Einführung in die Spektralphotometrie

Introduction to the Spectrophotometer

JoVE Science Education
General Laboratory Techniques

This content is Free Access.

JoVE Science Education General Laboratory Techniques

Introduction to the Spectrophotometer

518,859 Views

•

07:38 min

•

October 10, 2012

Overview

Das Spektralphotometer ist ein häufig benutztes Laborinstrument in der wissenschaftlichen Forschung. Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht von einer chemischen Substanz absorbiert wird, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch eine Probe gestrahlt wird.

In diesem Video wiederholen wir die grundlegenden Konzepte der Spektralphotometrie, einschließlich von Durchlässigkeit, Absorbanz, dem Lambert-Beer’schen Gesetz und der Bestandteile des Spektralphotometers. Diese Konzepte bilden das Grundgerüst zur Ermittlung der Konzentration eines Stoffes in Lösung, der Licht im UV oder sichtbarem Bereich absorbiert. Außerdem zeigen wir, wie man Spektralphotometer bedient, einschließlich davon wie man einen Blindwert misst und wie die Absorbanz einer gewünschten Wellenlänge von einer Probe ermittelt wird. Dieses Video beinhaltet auch wie man eine Standardkurve für die Bestimmung von Konzentrationen herstellt. Mehrere Anwendungen des Spektralphotometers in der biologischen Forschung werden vorgestellt, zum Beispiel das Messen der Zelldichte und dem Bestimmen von chemischen Reaktionsraten. Zu letzt führen wir Mikrovolumenspektralphotometer ein, die dazu nützlich sind, um die Quantität und Qualität von Proteinen und Nukleinsäuren zu bestimmen.

Procedure

Ein Spektralphotometer ist ein Laborgerät, das in biologischen, chemischen, klinischen und Umweltlabors häufig benutzt wird.

Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht eine chemische Substanz absorbiert, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch die Probe gestrahlt wird.

Durch das Messen der austretenden Lichtintensität, kann diese Methode verwendet werden, um die Konzentrationen von Stoffen in Proben zu bestimmen.

Der Lichtstrahl, der in Richtung der Probe gestrahlt wird, besteht aus Photonen.

Wenn Photonen auf Moleküle in der Probe treffen, werden einige der einstrahlenden Photonen durch diese Moleküle absorbiert. Das verringert die Anzahl der Photonen im austretenden Licht und führt zu einem verringertem Signal.

Die Durchlässigkeit ist der Teil des Lichts der durch die Probe durchgeht und ist als die Intensität des austretenden Lichts geteilt durch die Intensität des einfallenden Lichts definiert. Absorbanz ist der umgekehrte Logarithmus der Durchlässigkeit und ist das, was von dem Spektralphotometer gemessen wird.

Ausgehend von der Absorbanz kann die Konzentration der Probe durch Anwendung des Lambert-Beer’schen Gesetzes bestimmt werden, das besagt das ein lineares Verhältnis zwischen der Absorbanz und der Konzentration der Probe besteht. Laut dem Lambert-Beer’schen Gesetzes ist die Absorbanz das Produkt des Extinktionskoeffizienten (einer Maßeinheit dafür wie stark ein gelöster Stoff Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert), der Länge des Lichts das durch die Probe geht (auch Pfadlänge genannt), und der Konzentration des gelösten Stoffes. Das Ziel einer Absorbanzmessung ist meist das Bestimmen der Konzentration einer Probe.

Jedes Spektralphotometer besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator (also einer Linse oder einem Fokusiergerät, das einen intensiven Lichstrahl ausstrahlt), einem Monochromator um das Licht in seine Wellenlängenbestandteile aufzutrennen, und einem Wellenlängenselektor (oder Spalt), um die geeignete Wellenlänge auszusuchen. Die Wellenlängen, die in diesem Video behandelt werden, sind im UV und im sichtbaren Bereich. Das Spektralphotometer beinhaltet auch eine Probenhalterung, einen Photodetektor, und einen Bildschirm, um das Ergebnis anzuzeigen.

Neuere Spektralphotometer sind direkt an einen Computer angeschlossen, an dem die Parameter eingestellt und die Ergebnisse abgelesen werden können.

Beim Benutzen eines Spektralphotometers sollte man abhängig von den biologischen und chemischen Lösungen mit denen man arbeitet die nötigen Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie zum Beispiel das Tragen von Handschuhen.

Vor der Messung des UV-sichtbaren Spektrums einer Probe, muss man die Maschine anschalten und warten bis die Lampen aufgewärmt sind.

Nun stellt man einen Blindwert ohne den zu analysierenden Stoff her, der den gleichen pH-Wert und die gleiche Ionenkonzentration des Lösungsmittels hat. Das ist ein notwendiger Schritt, da die Küvette und das Lösungsmittel selbst Licht absorbieren.

Traditionelle Spektralphotometer sind so konzipiert, das sie Plastik und Quarzküvetten halten können. Nun pipettiert man die Blindlösung in die Küvette.

Nachdem man eventuelle Fingerabdrücke durch Abwischen entfernt hat, platziert man die Küvette in die vorgesehene Halterung und schießt die Tür zu dem Küvettenabteil.

Man sollte nie vergessen die Tür zu schließen, da UV-Strahlung von einem offenen Spektralphotometer Haut und Augen beschädigen kann.

Nun sucht man den gewünschten Wellenlängenbereich aus, der auf die Probe gestrahlt werden soll, abhängig von der optimalen Wellenlänge, die von der Probe absorbiert wird. Danach wird das Instrument durch Lesen des Blindwerts auf 0 gestellt, was die Hintergrundabsorbanz von der Absorbanz der Probe abzieht.

Abhängig von der Art des Spektralphotometer Experiments das ausgeführt wird, kann es sein das man eine Standardkurve vor der Probenmessung durchführt, von der die Konzentrationen der Probe errechnet werden kann.

Nun sollte man die Probe bis zur angemessenen Temperatur aufwärmen und sie vorsichtig mischen, damit sich keine Luftblasen bilden. Die Probe kann dann direkt in die Küvette in dem Instrument pipettiert und der Messwert bestimmt werden.

Nach der Messung der Absorbanz der Probe führt man die Berechnung für das Experiment aus, zum Beispiel zum Bestimmen der Konzentration oder der Zerfallsrate der Aktivität eines Enzyms.

Das Spektralphotometer wird in den meisten Forschungslabors so gut wie täglich benutzt.

Eine häufige Anwendung von Spektralphotometern ist das Messen von Zelldichten. Zelldichtemessungen sind nützlich um logarithmische Wachstumskurven für Bakterien zu bestimmen, von der die optimale Zeit für die Induktion der Expression von Proteinen bestimmt werden kann.

Das Spektralphotometer kann außerdem verwendet werden, um die Raten von chemischen Reaktionen zu messen. In diesem Beispiel wird die Absorbanz genutzt um eine enzymatische Reaktion zu beobachten, bei der sich ein Zwischenprodukt auflöst, das Licht mit 452 nm absorbiert. Die Rate der enzymatischen Reaktion kann dann unter Einbeziehung der geeigneten Gleichung berechnet werden.

Die Einführung von Mikrovolumenspektralphotometern haben Probenhalterungen überflüssig gemacht. Solche Spektralphotometer benutzen Oberflächenspannung um die Proben zu fassen.

Mikrovolumenspektralphotometer sind optimal um die Qualität und Konzentration von teuren Proben mit kleinen Volumen zu messen, zum Beispiel von biologischen Molekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren.

Die Absorbanz eines Proteins bei 280 nm ist abhängig von der Anzahl der aromatischen Seitenketten, zum Beispiel in den Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, und auch davon ob Cystein Brücken in dem Protein enthalten sind.

Proteinkonzentrationen können von ihrerer Absorbanz bei 280 nm und von ihrem Extinktionskoeffizienten, der abhängig von der Aminosäurenkomposition ist. bestimmt werden.

Sowohl DNA als auch RNA absorbieren Licht mit einem Maximum bei 260 nm, wovon die Konzentration bestimmt werden kann. Die Reinheit der Probe kann durch das Verhältnis der Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt werden.

Das war die Einführung in die Spektralphotometrie von JoVE. In diesem Video haben wir die grundlegenden Prinzipien, einschließlich der Grundlagen der Spektralphotometrie und der Bestandteile eines Spektralphotometers wiederholt. Wir haben außerdem eine Schritt-für-Schritt Anleitung für die Benutzung eines Spektralphotometers gegeben und Anwendungen behandelt.

Danke für eure Aufmerksamkeit.

Transcript

The spectrophotometer is a ubiquitously used instrument in biological, chemical, clinical and environmental research.

Spectrophotometry is the quantitative measurement of how much a chemical substance absorbs light by passing a beam of light through the sample using a spectrophotometer.

By measuring the intensity of light detected, this method can be used to determine the concentration of solute in the sample.

The beam of light that is radiated toward the sample is made up of a stream of photons.

When photons encounter molecules in the sample, the molecules may absorb some of them, reducing the number of photons in the beam of light and decreasing the intensity of the detected signal.

Transmittance is the fraction of light that passes through the sample and is defined as the intensity of light passing through the sample over the intensity of incident light. Absorbance is the inverse logarithm of transmittance and is the quantity your spectrophotometer will measure.

From the absorbance, the concentration of the sample solution can be determined from the Beer-Lambert Law, which states that there is a linear relationship between the absorbance and concentration of a sample. According to the Beer-Lambert Law, absorbance is the product of the extinction coefficient, a measure of how strongly a solute absorbs light at a given wavelength, the length that light passes through the sample, or path length, and the concentration of solute. Often, the goal to taking absorbance measurements is to measure the concentration of a sample.

Each spectrophotometer includes a light source, a collimator, which is a lens or focusing device that transmits an intense straight beam of light, a monochromator to separate the beam of light into its component wavelengths, and a wavelength selector, or slit, for selecting the desired wavelength. The wavelengths of light used in spectrophotometers discussed in this video are in the ultraviolet and visible range. The spectrophotometer also includes some sort of sample holder, a photoelectric detector, which detects the amount of photons that are absorbed, and a screen to display the output of the detector.

Newer spectrophotometers are directly coupled to a computer, where the experiment parameters can be controlled and results are displayed.

When performing spectrophotometry, be sure to take appropriate precautions, such as wearing gloves, depending on the type of biological or chemical solutions you are working with.

Before measuring the UV-visible spectrum of a sample, turn on the machine and allow the lamps and electronics to warm up.

Prepare a blank of the same solution but without the analyte, having the same pH and similar ionic strength; a necessary step as the cell and solvent can scatter some light.

Traditional spectrophotometer sample holders are designed to hold plastic and quartz cuvettes. Proceed to pipette the blank solution into the cuvette.

After wiping any fingerprints and spills off the outside of the cuvette, properly insert the cuvette in the sample holder and close the door to the cuvette compartment.

Never forget to close the door as UV radiation emitted from an open spectrophotometer can damage the eyes and skin.

Set the desired wavelength or wavelength range to be transmitted at the sample, which depends on the optimal wavelength of light that the analyte absorbs. Then, zero the instrument by taking a reading of the blank, which will subtract the background from your sample buffer.

Depending on the type of spectrophotometric experiment you are performing, it may be necessary to generate a standard curve prior to sample measurement, from which the concentration of your sample analyte can eventually be determined.

Allow the sample to reach the appropriate temperature and mix it gently, so that bubbles are not introduced. The sample can them be added directly to the cuvette, within the instrument, and a reading taken.

After performing the absorbance measurement on your sample, proceed to the appropriate calculation for your experiment; for example determination of concentration or the rate of enzyme activity.

The spectrophotometer is used on a daily basis in many biological research laboratories.

One common application of the spectrophotometer is the measurement of cell density. Cell density measurement is useful in generating logarithmic growth curves for bacteria, from which the optimal time for induction of recombinant protein can be determined.

The spectrophotometer can also be used to measure chemical reaction rates. In this example, absorbance is used to monitor an enzymatic reaction by the disappearance of a reaction intermediate at 452 nm over time. The rate of this enzymatic step can be calculated by fitting the data to the appropriate equation.

Recently, the introduction of micro-volume spectrophotometers has eliminated the necessity for sample holders. Such spectrophotometers use surface tension to hold the sample.

Micro-volume spectrophometers are optimal for measuring the quality and concentration of expensive samples of limited volume, such as biomolecules, including proteins and nucleic acids.

The absorbance of a protein at 280 nm depends on the content of aromatic side chains found in tryptophan, tyrosine, and phenylalanine, as well as the existence of cysteine-cysteine disulfide bonds.

Protein concentration can be determined from its absorbance at 280 nm and its extinction coefficient, which is based on the amino acid composition.

Both DNA and RNA have an absorbance maximum at 260 nm from which their concentration can be determined. The purity of the nucleic acid can also be assessed from the ratio of absorbance readings at specific wavelengths.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the spectrophotometer.

In this video we reviewed some basic principles, including spectrophotometry concepts and spectrophotometer components. We also demonstrated step by step operation of the spectrophotometer and discussed its usage in biological research. Thanks for watching.

Tags

Spectrophotometer Spectrophotometry Quantitative Measurement Chemical Substance Absorb Light Beam Of Light Intensity Of Light Concentration Of Solute Transmittance Absorbance Beer-Lambert Law Extinction Coefficient Path Length