Name: Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Maus-Langerhans-Inseln zur Messung von cAMP-Spiegeln in β-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der β-Zell-Funktion für Diabetesforschung.

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Wir möchten Renee L. Pasker und Harpreet K. Brar für kompetente technische Unterstützung auf die in dieser Arbeit beschriebenen Protokolle danken. Darüber hinaus möchten wir die Betreuung von Christopher B. Newgard an der Duke University und Alan D. Attie an der Universität von Wisconsin-Madison bestätigen, zusammen mit der Unterstützung ihrer Mitglieder Labor, die uns die Zeit erlaubt und unterstützt notwendig zur Optimierung der beschriebenen Protokollen. Insbesondere danken wir Hans Hohmeier, Danhong Lu, und Helena Winfield in der Labor-und Newgard Mary Rabaglia in der Attie Labor für produktive Diskussionen und Beratung. Diese Arbeit wurde vom NIH DK080845 und Juvenile Diabetes 594 unterstützt Research Foundation Zuschuss 17-2011-608 (MEK)

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</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit der Verbreitung von Diabetes voraussichtlich um 7,7% der Weltbevölkerung betreffen, ist die Voraussetzung für neuartige Forschungstechniken unerlässlich, sowohl Diabetes verstehen und zu behandeln 18. Die vorliegende Inselisolierung ist ein gut etabliertes Protokoll für die in-vitro-Versuche verwendet und hat vorher mit leichten Modifikationen 11,14,16 vorgestellt. Obwohl die Insulinsekretion ist ein gemeinsames stromabwärts Anwendung isolierten Inseln, die sich auf stromaufwärts Besta...

Die strikte Einhaltung euglycemia ist zwingend notwendig, um Begleiterkrankungen wie Neuropathie, Nephropathie, Retinopathie und, die alle Markenzeichen der Pathologie des unkontrollierten Typ-1-und-2-Diabetes sind 1 zu verhindern. Reduzierte β-Zell-Funktion und Masse in Typ 1 und 2 Diabetes stören Blutglukosekonzentrationen 2. Während immun-vermittelte Typ-1-Diabetes resultiert aus einem verheerenden Verlust von Insulin-produzierenden β-Zellen, gestörte β-Zellen Insulin-Sekretion und periphere Insulin-Signal bei Typ-2-Diabetes zusammen fördern Hyperglykämie, Dyslipidämie und erhöhte hepatische Glukoseproduktion, die schließlich zu sowohl Verlust der β-Zellmasse und Insulin sekretorischen Kapazität von einzelnen β-Zellen 3. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen β-Zellen in der Progression des Typ-1-und-2-Diabetes wird hoffentlich Anlass zu neuen Therapien zur Vorbeugung und Behandlung dieser Krankheiten. In-vitro-tiUSGABE Kulturmodelle, wie der INS-1 und β-MIN6 verewigt Zelllinien können nützliche Werkzeuge für das Verständnis spezifischer β-Zell-Funktionen sein. Jedoch sind die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Insel können sich regulieren β-Zellfunktion. Beispielsweise die parakrine Einfluss von Glucagon (aus α-Zellen freigesetzt) ​​und Somatostatin (von δ-Zellen freigesetzt) ​​in zunehmenden und abnehm Insulinsekretion bzw. zeigt die Bedeutung der Zell Zelle in der Nähe des endokrinen Reaktion 4. Darüber hinaus gap junctions zwischen β-Zellen verstärken die Freisetzung von Insulin 5. Obwohl Fortschritte wurden bei der Erzeugung Insulinom Leitungen, die besser repliziert die physiologische Reaktion von isolierten Inseln zu Glucose vorliegen (z. B. das INS-1-abgeleiteten 832/13 und 832/3 Zelllinien), die Glucose-Empfindlichkeit immer noch von normalen Ratten unterscheidet Inselchen 6,7. Darüber hinaus ist die Antwort dieser klonalen Zellinien InsulinomGlucagon-like-Peptid-1 (GLP-1)-Agonisten kann drastisch voneinander aus normalen Inseln 6 unterscheiden, sowie. Daher kann immortalisierte Zelllinien das beste Modell für die Untersuchung Agenten, die Auswirkungen auf die cAMP-Produktion nicht zu vertreten. Im Gegensatz zu den Insulinom-Zelllinien, studiert β-Zellfunktion nur in Ganztiermodellen besitzt einen eigenen Satz von Komplikationen. Eine der größten Herausforderungen in der Arbeit mit endokrinen Gewebe präzise Messung der Konzentration des Hormons freigesetzt. Insbesondere spielt die Leber eine wichtige Rolle metabolisierenden Insulin und die Bauchspeicheldrüse Blutfluss geht direkt in die Leber. Somit kann eine Plasmainsulinmessung nicht genau schildern die Mengen an Insulin aus der Bauchspeicheldrüse oder der Auswirkung von verschiedenen Behandlungen auf die Geschwindigkeit der Insulinabsonderung 8 sezerniert. Darüber hinaus kann Nierenstoffwechsel von Glucagon die Zuverlässigkeit von Glucagon Ausgabe von α-Inselzellen 9 begrenzen. Daher isolieren primären Maus Inseln für in-vitro-Experimenten eine genauere Verständnis davon, wie die Insel ist auf bestimmte Reize reagieren zu ergänzen Messungen in vivo gemacht. Das vorliegende Protokoll für die Isolierung von Maus-Inseln ist ein gut etabliertes Protokoll, das von einer Reihe von Gruppen (mit leichten Modifikationen, die helfen, den Erfolg zu erhöhen) 10,11 eingesetzt. Darüber hinaus ist die Bestimmung der cAMP-Produktion erlaubt eine direkte Auslesen des Inkretin Ansprechbarkeit der β-Zellen. In Verbindung mit cAMP-Messung, Proteingehalt und Insulinsekretion kann auch aus dem gleichen Lager Probenvorbereitungs quantifiziert werden, zu helfen, um zu bestimmen, ob ein Defekt in der β-Zell-Funktion liegt proximal oder distal zu cAMP 10. Die endgültige cAMP-Gehalt und die Insulinsekretion Anwendung in diesem Protokoll kann ein sehr mächtiges Werkzeug für das Verständnis der Einfluss der Pharma-und Nahrungsbestandteile, unter anderen seins, auf die cAMP-und Insulinsekretion. Neben der Stimulation von Glukose allein, können auch andere Verbindungen verwendet werden, um Veränderungen in der cAMP-und Insulin-Sekretion 10,11 messen. Schließlich, obwohl Insulin ist die primäre Hormon wir Assay von isolierten Inseln, andere Hormone, wie Glucagon und Somatostatin, sowie Zytokine, Eicosanoide und cyclischem Adenosinmonophosphat, kann ebenfalls gemessen werden, entweder durch eine vorübergehende Stimulation Assay oder durch Quantifizierung ihre Niveaus in Kulturmedium 12. Schließlich, obwohl außerhalb des Geltungsbereichs dieses Manuskripts Inselisolierung mit der beschriebenen Kollagenase Isolationsmethode ermöglicht Insel Erhaltung so, dass viele andere Downstream-Anwendungen verfolgt werden, wie zum Beispiel Inseltransplantation, RNA-Isolierung für die quantitative Echtzeit-PCR-oder Microarray-Analysen, Protein Isolation für Western Blot, Immunfluoreszenz-und Insel Einbettung Bildgebung und [3H]-Thymidin als Maß für die Inselzell-ReplikationKation, von denen einige in früheren JoVE Artikel 13-16 beschrieben. Insgesamt nach der im Protokoll beschriebenen Inselisolierung Verfahren kann ein Forscher mit wichtigen und nützlichen Informationen für die Entwicklung von Therapien und Förderung der Arzneimittelforschung zur Verbesserung β-Zell-Funktion ausgerichtet ist.

<table><tbody><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum geeignet zur Isolierung aktiver Inselzellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (pulver)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Rinderserum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Seidennahtfaden</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0,8 mm Pinzette&nbsp; &nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen Federschere - Gerade/Scharf/8,5 cm/5 mm Cutting</td><td>Edge Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1 ml BD Spritze</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Nadel 1/2" Länge</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G BD Nadel 1/2" Länge</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Schleifstein</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-Tribromethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (H.I. FBS)Fisher</td><td></td> <td>Scientific SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

eine methode zur maus-inselzellen der bauchspeicheldrüse isolation und intrazellulären camp-bestimmung

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Unkontrollierter Blutzucker ist ein Markenzeichen von Diabetes mellitus und Begleiterkrankungen fördert wie Neuropathie, Nephropathie und Retinopathie. Mit der zunehmenden Verbreitung von Diabetes, sowohl immun-vermittelte Typ-1-und Adipositas-Linked-Typ-2-Studien bei der Abgrenzung Diabetes Pathophysiologie und therapeutische Mechanismen abzielen, sind von entscheidender Bedeutung. Die β-Zellen der Langerhans-Inseln Langerhans sind entsprechend Absonderung von Insulin in Reaktion auf einen erhöhten Blutzuckerspiegel verantwortlich. Zusätzlich zu Glukose und anderen Nährstoffen sind die β-Zellen auch durch spezifische Hormone stimuliert, Inkretine bezeichnet, die aus dem Darm in Reaktion auf eine Mahlzeit und wirken auf β-Zellen-Rezeptoren, die die Produktion von intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat zu erhöhen sezerniert werden ( cAMP). Verringerte β-Zell-Funktion, Masse und Inkretin Reaktionsfähigkeit sind gut zu verstehen, die das Entstehen der Typ-2-Diabetes beitragen, und werden auch zunehmend verknüpft with Typ 1 Diabetes. Die vorliegende Maus Inselisolierung und cAMP-Bestimmung Protokoll kann ein Werkzeug, um zu beschreiben Mechanismen zur Förderung Fortschreiten der Krankheit und Therapiemaßnahmen, insbesondere solche, die von den Inkretin-Rezeptoren vermittelt werden oder verwandte Rezeptoren, die durch Modulation der intrazellulären cAMP-Produktion handeln. Während nur cAMP-Messungen beschrieben werden wird, schafft das beschriebene Inselisolierung Protokoll eine saubere Präparation, ermöglicht auch viele andere Downstream-Anwendungen, einschließlich Glucose-stimulierten Insulinsekretion, [3 H]-Thymidin-Einbau, Proteinmenge und der mRNA-Expression.

Um eine hohe Ausbeute bei der Isolierung Insel zu gewährleisten, sollten chirurgische Techniken im Protokoll beschriebenen genau befolgt werden. Obwohl die hier vorgestellten Verfahren wird jedem Labor zugeschnitten werden, gibt es ein paar wichtige Schritte, die zu einem erfolgreichen Isolierung führen. Um den gemeinsamen Gallengang leicht zugänglich zu machen, ist es empfehlenswert, dass die Organe auf der rechten Seite der Maus (Fig. 1) verschoben werden kann. Darüber hinaus ermöglicht dies die Bauch...

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gesunde Inseln zu isolieren, um Unterschiede in der zyklischen AMP-Produktion als Reaktion auf verschiedene experimentelle Behandlungen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Inseln aufgeblasen und im zweiten Schritt die Bauchspeicheldrüse entfernt wird. Die gesunden Inseln werden durch eine Abfolge von Zentrifugier- und Waschschritten isoliert. Anschließend werden die lebensfähigen Augen in frisches Inselkulturmedium überführt und über Nacht inkubiert. Im letzten Schritt werden die Augen den gewünschten experimentellen Behandlungen ausgesetzt und ein cAMP-Assay durchgeführt. Abschließend kommt ein enzymgekoppelter Immunosorbensassay zum Einsatz, um die Änderungen der cAMP-Produktion als Reaktion auf verschiedene Behandlungen der Augen zu messen.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es viel Übung erfordert, eine vollständige Pankreasinflation zu erreichen. Laden Sie zunächst eine Spritze und Kanüle mit fünf Milliliter Kollagenaselösung vor. Befestigen Sie eine stumpfe Nadel mit 30 G an der Kanüle und stellen Sie die mit der Kanüle verbundene Spritze auf Eis.Nachdem der Dü

a-method-for-mouse-pancreatic-islet-isolation-intracellular-camp

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess des Pankreas dissection für virtuelle Scheibe Bildgebung, und die anschließende Quantifizierung aller GFP-markierten Beta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse.

In situ Quantifizierung von Pankreas-Beta-Zellmasse in Mäuse

Eine detaillierte Beschreibung der Maus Inselisolierung wird beschrieben unter Verwendung der Technik der in situ-pankreatischen duktalen Kanülierung und Perfusion einer Kombination von gereinigten Collagenase und neutralen Protease.

Maus Islet der Langerhans Isolation durch eine Kombination von gereinigtem Collagenase und Neutral Protease

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung von endokrinen Zellen aus embryonalen, Neugeborenen- und postnatale Bauchspeicheldrüsen gefolgt von einzelligen RNA Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Analysen der pankreatischen endokrinen Linie Entwicklung, Zell-Heterogenität und transkriptomischen Dynamik.

Einzellige Transkriptomischen Analysen der Maus endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Endothelzellen der Maus aus der gesamten Bauchspeicheldrüse.

Isolierung von Endothelzellen der Bauchspeicheldrüse der Maus

In dieser Studie werden mehrfach gefärbte fluoreszenzbasierte Marker für Zelltod und Apoptose in Kombination mit konfokaler Mikroskopie verwendet, um die Zytokin-induzierte Apoptose und den β-zellspezifischen Tod in Pankreasinseln zu bewerten. Sie zeigt räumliche und zeitliche Veränderungen des Zelltods und der Apoptose als Reaktion auf extrazelluläre Reize.

Isolierte Behandlung von Pankreasinseln und Apoptosemessung

Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Lernen Sie die Isolierung von Maus-Langerhans-Inseln zur Messung von cAMP-Spiegeln in β-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der β-Zell-Funktion für Diabetesforschung.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

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