Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Das Ziel des folgenden Verfahrens ist es, mittels multispektraler Abfrage von Multiplex-Zellzusammensetzungen oder Mimik die Beiträge verschiedener im Knochenmark ansässiger Populationen zur Stromaentwicklung von Tumoren zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine transgene GFP-markierte Empfängermaus mit RFP-exprimierenden Knochenmarkstammzellen transplantiert wird. Im zweiten Schritt werden die interessierenden Tumorzellen in denselben Empfänger injiziert und nach der Transplantation wird der Excise-Tumor geschnitten, in Paraffin eingebettet und mit Immunfluoreszenz-Antikörpern markiert.

Als nächstes wird eine Spektralbibliothek aller Wellenlängen erstellt, die für die Aufnahme von Bildern der Tumorschnitte verwendet werden, sobald die Spektralbibliothek fertiggestellt ist. Im letzten Schritt werden die Objektträger abgebildet, die Datenanalyse wird durchgeführt, um die Identifizierung und Assoziation der Färbemuster der interessierenden zellulären Marker zu ermöglichen. Letztendlich können neuartige zelluläre Entitäten oder Phänotypen auf der Grundlage der Multiplex-Markierung von extrazellulären und zellulären Markern identifiziert werden, um die Zusammensetzung komplexer Gewebe wie der Tumormikroumgebung besser zu verstehen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Immunfluoreszenztechniken besteht darin, dass die Multispektralanalyse es Ihnen ermöglicht, sieben oder mehr Fluor-Vierer auf demselben Objektträger zu multiplexen, was eine viel genauere und detailliertere Untersuchung der zellulären Zusammensetzung der Tumormikroumgebung oder eines regenerativen Gewebes ermöglicht. Obwohl diese Methode Aufschluss über den Ursprung und die Zusammensetzung der Mikroumgebung des Tumors geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die regenerative Medizin, die Entwicklungsbiologie und die Immunbiologie angewendet werden. Zusammen mit Dr.Spa demonstriert Chris Booth, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, dieses Verfahren. Aufgrund der IU Cook-Einschränkungen an dieser Institution werden wir direkte Mausmanipulationen an Mäusen diskutieren, aber nicht zeigen.

Diese Knochenmarkverfahren und unsere Tumortransplantationstechniken finden sich in unseren früheren Arbeiten, wie z.B. Stammzellen von Kindern und anderen. 2009 Zu Beginn nach der Isolierung der Knochenmarkzellen aus den spiegelnden Hintergliedmaßen wird die Suspension der Zellen bei 2 Millionen Zellen pro 100 Mikroliter PBS pro Maus reanimiert. Verwenden Sie eine Wärmelampe, um die Gefäße einer bestrahlten Empfänger-GFP-Maus zu erweitern, und legen Sie die Maus in eine Schwanzvenen-Injektionssicherung.

Injizieren Sie die Zellsuspensionen mit einer 29-Gauge-Nadel mit der schrägen Seite nach oben systemisch in die Schwanzvene oder retroorbitale Vene. Verwenden Sie sterile Gaze, um nach der Injektion leichten Druck auf den Schwanz auszuüben. Injizieren Sie einer Maus 100 Mikroliter PBS nur als Transplantationskontrolle am Tag der Injektion.

Suspendieren Sie die Tumorzellen, die an PBS interessiert sind, bei 1 Million Zellen pro 100 Mikroliter. Nach der Sterilisation des Bauches mit 70%Ethanol. Halten Sie die Maus mit einer Hand am Nacken und am Schwanz fest, halten Sie dann mit der anderen Hand die Nadel mit der schrägen Seite nach oben und injizieren Sie die Tumorzellen in die Interperitonealhöhle der Empfängermaus.

Nach 15 bis 30 Tagen euthanasieren Sie die Mäuse und entfernen den Tumor aus dem Bauch. Fixieren Sie dann die Tumore in 10%Formin für 24 Stunden. Schneiden Sie dann das fixierte Gewebe in fünf bis 10 Mikrometer große Scheiben für die nachfolgenden Färbevorgänge.

Nachdem Sie die Gewebeschnitte in Paraffin fixiert haben, backen Sie die Proben eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Objektträger in der folgenden Reihenfolge: Spülen Sie die Objektträger nach der letzten Ethanolwäsche zwei Minuten lang mit Wasser ab. Langsames Eintauchen und Anheben des Färbegestells 10 Mal in und aus dem Wasser.

Geben Sie als nächstes Natriumcitratpuffer zum Erhitzen in die Mikrowelle. Nachdem Sie die Objektträger 20 Minuten lang in Natriumcitratpuffer gekocht haben, lassen Sie die Proben 30 Minuten lang im Puffer abkühlen. Dann weitere fünf Minuten mit dem ionisierten Wasser waschen.

Klopfen Sie dann den Objektträger ab, damit große Wassertropfen abperlen können, achten Sie darauf, dass der Gewebeschnitt nicht austrocknet. Markieren Sie mit einem hydrophoben Barrierestift die Schnitte um die Tumorschnitte herum und platzieren Sie dann sofort einen Blockierungspuffer auf der Probe, um ein Austrocknen des Gewebeabschnitts zu verhindern. Nach einer Stunde inkubieren Sie die Objektträger mit dem primären Antikörper von Interesse in einer Feuchtigkeitskammerbox auf einem langsam rotierenden Schüttler bei vier Grad über Nacht.

Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen zweimal für jeweils 10 Minuten in PBST unter leichtem Schütteln, während die Abschnitte gewaschen werden. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper mit einem Verhältnis von 1 zu 1000 Antikörper zu Blockpuffer. Anschließend inkubieren Sie die Abschnitte in den entsprechenden Sekundärantikörpern in der mit Alufolie abgedeckten Feuchtigkeitskammerbox auf einem langsam rotierenden Schüttler bei Raumtemperatur Nach zwei Stunden.

Waschen Sie die Objektträger zweimal fünf Minuten lang in PBST unter leichtem Schütteln und schützen Sie sie vor Licht. Färben Sie dann den Nur-Dumping-Objektträger und die Analyse-Objektträger eine Minute lang mit DPI und halten Sie die Objektträger während der Inkubation bedeckt. Legen Sie einen Deckglas über jede Probe und versiegeln Sie die Ränder jedes Deckglases mit Nagelhärter.

Um nun die multispektrale Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie ein Ölobjektiv, um ein erstes Bild des Analyseobjektträgers aufzunehmen und so die richtigen Belichtungszeiten für jeden der Spektralbereiche in der Spektralbibliothek zu erhalten. In dieser Tabelle werden beispielsweise Spektralbibliotheksprotokolle vorgeschlagen, die auf der Anzahl der im Experiment verwendeten Etagenvierer basieren. Stellen Sie dann den ungefärbten Objektträger für den Hintergrunddia in der Spektralbibliothek für dieses Experiment dar.

Nächstes Bild, die ungefärbte Folie, um das Hintergrundbild für die Spektralbibliothek zu erhalten. Bilden Sie nun für jede Kontrolle vier gefärbte Objektträger auf einer einzelnen Etage ab und speichern Sie die Bilder unter dem Namen des sekundären Antikörpers, der für jeden Objektträger verwendet wird. Sobald die verdächtige Bibliothek fertiggestellt ist, sammeln Sie Bilder der interessierenden Regionen auf dem Analyseträger, um Bilder des Tumorgewebes zu analysieren.

Importieren Sie zunächst eine repräsentative Auswahl der erfassten Nuancenbilder mit der Inform-Software. Öffnen Sie dann die sichere Spektralbibliothek, wie vom Programm angewiesen. Identifizieren Sie als Nächstes die zu analysierenden Geweberegionen.

Identifizieren Sie einzelne Zellen anhand der DAPI-Färbung. Das Zytoplasma wird automatisch anhand der Form des Zellkerns identifiziert. Wählen Sie nun für jeden Fluoreszenzparameter die gewünschte Fluoreszenzintensitätsanzeige aus und gleichen Sie dann die erfassten Bilder ab, sodass die Software die Daten mit dem vorgeschlagenen Algorithmus verarbeiten kann.

Wenn die Bildverarbeitung abgeschlossen ist, führen Sie die resultierenden Dateien zusammen. Als nächstes wurden unter Verwendung dieser multispektralen Bildgebungstechnik zur Analyse und grafischen Darstellung von Tumoren in diesem transgenen Knochenmarktransplantations-Mausmodell stromale Tumorkomponenten, die aus dem Knochenmark stammen, drei Wochen nach der Knochenmarktransplantation durch Durchflusszytometrie bestimmt. Sechs Wochen nach der ersten Injektion wurden dann Schnitte von den unmarkierten injizierten Ovarialtumoren analysiert, nachdem eine Spektralbibliothek mit einfarbigen Kontrollobjektträgern, Bildern des mit GFP DPI gefärbten Ovarialtumorabschnitts und zwei weiteren Markern analysiert worden waren.

Das Hinzufügen von weiteren Markern ist möglich. Hier werden beispielsweise die Spektralbibliothek und das dazugehörige Bild eines Tumorschnitts mit sechs Markern plus einer Kernfärbung mit der informierten Software dargestellt. Die Geweberegionen, die innerhalb des Tumorschnitts von Interesse sind, sind klassifizierbar, wie in den hier gezeigten repräsentativen Bildern zu sehen ist.

Dieses Bild zeigt zum Beispiel die Klassifizierung von Gewebesegmenten, gefolgt von der Segmentierung der Zellen. Basierend auf dem nuklearen Farbstoff dpi. Die Quantifizierung der Fluoreszenzmarkierungen kann dann im Zellkern und im Zytoplasma jeder Zelle gemessen und zur weiteren Analyse exportiert werden.

Der Gewebesegmentierungsalgorithmus ist in der Lage, Gewebesubtypen basierend auf der Gewebearchitektur und nicht nur auf der Fluorochrom-Identifizierung weiter zu identifizieren, und bietet ein robusteres Analysewerkzeug zur Klassifizierung der Färbung in verschiedene Geweberegionen. In diesem Bild wurde der Computer darauf trainiert, fünf Unterregionen anhand der architektonischen Muster innerhalb des Gewebes zu identifizieren. Der Hintergrund wird durch Leerzeichen definiert.

Der hämolytische Tumor wird durch die Häufigkeit der roten Blutkörperchen im Gewebe definiert. Der Tumor wird durch die dicht besiedelten Zellen definiert. Das Fett wird durch die großen symmetrischen leeren Zellkompartimente und die Muskeln durch ein quergestreiftes Muster definiert.

Mit dieser Methode kann eine doppelt positive Zellpopulation anhand einer bestimmten Fluoreszenzintensitätsschwelle analysiert werden. Für GFP-positive und Alpha-Aktin-positive Zellen der glatten Muskulatur, wie hier gezeigt, für eine zusätzliche spektrale Detektion über vier Farben hinaus, lesen Sie bitte die verlinkten Tipps und Tricks für das Multiplexing von fünf oder mehr Sonden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der Bilder in hohem Maße von den richtigen einfarbigen Kontrollfolien abhängt, die verwendet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. zelluläre Kompartimente und Tumormikroumgebungsgewebe zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für unsere Mimiktechnik, die multispektrale Abfrage von mehrzelligen Komponenten, haben, und wenn Sie dies abschließen, sollten Sie ein gründliches Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere zelluläre Ziele auf einer Folie identifizieren können. Wie man diese zellulären Ziele mit Unix zusammenzählt und ein gutes Verständnis für die Evolution des Tumorstromas oder des regenerativen Gewebes oder des für Sie interessanten Gewebes hat.