Isolation, Verarbeitung und Analyse von Murine Gingivazellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das mirin Zahnfleisch präzise zu isolieren und aufzubereiten, um anschließend eine Durchflusszytometrie-Analyse durchführen zu können. Dies wird erreicht, indem das Zahnfleisch zunächst chirurgisch sorgfältig isoliert wird. Anschließend wird das entfernte Gewebe aufgearbeitet, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.

Anschließend erfolgen die extrazelluläre und intrazelluläre Färbung mit Antikörpern. Schließlich wird die Probe mittels Durchflusszytometrie analysiert. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die unterschiedliche Zellpopulationen im Zahnfleisch sowie zelluläre Veränderungen im Gewebe nach Exposition gegenüber einer immunologischen Noxe durch die Analyse mittels Durchflusszytometrie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie der OC-Chemie oder der Mono-Fluoreszenz besteht darin, dass sie eine schnelle und einfache Methode zur Analyse einer großen Anzahl von Zellen darstellt, die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Variablen ermöglicht und zudem die Sortierung verschiedener Zelltypen für weitere Experimente erlaubt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise, wie Mikroorganismen die Gingiva-Homöostase beeinflussen und welchen Zusammenhang dies mit entzündungsbedingtem Knochenverlust in einem experimentellen Modell der Parodontitis aufweist. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir begannen, die Rolle der RI-Zellen während der Parodontitis zu untersuchen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die GVA-Beschleunigungstechnik aufgrund der geringen Größe und des relativ schwierigen Zugangs zum MU-one-J-GVA schwer zu erlernen ist.

Zur Vorbereitung bereiten Sie Medienlösungen und sterilisierte chirurgische Instrumente gemäß dem Textprotokoll vor. Nach der Tötung einer Maus gemäß den von Ihrem institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Methoden schneiden Sie mit scharfen, geraden stumpfen Scheren beide Seiten der Mundhöhle, einschließlich der Wangen und des Mandibularamus, auf und ziehen Sie den Unterkiefer herunter, wobei Sie die Standardschere senkrecht zur Ebene des Gaumenbeins ausrichten. Durchtrennen Sie das Weich- und Hartgewebe entlang einer gedachten Linie, die einen Millimeter hinter den dritten Molaren verläuft.

Als Nächstes einen Schnitt in das Weich- und Hartgewebe zwei Millimeter hinter den Schneidezähnen anlegen. Danach den vorderen Teil des Mundes mit der Schere parallel zum Gaumen nach unten ziehen, um die Nasenhöhle freizulegen. Eine Scherenklinge in die Nasenhöhle einführen und die andere verwenden, um am Vestibulum einen Schnitt bis zum hinteren Schnitt anzulegen.

Wiederholen Sie den Einschnitt auf der anderen Seite des Oberkiefers, um diesen vom Schädel zu lösen. Schneiden Sie anschließend die Mitte durch und entfernen Sie das Gaumengewebe von jedem Hemi-Oberkiefer, um mithilfe von Abs und einer Pinzette zum Alveolarknochen vorzudringen. Lösen Sie das Zahnfleischgewebe vom vorderen Rand ab und geben Sie es in eine Platte mit PBS und 2 % Fetalcalbserum oder FCS, um das Zahnfleisch zu verarbeiten. Überführen Sie es danach in eine Kulturschale mit einem Milliliter PBS, zwei Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ zwei und einem Milligramm pro Milliliter DNase.

Typisieren Sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge Nummer 15. Vermahlen Sie das Gewebe gründlich, bevor Sie es in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Spülen Sie alle verbleibenden Gewebezellen mit einem Milliliter P-B-S-F-C-S von der Platte ab und überführen Sie sie in das Gefäß.

Incubieren Sie das Gewebe 20 Minuten lang in einem vorgewärmten Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und 200 U/min. Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter 0,5-molarer EDTA hinzu und inkubieren Sie weitere 10 Minuten. Danach geben Sie PBS-FCS bis auf ein Gesamtvolumen von 12 Millilitern hinzu und zentrifugieren die Probe bei vier Grad Celsius, 400 × g, über einen Zeitraum von acht Minuten.

Nach dem Entfernen des Überstandes die Zellen in zwei Milliliter P-B-S-F-C-S resuspendieren. Die Probe nach einer Zentrifugation bei vier Grad Celsius und 320 × g über fünf Minuten durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb filtern. Die Zellen in 300 Mikrolitern P-B-S-F-C-S resuspendieren.

Schließlich zählen Sie die Zellen, wobei Sie unter einer Haube bei gekühlter Temperatur und ausgeschaltetem Licht arbeiten, in einem Gesamtvolumen von 100 µL; geben Sie 0,2 bis 0,5 µg jedes ausgewählten Antikörpers pro 1 × 10⁶ Zellen hinzu und wirbeln kurz um. Nach einer 15-minütigen Inkubation der Proben bei vier Grad Celsius im Dunkeln geben Sie zwei Milliliter P-B-S-F-C-S hinzu und zentrifugieren bei 320 × g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang. Zum Fixieren der Zellen saugen Sie das Überstandmedium ab und suspendieren sie, unter Wirbeln, durch tropfenweises Hinzufügen von 500 µL kalter BD Cyto-Perm-Lösung.

Zytotoxische Effekte: Inkubieren Sie die Röhrchen nach der Inkubation mit Vortexmischung 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Geben Sie anschließend kurzzeitig ein Milliliter BD Perm Wash-Puffer zu und zentrifugieren Sie sieben Minuten lang bei 800 × g und vier Grad Celsius. Wiederholen Sie den Waschschritt und aspirieren Sie anschließend alles bis auf 300 Mikroliter des Waschpuffers.

Anschließend zur intrazellulären Färbung in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern je ein Mikrogramm der ausgewählten Antikörper pro 1 × 10⁶ Zellen hinzufügen. Kurz vortexen und 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Nach zweimaligem Waschen der Zellen wie zuvor und vollständigem Entfernen des Überstandes die Zellen in 300 Mikrolitern frischem kalten BD Perm-Wash-Puffer resuspendieren.

Nach einem kurzen Vortexvorgang die Suspension in Fax-Röhrchen filtrieren. Die Röhrchen bis zur Durchführung der Fax-Analyse im Dunkeln auf Eis oder im Kühlschrank aufbewahren. Gingivazellen, gepoolt aus zwei naiven Mäusen.

Wurden an einem LSR-II-Flusszytometer durchgeführt und mit der FlowJo-Software analysiert. Die hier gezeigten Seitenstreuungs- und Vorwärtstreuungsdiagramme veranschaulichen die Verteilung der Zellen. Die Gating-Strategie zur Identifizierung von Lymphozyten, Monozyten, dendritischen Zellen und Granulozyten ist zu Vergleichszwecken angegeben.

Diese Abbildung zeigt ein FACS-Diagramm, das Zahnfleischzellen darstellt, die 21 Tage nach oraler Gabe aus Mäusen isoliert wurden, die mit P. gingivalis infiziert waren, im Kontext einer experimentellen Parodontitis. Ein Anstieg der verschiedenen Immunzellpopulationen ist bei den infizierten Mäusen im Vergleich zu den hier gezeigten naiven Mäusen leicht erkennbar. Immunzellen im aufbereiteten Zahnfleisch werden durch Gating von Zellen identifiziert, die den hämatopoetischen Marker CD45 exprimieren.

Diese Zellen wurden weiter in CD3-positive T-Zellen unterteilt, die in dieser Abbildung dargestellt sind. Neutrophile wurden ebenfalls basierend auf der Expression der Moleküle LY6G und CD11b identifiziert. Schließlich wurden Langerhans-Zellen und die epitheliale Teilmenge dendritischer Zellen durch Gating auf MHC-Klasse-II-positive, CD11c-positive Zellen sowie durch die Expression von EpCAM und CD207 identifiziert. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in drei Stunden und dreißig Minuten bis fünf Stunden durchgeführt werden.

Andere Methoden wie die Echtzeit-PCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Genexpression einzelner Zellen nach ihrer Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, die lokale Reaktion in der gingivovaskulären Einheit (GVA) gegen jegliche Noxen im Bereich der parodontalen Forschung zu untersuchen. Mithilfe dieser Technik konnten wir die Rolle immunologischer und nicht-immunologischer Zellen der GVA bei der Pathogenese der experimentellen Parodontitis aufklären.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Harn-GVA isoliert und verarbeitet, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, die anschließend einer extrazellulären und intrazellulären Vir-Färbung für die Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen wird.