus straff gespannt ist. Die Spritze und die Kanüle aus dem Eimer mit Eis entfernen. Die Spritze ablegen und die vorbereitete abgestumpfte Nadel mit 30 Gauge in den Schnitt einführen.

Gemeinsamer Gallengang. Dabei darauf achten, die Wand des Kanals nicht zu durchbohren. Eine vollständige Aufblähung der Bauchspeicheldrüse zu erreichen, ist der schwierigste Teil.

Wir verwenden eine Nadel, die eine gute Abdichtung gewährleistet. Falls die erste Nadel keine gute Abdichtung ergibt, verwenden Sie eine größere Nadel, beispielsweise eine 27-Gauge-Nadel. Drücken Sie nun langsam den Kolben der Spritze nieder, wobei der Druck pulsartig abgebaut wird, bis der erste Teil der Bauchspeicheldrüse aufgeht.

Fahren Sie anschließend mit sanftem, gleichmäßigem Druck fort, bis die Bauchspeicheldrüse sich nicht weiter aufbläht. Bei einer erfolgreichen Aufblähung zeigt sich eine gleichmäßige Verteilung des exokrinen Gewebes, und der Teil der Bauchspeicheldrüse oberhalb des Magens ist aufgebläht. Um die Bauchspeicheldrüse zu entfernen, greifen Sie mit einer Pinzette in der einen Hand den Dünndarm am Sphinkter von od. an.

Mit der anderen Hand wird die geschlossene Spitze einer gebogenen Schere eingeführt, um einen Teil der Bauchspeicheldrüse vom Dünndarm zu lösen. Die Spitze entlang des Dünndarms bis zum rosa Bindegewebe bewegen. Anschließend den Dünndarm nahe der Verbindung zum Magen greifen und die Bauchspeicheldrüse vom restlichen Dünndarm abtrennen.

Nehmen Sie so viel wie möglich vom Pankreas und heben Sie es vorsichtig an. Mit der gebogenen Schere schneiden Sie die verbleibenden Verbindungen zwischen Pankreas und Brusthöhle durch.

Um die Bauchspeicheldrüse vollständig zu entfernen, lagern Sie jede entnommene Bauchspeicheldrüse in etwa 2,5 Milliliter Kollagenase-Lösung. Verwenden Sie einen einzelnen 50-Milliliter-Kegelrohr auf Eis, um die Bauchspeicheldrüsen zu waschen. Überführen Sie zunächst jede Bauchspeicheldrüse in ein neues 50-Milliliter-Kegelrohr, das 25 Milliliter Kollagenase enthält.

Danach die Bauchspeicheldrüse in 50-Milliliter-Konischflaschen geben und diese aufrecht in ein schwenkbares Wasserbad mit 37 °C stellen, das mit ausgeschaltetem Schüttler zwischen 220 und 250 U/min oszillieren kann. Gegenwärtig jede 50-Milliliter-Konischflasche fünf Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid begasen.

Mit einer Pasteurpipette wird jeder Kolben fest verschlossen und seitlich in das schüttelnde Wasserbad unterhalb der Wasseroberfläche gestellt. Ab Minute sechs werden die Kolben alle zwei Minuten 20 Sekunden lang bei 220 bis 250 U/min geschüttelt, insgesamt bis zu 16 Minuten. Nach dem Schütteln werden die Kolben unverzüglich bei Raumtemperatur mit 400 bis 500 G abgeschleunigt, wobei die Zentrifuge sofort nach Erreichen der maximalen Drehzahl abgeschaltet wird.

Als Nächstes, ohne den Pellet zu stören, saugen Sie mit Hilfe einer Vakuumabsaugung etwa 22,5 Milliliter der Kollagenase-Lösung von jedem Gefäß ab. Suspendieren Sie die Pellets anschließend in 12,5 Milliliter HBSS und wirbeln Sie die Gefäße vorsichtig um, um die Pellets aufzulösen. Nach dem Waschen und Wirbeln der Zellen mit frischem HBSS gießen Sie jede Zellsuspension durch ein 1000-Mikron-Sieb in neue einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße.

Danach die Zellsuspensionen erneut abzentrifugieren und mit einer Vakuumabsaugvorrichtung vorsichtig sämtliches HBSS entfernen, ohne das Pellet zu stören. Sobald das gesamte HBSS entfernt ist, 4,8 Milliliter 25 %iger F-Call-Lösung zu jedem Röhrchen hinzufügen. Nach dem Vortexen, um das Pellet aufzulösen, vorsichtig 2,4 Milliliter 23 %iger, 20,5 %iger und 11 %iger Fial-Lösung entlang der Wand des sich drehenden 50-Milliliter-Konischröhrchens zugeben.

Um eine gleichmäßige Schichtung nach der Zentrifugation der FI-Ruf-Lösung zu gewährleisten, gießen Sie die gesamte FI-Ruf-Lösung vorsichtig in ein frisches 50-Milliliter-Konischglas und lassen Sie dabei das Pellet aus exokrinem Gewebe zurück. Geben Sie eiskaltes HBSS bis zur 50-Milliliter-Marke in das neue Gefäß. Verschließen Sie es anschließend und stürzen Sie den Behälter vier- bis sechsmal um.

FI-Ruf und HBSS miteinander mischen. Mit der Vakuumsammelflasche vorsichtig den größten Teil des HBSS-Fläschchen-Gemischs abziehen, ohne das lockere Pellet zu stören. Anschließend das Pellet in ein neues Röhrchen überführen.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Augenstücke in eine Petrischale mit Augenstückkulturmedium zu überführen, wobei darauf geachtet werden sollte, ASIN-artige Gewebetrümmer zu vermeiden. Stellen Sie die Petrischale auf ein Stereomikroskop mit Hintergrundbeleuchtung.

Gesunde Augen sind kugelförmig und weisen einen goldbraunen bis dunkelbraunen Mittelpunkt auf. Augen, die mit ASIN oder Gewebe verbunden sind und stumpf grau erscheinen, sollten nicht verwendet und verworfen werden. Außerdem sollten größere Augen, die nach einer Übernachtsinkubation ein dunkles nekrotisches Zentrum entwickeln, verworfen werden, da sie nicht korrekt funktionieren.

Wenn die Augenring-Präparation eine große Menge an Verunreinigungen enthält, sollten die Augenringe zweimal per Hand in frisches Medium überführt werden; fügen Sie DNA zum Verdauungspuffer hinzu, um das Verklumpen der Augenringe zu begrenzen. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Augenringe in der Mitte der Petrischale sammeln. Übertragen Sie die Augenringe mit einer P20-Pipette in eine neue Petrischale aus Polystyrol (15 mm × 60 mm), die fünf Milliliter der Vorinkubationslösung enthält, um das glucosehaltige Kulturmedium von den Augenringen abzuwaschen.

Verwenden Sie dann die P 20-Pipette, um mindestens 13 Augen in einzelne Mikrofugegefäße zu überführen, die jeweils ein Milliliter frisch angespülten Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer enthalten, und achten Sie dabei auf eine einheitliche Größe der Augen zwischen den Gefäßen. Nach einer Inkubation der Proben bei 37 Grad Celsius und 5 %CO₂ für 45 Minuten verschließen Sie die Gefäße, wirbeln sie kurz um und zentrifugieren sie anschließend in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur mit bis zu 7.000 bis 7.500 G. Falls Insulin oder ein anderer Metabolit für eine nachgeschaltete Anwendung benötigt wird, sammeln Sie mit einer P 1000-Pipette eine Aliquot des Mediums in einem Mikrofugegefäß. Falls das Stimulationsmedium nicht aufbewahrt wird, kann es verworfen werden.

Entfernen Sie mit einer P-1000-Pipette den größten Teil des Krebs in jedem Mikrozentrifugenröhrchen, wobei etwa 10 bis 15 Mikroliter Krebs auf dem Augenring-Pellet verbleiben. Entfernen Sie anschließend mit einer P-20-Pipette den Teil, der dem Pellet am nächsten liegt. Sobald weniger als 10 bis 15 Mikroliter Krebs auf dem Augenring verbleiben, tiefgefrieren Sie die Augenring-Präparate in flüssigem Stickstoff ein.

Danach die schockgefrorenen Pellets bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die zyklische A MP-Menge bestimmt wird. Typischerweise korreliert der Einfluss eines Wirkstoffs auf die Produktion von zyklischem a MP direkt mit seinem Einfluss auf die Insulinsekretion. In diesem Experiment wurden isolierte Inseln von Wildtyp- oder Gen-Knockout-Mäusen mit 11,1 Millimolar Glukose stimuliert und das intrazelluläre zyklische.

Die Produktion von zyklischem AMP wurde gemessen und auf das gesamte zelluläre Protein normalisiert. Der sezernierte Insulinspiegel wurde mittels eines standardisierten Insulin-ELISA bestimmt und ebenfalls auf das gesamte zelluläre Protein normalisiert. Wie erwartet, korrelierte die Veränderung der zyklischen AMP-Produktion direkt mit der Zunahme der glucosestimulierten Insulinsekretion Petrol.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, zyklische cAMP- und cGMP-Spiegel in gesunden Mausaugen zu isolieren, zu kultivieren und zu messen.