Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Typ-1-Diabetes bei Mäusen schnell zu induzieren, indem diabetogene T-Zellen von transgenen Mäusen auf Mäuse übertragen werden, denen endogene T- und B-Zellen fehlen. Beginnen Sie mit der Entnahme der Milz und der Lymphknoten von den Spendermäusen und reinigen Sie die vier positiven T-Zellen der Zöliakie. Als nächstes übertragen Sie die gereinigten Spender-T-Zellen in nicht rutschfeste Empfängermäuse.

Überwachen Sie dann die Empfängermäuse auf die Entwicklung von Typ-1-Diabetes. Letztendlich kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Pathogenese von Diabetes zu untersuchen und therapeutische Interventionen im Vergleich zu anderen Methoden zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik der Übertragung von BDC 2.5, CD vier positiven T-Zellen in nicht rutschfeste Empfänger ist die schnelle und reproduzierbare Entwicklung von Typ-1-Diabetes.

Für Spender der diabetogenen CD verwenden vier positive T-Zellen sechs Wochen alte prädiabetische weibliche BDC 2,5-Mäuse, die durch Uringlukosemessung als diabetesfrei bestimmt wurden. Um die Milz und die Lymphknoten zu entfernen, tränken Sie das Fell mit 70% Ethanol, schneiden Sie dann die Haut und ziehen Sie die Haut zurück, bis die Muskeln der vorderen Gliedmaßen freiliegen. In der Nähe der Basis der vorderen Gliedmaßen sollten zwei Lymphknoten auf jeder Seite sichtbar sein. Fassen Sie jeden Lymphknoten vorsichtig mit einer kleinen Pinzette an und entfernen Sie ihn, indem Sie das Bindegewebe kürzen.

Machen Sie als Nächstes mit der kleinen Schere einen Einschnitt von einem Zoll in das Bauchfell. Fasse nun sanft die Milz in der Mitte. Schneiden Sie das Bindegewebe und das anhaftende Fett vorsichtig ab.

Entfernen Sie dann die Milz, die Spitze, die Milz und die Lymphknoten in 10 Millilitern DMEM auf Eis. Drücken Sie mit dem Ende eines sterilen 10-Milliliter-Spritzenkolbens die lymphatischen Organe vorsichtig durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb. Zur Gewinnung einer einzelligen Suspension.

Spülen Sie jedes Sieb mehrmals mit einem Milliliter DMEM, um die Regeneration der Zellen zu maximieren. Dann werden die gesammelten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gegeben und sieben Minuten lang bei 400 g zentrifugiert. Bei Raumtemperatur wird das Zellpellet in drei Millilitern eines CK-Puffers wieder suspendiert.

Inkubieren Sie nun bei jeder Raumtemperatur fünf Minuten lang. Um die roten Blutkörperchen zu laugen, fügen Sie nun 12 Milliliter DMEM hinzu und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Zellpellet einmal in 10 Millilitern DMEM.

Als nächstes suspendieren wir die Zellen in fünf Millilitern Faktenfärbepuffer und verwenden ein Phasenkontrastmikroskop und ein Hämozytometer, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen zu zählen. Entfernen Sie nun etwa einmal 10 der sechs Zellen pro Färbekontrolle. Färben Sie die Zellen auch mit monoklonalen Maus-Antikörpern, um nach nicht aktivierten transgenen Zöliakie-4-positiven T-Zellen zu sortieren.

Inkubieren Sie alle diese Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Waschen Sie nun die Zellen mit dem dreifachen Färbevolumen des Faxpuffers und resuspendieren Sie die Zellen im Faxpuffer ein- bis zweimal 10 auf die sieben Zellen pro Milliliter für die Sortierung der Probe und 300 Mikroliter für die Einzelfärbekontrolle. Führen Sie anschließend die Zellprobe durch ein 35-Mikrometer-Zellensiebkappenröhrchen.

Um Zellklumpen zu entfernen, verarbeiten Sie die Proben für einen Zellsortierer mit einem geschulten Bediener Warten Sie etwa drei Stunden, einschließlich Einrichtungszeit, um etwa 1,5 mal 10 bis zum Achtel zu sortieren Transgene naive CD vier positive T-Zellen. Sie können etwa 2,5 mal 10 der sechs Zellen pro Maus erwarten, und die Sortierrate wird auf einem Instrument wie der BD Fox Aria etwa doppelt so hoch sein wie 10 der vierten Ereignisse pro Sekunde. Sammeln Sie die sortierten Zellen in drei Milliliter DMEM.

Notieren Sie die absolute Anzahl der sortierten Zellen und zentrifugieren Sie sie sieben Minuten lang. Bei 400 g suspendieren wir die Zellpellets in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung für den adoptiven T-Zelltransfer. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze in einer 18-Gauge-Nadel und resuspendieren Sie vorsichtig die vier positiven T-Zellen der faxgereinigten CD.

Laden Sie die Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie dann zur Vorbereitung der Injektion eine 27-Punkt-Nadel mit halber Gauge an der Spritze. Halten Sie die Empfängermäuse fest und wischen Sie ihren Schwanz mit 70%igem Ethanol ab, um die Injektionsstelle zu desinfizieren. Injizieren Sie dann einmal das 10. der sechs gereinigten CD vier positive T-Zellen pro Maus in eine der seitlichen Schwanzvenen.

Wenn Sie Ihre Schwanzveneninjektionen durchführen, achten Sie darauf, dass Sie den Kolben nicht mit Gewalt drücken. Wenn sich die Nadel tatsächlich in der Vene befindet, sollte Ihre Injektion fast ohne Widerstand erfolgen. Beginnend fünf Tage nach dem T-Zell-Transfer. Überwachen Sie die Nod-Skid-Empfängermäuse täglich auf die Entwicklung von Typ-1-Diabetes.

Messen Sie die Glukose im Urin mit Reagenzstreifen gemäß den Herstellern und Anweisungen. Beachten Sie, dass Mäuse mit zwei aufeinanderfolgenden Uringlukosewerten von mehr als 250 Milligramm pro Deziliter als Diabetiker gelten. In einem typischen Experiment liefert jede BDC 2,5-Spendermaus etwa zweieinhalb mal 10 der sechs naiven transgenen CD vier positive T-Zellen nach Zellsortierung nach adoptivem Transfer von diabetogenen CD vier positive T-Zellen, die Mäuse wurden auf Glukosekonzentrationen im Urin überwacht.

Der adoptive Transfer einer kleinen Anzahl von Zellen von BDC 2,5-Spendermäusen induzierte Typ-1-Diabetes bei allen Nicht-Skid-Empfängern bis zum Tag 11. Wenn diese Technik richtig durchgeführt wird, kann sie in etwa acht Stunden von der Organentnahme bis zum T-Zell-Transfer durchgeführt werden.