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Das Spektralphotometer ist ein häufig benutztes Laborinstrument in der wissenschaftlichen Forschung. Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht von einer chemischen Substanz absorbiert wird, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch eine Probe gestrahlt wird.
In diesem Video wiederholen wir die grundlegenden Konzepte der Spektralphotometrie, einschließlich von Durchlässigkeit, Absorbanz, dem Lambert-Beer’schen Gesetz und der Bestandteile des Spektralphotometers. Diese Konzepte bilden das Grundgerüst zur Ermittlung der Konzentration eines Stoffes in Lösung, der Licht im UV oder sichtbarem Bereich absorbiert. Außerdem zeigen wir, wie man Spektralphotometer bedient, einschließlich davon wie man einen Blindwert misst und wie die Absorbanz einer gewünschten Wellenlänge von einer Probe ermittelt wird. Dieses Video beinhaltet auch wie man eine Standardkurve für die Bestimmung von Konzentrationen herstellt. Mehrere Anwendungen des Spektralphotometers in der biologischen Forschung werden vorgestellt, zum Beispiel das Messen der Zelldichte und dem Bestimmen von chemischen Reaktionsraten. Zu letzt führen wir Mikrovolumenspektralphotometer ein, die dazu nützlich sind, um die Quantität und Qualität von Proteinen und Nukleinsäuren zu bestimmen.
Ein Spektralphotometer ist ein Laborgerät, das in biologischen, chemischen, klinischen und Umweltlabors häufig benutzt wird.
Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht eine chemische Substanz absorbiert, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch die Probe gestrahlt wird.
Durch das Messen der austretenden Lichtintensität, kann diese Methode verwendet werden, um die Konzentrationen von Stoffen in Proben zu bestimmen.
Der Lichtstrahl, der in Richtung der Probe gestrahlt wird, besteht aus Photonen.
Wenn Photonen auf Moleküle in der Probe treffen, werden einige der einstrahlenden Photonen durch diese Moleküle absorbiert. Das verringert die Anzahl der Photonen im austretenden Licht und führt zu einem verringertem Signal.
Die Durchlässigkeit ist der Teil des Lichts der durch die Probe durchgeht und ist als die Intensität des austretenden Lichts geteilt durch die Intensität des einfallenden Lichts definiert. Absorbanz ist der umgekehrte Logarithmus der Durchlässigkeit und ist das, was von dem Spektralphotometer gemessen wird.
Ausgehend von der Absorbanz kann die Konzentration der Probe durch Anwendung des Lambert-Beer’schen Gesetzes bestimmt werden, das besagt das ein lineares Verhältnis zwischen der Absorbanz und der Konzentration der Probe besteht. Laut dem Lambert-Beer’schen Gesetzes ist die Absorbanz das Produkt des Extinktionskoeffizienten (einer Maßeinheit dafür wie stark ein gelöster Stoff Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert), der Länge des Lichts das durch die Probe geht (auch Pfadlänge genannt), und der Konzentration des gelösten Stoffes. Das Ziel einer Absorbanzmessung ist meist das Bestimmen der Konzentration einer Probe.
Jedes Spektralphotometer besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator (also einer Linse oder einem Fokusiergerät, das einen intensiven Lichstrahl ausstrahlt), einem Monochromator um das Licht in seine Wellenlängenbestandteile aufzutrennen, und einem Wellenlängenselektor (oder Spalt), um die geeignete Wellenlänge auszusuchen. Die Wellenlängen, die in diesem Video behandelt werden, sind im UV und im sichtbaren Bereich. Das Spektralphotometer beinhaltet auch eine Probenhalterung, einen Photodetektor, und einen Bildschirm, um das Ergebnis anzuzeigen.
Neuere Spektralphotometer sind direkt an einen Computer angeschlossen, an dem die Parameter eingestellt und die Ergebnisse abgelesen werden können.
Beim Benutzen eines Spektralphotometers sollte man abhängig von den biologischen und chemischen Lösungen mit denen man arbeitet die nötigen Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie zum Beispiel das Tragen von Handschuhen.
Vor der Messung des UV-sichtbaren Spektrums einer Probe, muss man die Maschine anschalten und warten bis die Lampen aufgewärmt sind.
Nun stellt man einen Blindwert ohne den zu analysierenden Stoff her, der den gleichen pH-Wert und die gleiche Ionenkonzentration des Lösungsmittels hat. Das ist ein notwendiger Schritt, da die Küvette und das Lösungsmittel selbst Licht absorbieren.
Traditionelle Spektralphotometer sind so konzipiert, das sie Plastik und Quarzküvetten halten können. Nun pipettiert man die Blindlösung in die Küvette.
Nachdem man eventuelle Fingerabdrücke durch Abwischen entfernt hat, platziert man die Küvette in die vorgesehene Halterung und schießt die Tür zu dem Küvettenabteil.
Man sollte nie vergessen die Tür zu schließen, da UV-Strahlung von einem offenen Spektralphotometer Haut und Augen beschädigen kann.
Nun sucht man den gewünschten Wellenlängenbereich aus, der auf die Probe gestrahlt werden soll, abhängig von der optimalen Wellenlänge, die von der Probe absorbiert wird. Danach wird das Instrument durch Lesen des Blindwerts auf 0 gestellt, was die Hintergrundabsorbanz von der Absorbanz der Probe abzieht.
Abhängig von der Art des Spektralphotometer Experiments das ausgeführt wird, kann es sein das man eine Standardkurve vor der Probenmessung durchführt, von der die Konzentrationen der Probe errechnet werden kann.
Nun sollte man die Probe bis zur angemessenen Temperatur aufwärmen und sie vorsichtig mischen, damit sich keine Luftblasen bilden. Die Probe kann dann direkt in die Küvette in dem Instrument pipettiert und der Messwert bestimmt werden.
Nach der Messung der Absorbanz der Probe führt man die Berechnung für das Experiment aus, zum Beispiel zum Bestimmen der Konzentration oder der Zerfallsrate der Aktivität eines Enzyms.
Das Spektralphotometer wird in den meisten Forschungslabors so gut wie täglich benutzt.
Eine häufige Anwendung von Spektralphotometern ist das Messen von Zelldichten. Zelldichtemessungen sind nützlich um logarithmische Wachstumskurven für Bakterien zu bestimmen, von der die optimale Zeit für die Induktion der Expression von Proteinen bestimmt werden kann.
Das Spektralphotometer kann außerdem verwendet werden, um die Raten von chemischen Reaktionen zu messen. In diesem Beispiel wird die Absorbanz genutzt um eine enzymatische Reaktion zu beobachten, bei der sich ein Zwischenprodukt auflöst, das Licht mit 452 nm absorbiert. Die Rate der enzymatischen Reaktion kann dann unter Einbeziehung der geeigneten Gleichung berechnet werden.
Die Einführung von Mikrovolumenspektralphotometern haben Probenhalterungen überflüssig gemacht. Solche Spektralphotometer benutzen Oberflächenspannung um die Proben zu fassen.
Mikrovolumenspektralphotometer sind optimal um die Qualität und Konzentration von teuren Proben mit kleinen Volumen zu messen, zum Beispiel von biologischen Molekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren.
Die Absorbanz eines Proteins bei 280 nm ist abhängig von der Anzahl der aromatischen Seitenketten, zum Beispiel in den Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, und auch davon ob Cystein Brücken in dem Protein enthalten sind.
Proteinkonzentrationen können von ihrerer Absorbanz bei 280 nm und von ihrem Extinktionskoeffizienten, der abhängig von der Aminosäurenkomposition ist. bestimmt werden.
Sowohl DNA als auch RNA absorbieren Licht mit einem Maximum bei 260 nm, wovon die Konzentration bestimmt werden kann. Die Reinheit der Probe kann durch das Verhältnis der Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt werden.
Das war die Einführung in die Spektralphotometrie von JoVE. In diesem Video haben wir die grundlegenden Prinzipien, einschließlich der Grundlagen der Spektralphotometrie und der Bestandteile eines Spektralphotometers wiederholt. Wir haben außerdem eine Schritt-für-Schritt Anleitung für die Benutzung eines Spektralphotometers gegeben und Anwendungen behandelt.
Danke für eure Aufmerksamkeit.
Das Spektralphotometer ist ein allgegenwärtiges Instrument in der biologischen, chemischen, klinischen und Umweltforschung.
Die Spektrophotometrie ist die quantitative Messung des Lichtanteils einer chemischen Substanz, indem ein Lichtstrahl mit einem Spektralphotometer durch die Probe geleitet wird.
Durch die Messung der Intensität des detektierten Lichts kann diese Methode verwendet werden, um die Konzentration des gelösten Stoffes in der Probe zu bestimmen.
Der Lichtstrahl, der auf die Probe abgestrahlt wird, besteht aus einem Strom von Photonen.
Wenn Photonen in der Probe auf Moleküle treffen, können die Moleküle einige von ihnen absorbieren, wodurch die Anzahl der Photonen im Lichtstrahl reduziert und die Intensität des detektierten Signals verringert wird.
Die Durchlässigkeit ist der Anteil des Lichts, der die Probe durchdringt, und ist definiert als die Intensität des Lichts, das die Probe durchdringt, gegenüber der Intensität des einfallenden Lichts. Die Absorption ist der inverse Logarithmus der Durchlässigkeit und ist die Größe, die Ihr Spektralphotometer messen wird.
Aus der Extinktion kann die Konzentration der Probenlösung nach dem Beer-Lambert-Gesetz bestimmt werden, das besagt, dass es einen linearen Zusammenhang zwischen der Extinktion und der Konzentration einer Probe gibt. Nach dem Beer-Lambert-Gesetz ist die Absorption das Produkt aus dem Extinktionskoeffizienten, einem Maß dafür, wie stark ein gelöster Stoff Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert, der Länge, die das Licht durch die Probe geht, oder der Weglänge, und der Konzentration des gelösten Stoffes. Oft besteht das Ziel bei der Durchführung von Absorptionsmessungen darin, die Konzentration einer Probe zu messen.
Jedes Spektralphotometer umfasst eine Lichtquelle, einen Kollimator, bei dem es sich um eine Linse oder ein Fokussiergerät handelt, das einen intensiven geraden Lichtstrahl überträgt, einen Monochromator, um den Lichtstrahl in seine einzelnen Wellenlängen zu zerlegen, und einen Wellenlängenwähler oder Spalt zur Auswahl der gewünschten Wellenlänge. Die Wellenlängen des Lichts, die in Spektralphotometern verwendet werden, die in diesem Video besprochen werden, liegen im ultravioletten und sichtbaren Bereich. Das Spektralphotometer enthält auch eine Art Probenhalter, einen photoelektrischen Detektor, der die Menge der absorbierten Photonen erfasst, und einen Bildschirm, auf dem die Ausgabe des Detektors angezeigt wird.
Neuere Spektralphotometer sind direkt an einen Computer gekoppelt, wo die Experimentparameter gesteuert und die Ergebnisse angezeigt werden können.
Achten Sie bei der Durchführung der Spektralphotometrie darauf, geeignete Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wie z. B. das Tragen von Handschuhen, je nachdem, mit welcher Art von biologischen oder chemischen Lösungen Sie arbeiten.
Schalten Sie vor der Messung des sichtbaren UV-Spektrums einer Probe das Gerät ein und lassen Sie die Lampen und die Elektronik aufwärmen.
Es wird ein Rohling der gleichen Lösung, jedoch ohne den Analyten, mit dem gleichen pH-Wert und der gleichen Ionenstärke hergestellt. Ein notwendiger Schritt, da die Zelle und das Lösungsmittel etwas Licht streuen können.
Herkömmliche Probenhalter für Spektralphotometer sind für die Aufnahme von Kunststoff- und Quarzküvetten ausgelegt. Fahren Sie fort, die blinde Lösung in die Küvette zu pipettieren.
Nachdem Sie Fingerabdrücke und verschüttete Flüssigkeiten von der Außenseite der Küvette abgewischt haben, setzen Sie die Küvette ordnungsgemäß in den Probenhalter ein und schließen Sie die Tür zum Küvettenfach.
Vergessen Sie nie, die Tür zu schließen, da die von einem offenen Spektralphotometer emittierte UV-Strahlung die Augen und die Haut schädigen kann.
Stellen Sie die gewünschte Wellenlänge oder den gewünschten Wellenlängenbereich ein, der an der Probe übertragen werden soll, der von der optimalen Wellenlänge des Lichts abhängt, das der Analyt absorbiert. Stellen Sie dann das Gerät auf Null, indem Sie den Rohling ablesen, wodurch der Hintergrund von Ihrem Probenpuffer abgezogen wird.
Abhängig von der Art des spektrophotometrischen Experiments, das Sie durchführen, kann es erforderlich sein, vor der Probenmessung eine Standardkurve zu erstellen, anhand derer schließlich die Konzentration Ihres Probenanalyten bestimmt werden kann.
Lassen Sie die Probe die richtige Temperatur erreichen und mischen Sie sie vorsichtig, damit keine Blasen entstehen. Die Probe kann direkt in die Küvette im Gerät gegeben und eine Messung vorgenommen werden.
Nachdem Sie die Absorptionsmessung an Ihrer Probe durchgeführt haben, fahren Sie mit der entsprechenden Berechnung für Ihr Experiment fort. Zum Beispiel die Bestimmung der Konzentration oder der Geschwindigkeit der Enzymaktivität.
Das Spektralphotometer wird täglich in vielen biologischen Forschungslaboratorien eingesetzt.
Eine häufige Anwendung des Spektralphotometers ist die Messung der Zelldichte. Die Messung der Zelldichte ist nützlich bei der Erstellung logarithmischer Wachstumskurven für Bakterien, aus denen der optimale Zeitpunkt für die Induktion von rekombinantem Protein bestimmt werden kann.
Das Spektralphotometer kann auch zur Messung chemischer Reaktionsgeschwindigkeiten eingesetzt werden. In diesem Beispiel wird die Absorption verwendet, um eine enzymatische Reaktion durch das Verschwinden eines Reaktionszwischenprodukts bei 452 nm im Laufe der Zeit zu überwachen. Die Geschwindigkeit dieses enzymatischen Schritts kann berechnet werden, indem die Daten an die entsprechende Gleichung angepasst werden.
In jüngster Zeit sind durch die Einführung von Mikrovolumen-Spektralphotometern keine Probenhalter mehr erforderlich. Solche Spektralphotometer verwenden die Oberflächenspannung, um die Probe zu halten.
Mikrovolumenspektrophometer eignen sich optimal für die Messung der Qualität und Konzentration von teuren Proben mit begrenztem Volumen, wie z. B. Biomoleküle, einschließlich Proteine und Nukleinsäuren.
Die Absorption eines Proteins bei 280 nm hängt vom Gehalt an aromatischen Seitenketten ab, die in Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin enthalten sind, sowie vom Vorhandensein von Cystein-Cystein-Disulfid-Bindungen.
Die Proteinkonzentration kann aus seiner Extinktion bei 280 nm und seinem Extinktionskoeffizienten, der auf der Aminosäurezusammensetzung basiert, bestimmt werden.
Sowohl DNA als auch RNA haben ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, aus dem ihre Konzentration bestimmt werden kann. Die Reinheit der Nukleinsäure kann auch anhand des Verhältnisses der Absorptionsmesswerte bei bestimmten Wellenlängen beurteilt werden.
Sie haben gerade die Einführung von JoVE in das Spektralphotometer gesehen.
In diesem Video haben wir einige grundlegende Prinzipien besprochen, einschließlich Spektralphotometrie-Konzepte und Spektralphotometer-Komponenten. Wir demonstrierten auch Schritt für Schritt die Bedienung des Spektralphotometers und diskutierten seinen Einsatz in der biologischen Forschung. Danke fürs Zuschauen.
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